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Kann die Proteinstruktur durch Röntgenbeugung in einem einzigen Bild bestimmt werden?


Ich lese über die Verwendung von Röntgenkristallographie zur Bestimmung der Proteinstruktur. Laut meinem Buch werden Daten bei 30-360 Winkeln gesammelt (abhängig von der Symmetrie des Proteins). Eine Darstellung erfolgt mit konzentrischen Ringen, die mit Abständen beschriftet sind – je weiter die Punkte entfernt sind, desto höher ist die Auflösung.

Handelt es sich bei dem Bild um ein zusammengesetztes Bild (wobei der Winkel des Punktpunktes von der Mitte dem Winkel der Ablesung entspricht) oder wird in jedem Winkel ein separates Bild aufgenommen? Gibt es noch andere Gründe, warum mehr Bilder benötigt werden?

Vielen Dank.


Selbst mit perfekter Beugung kann man eine Struktur nicht mit einem einzigen Bild auflösen.

Der Grund, warum Sie Bilder über einen großen Winkelbereich benötigen, liegt darin, dass das Beugungsmuster auch in drei Dimensionen liegt, im sogenannten "reziproken Raum". Um die gesamte reziproke Raumkugel mit der Detektionsebene zu überstreichen, ist mindestens eine 180°-Drehung des Kristalls erforderlich, obwohl die Symmetrie in der Kristallstruktur dies weiter reduzieren kann (einige meiner Proteine ​​​​benötigen nur 90°, ich denke, hexagonale Elementarzellen mit 6-facher Symmetrie kann mit 30° leben). Da Kristalle echte Dinge sind (sprich: nicht ideal, doppelt so für Proteinkristalle), wird der Sweep erweitert, um eine gewisse Redundanz zu erzielen.


Wahrscheinlich nicht. Obwohl man von einem hochwertigen Kristall ausgezeichnete Beugungsdaten erhalten kann, wäre es extrem schwierig, das Phasenproblem zu lösen. Die zusätzlichen Winkel helfen, die Lösungen einzuschränken.


Nicht durch die Analyse eines einzelnen Proteins. Es wird mit Röntgenlasern gearbeitet.

Sie müssen ein simultanes Bild von Millionen von Proteinen aufnehmen und dieses verwenden, um eine Struktur zu erhalten. Es ist nicht gerade Primetime. Das macht man auch mit Elektronenstrahlen in Elektronenmikroskopen.

Diese Methoden werden 3D-Modelle der Moleküle rekonstruieren, manchmal in Zuständen, die durch die Kristallographie nicht erhalten werden können. Beispiele sind die Struktur des nuklearen Porenkomplexes mit vielen Megadalton und die f-Aktin-Faser. Die klassische Studie ist ein 3D-Modell von Bakteriorhodopsin, der ersten Membranproteinstruktur mit molekularer Auflösung (dies war jedoch eine kristalline Probe).

Obwohl es im Prinzip viel einfacher klingt - nehmen Sie eine reine Probe Ihres Proteins oder komplexieren Sie es und frieren Sie es ein und zappen Sie es mit einem Röntgen- oder Elektronenstrahl, aber es ist viel mehr Arbeit, das Bild zu rekonstruieren und kann so lange oder länger dauern als eine Röntgenstruktur erhalten. Die Auflösung ist normalerweise auch schlecht, da der Kristall die Kohärenz verstärkt, dh alle Proteine ​​sind auf die gleiche Weise ausgerichtet und haben in einem Kristall fast die gleiche 3D-Form.


Kann die Proteinstruktur durch Röntgenbeugung in einem einzigen Bild bestimmt werden?

Jawohl. Mit einer Technik namens Laue-Beugung ist es möglich, ausreichende Daten aus einem einzelnen Bild zu erhalten, um eine Proteinkristallstruktur zu lösen. Ein Beispiel ist die zeitaufgelöste Untersuchung der Dissoziation von Kohlenmonoxymyoglobin durch Photolyse (DOI: 10.1107/S090904959501661X). Dies ist nicht die Standard-Einzelwellenlängen-Technik, die normalerweise verwendet wird, sondern verwendet "weiße" Röntgenstrahlen mit einem Wellenlängenbereich, der nur bei Synchrotronstrahlen verfügbar ist. Beispielsweise bietet die Benutzereinrichtung von BioCARS eine Infrastruktur für die zeitaufgelöste Kristallographie. Es wird auch in "Beugung vor Zerstörung" bei der Arbeit mit Freie-Elektronen-Lasern verwendet, siehe beispielsweise Nature Methods 8, Seite 283 (2011).

Der Rest der Antwort betrifft die konventionelle Einwellenlängen-Kristallographie.

Ist das Bild ein zusammengesetztes Bild (wobei der Winkel des Punktpunktes von der Mitte dem Winkel der Ablesung entspricht) oder handelt es sich um ein separates Bild, das in jedem Winkel aufgenommen wurde

Die gewünschte Strukturinformation (3D-Elektronendichte im Realraum) ist eine Fourier-Transformation der Beugungsdaten (3D-reziproker Raum). Das Wort "Bild" ist ein Jargon für ein einzelnes Beugungsbild, d. h. die Beugungsflecken, die Sie beobachten, wenn Sie einen Röntgenstrahl in einer bestimmten Ausrichtung auf einen Kristall richten. Mit einer anderen Ausrichtung erhalten Sie mehr Daten (und messen einige Punkte auch mehrmals).

Gibt es noch andere Gründe, warum mehr Bilder benötigt werden?

Je mehr Beugungsbilder gesammelt werden, desto höher ist die Vollständigkeit und Redundanz der Daten. Vollständigkeit bezieht sich darauf, jeden Beugungsfleck mindestens einmal gemessen zu haben. Redundanz bezieht sich darauf, wie oft ein Spot im Durchschnitt gemessen wurde, und eine zunehmende Redundanz erhöht die Qualität der Messung durch Mittelwertbildung.


Kann die Proteinstruktur durch Röntgenbeugung in einem einzigen Bild bestimmt werden? - Biologie

Momentaufnahme experimenteller Daten

wwPDB-Validierung   3D-Bericht Vollständiger Bericht

Die erste Proteinkristallstruktur, die aus hochauflösenden Röntgenpulverdiffraktionsdaten bestimmt wurde: eine durch Mahlen hergestellte Variante des humanen Insulin-Zink-Komplexes T3R3.

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  • Primärzitate verwandter Strukturen:  
    1FU2, 1FUB
  • PubMed-Abstract: 

Die Röntgenbeugungsanalyse der Proteinstruktur wird oft durch die Verfügbarkeit geeigneter Kristalle eingeschränkt. Das Fehlen von Einkristallen muss jedoch in der Proteinkristallographie ebensowenig ein unüberwindliches Hindernis darstellen wie in der Materialwissenschaft, wo sich Pulverbeugungstechniken so weit entwickelt haben, dass komplexe Oxid-, Zeolith- und kleine organische Molekülstrukturen oft aus Pulvern gelöst werden können Daten allein.

Die Röntgenbeugungsanalyse der Proteinstruktur wird oft durch die Verfügbarkeit geeigneter Kristalle eingeschränkt. Das Fehlen von Einkristallen muss jedoch in der Proteinkristallographie ebensowenig ein unüberwindbares Hindernis darstellen wie in der Materialwissenschaft, wo sich Pulverbeugungstechniken so weit entwickelt haben, dass komplexe Oxid-, Zeolith- und kleine organische Molekülstrukturen oft aus Pulvern gelöst werden können Daten allein. Dies wird hier mit der Strukturlösung und Verfeinerung einer neuen Variante des T(3)R(3) Zn-Humaninsulin-Komplexes, hergestellt durch mechanisches Mahlen einer polykristallinen Probe, demonstriert. Hochauflösende Synchrotron-Röntgenpulverbeugungsdaten wurden verwendet, um diese Kristallstruktur durch molekularen Ersatz, der für die Rietveld-Verfeinerung angepasst ist, zu lösen. Eine vollständige Rietveld-Verfeinerung des 1630-Atom-Proteins wurde durch die Kombination von 7981 stereochemischen Beschränkungen mit einem 4800-stufigen (d(min) = 3,24 A) Pulverbeugungsmuster erreicht und ergab die Residuen R(wp) = 3,73%, R(p) = 2,84 %, R(F)(2) = 8,25 %. Es wurde festgestellt, dass die durch Schleifen induzierte Phasenänderung von Drehungen der beiden T(3)R(3)-Komplexe, die die Kristallstruktur bilden, um 9,5 und 17,2 Grad begleitet wird. Das Material kehrt über 2-3 d zurück, um die ursprüngliche T(3)R(3)-Kristallstruktur wiederherzustellen. Eine Rietveld-Verfeinerung dieses 815-Atom-Proteins durch Kombination von 3886 stereochemischen Beschränkungen mit einem 6000-stufigen (d(min) = 3,06 A) Pulverbeugungsmuster ergab die Residuen R(wp) = 3,46%, R(p) = 2,64%, R(F)(2) = 7,10%. Die nachgewiesene Fähigkeit, eine Proteinkristallstruktur aus Pulverbeugungsdaten zu lösen und zu verfeinern, legt nahe, dass dieser Ansatz beispielsweise zur Untersuchung von Strukturänderungen in einer Reihe von Proteinderivaten verwendet werden kann, in denen die Struktur eines Mitglieds aus einem Einkristall bekannt ist lernen.


Originaler Forschungsartikel

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  • 6 Abteilung für Strukturbiologie, Wellcome Center for Human Genetics, University of Oxford, Oxford, Vereinigtes Königreich
  • 7 Department of Structural Biology, University of Pittsburgh School of Medicine, Pittsburgh, PA, USA

MicroED hat sich in letzter Zeit als leistungsfähige Methode zur Analyse biologischer Strukturen mit atomarer Auflösung herausgestellt. Diese Technik war weitgehend auf Proteinnanokristalle beschränkt, die entweder als Nadeln oder Platten mit einer Dicke von nur wenigen hundert Nanometern wachsen. Darüber hinaus verwendet die traditionelle microED-Datenverarbeitung etablierte Röntgenkristallographie-Software, die nicht für die Handhabung von Verbindungseffekten optimiert ist, die für Elektronenbeugungsdaten einzigartig sind. Hier präsentieren wir einen integrierten Workflow für microED, von der Probenvorbereitung durch kryo-fokussiertes Ionenstrahlfräsen über die Datenerfassung mit einem Standard-Ceta-D-Detektor bis hin zur Datenverarbeitung mit der DIALS-Softwaresuite, die eine routinemäßige Atomstrukturbestimmung von Proteinkristallen ermöglicht jeder Größe und Form mit microED. Wir demonstrieren die Effektivität des Workflows, indem wir die Struktur von Proteinase K mit einer Auflösung von 2.0 Å bestimmen und zeigen den Vorteil der Verwendung von Proteinkristalllamellen gegenüber Nanokristallen.


Die Form eines Proteins wird durch seine Aminosäuresequenz bestimmt

Erinnern Sie sich an Kapitel 2, dass es 20 Arten von Aminosäuren in Proteinen gibt, jede mit unterschiedlichen chemischen Eigenschaften. Ein Proteinmolekül besteht aus einer langen Kette dieser Aminosäuren, die jeweils über eine kovalente Peptidbindung mit ihrem Nachbarn verbunden sind (Abbildung 3-1). Proteine ​​werden daher auch als Polypeptide. Jede Proteinart hat eine einzigartige Sequenz von Aminosäuren, die von einem Molekül zum nächsten genau gleich ist. Viele tausend verschiedene Proteine ​​sind bekannt, jedes mit seiner eigenen speziellen Aminosäuresequenz.

Abbildung 3-1

Eine Peptidbindung. Diese kovalente Bindung entsteht, wenn das Kohlenstoffatom aus der Carboxylgruppe einer Aminosäure Elektronen mit dem Stickstoffatom teilt (Blau) aus der Aminogruppe einer zweiten Aminosäure. Wie angegeben, geht bei dieser Kondensation ein Wassermolekül verloren (mehr. )

Die sich wiederholende Sequenz von Atomen entlang des Kerns der Polypeptidkette wird als Polypeptidrückgrat bezeichnet. An diese sich wiederholende Kette hängen die Teile der Aminosäuren, die nicht an der Herstellung einer Peptidbindung beteiligt sind und jeder Aminosäure ihre einzigartigen Eigenschaften verleihen: die 20 verschiedenen Aminosäureseitenketten (Abbildung 3-2). Einige dieser Seitenketten sind unpolar und hydrophob (“wasserangst”), andere sind negativ oder positiv geladen, einige sind reaktiv und so weiter. Ihre atomaren Strukturen sind in Tafel 3-1 dargestellt, und eine kurze Liste mit Abkürzungen ist in Abbildung 3-3 enthalten.

Abbildung 3-2

Die strukturellen Bestandteile eines Proteins. Ein Protein besteht aus einem Polypeptid-Rückgrat mit angehängten Seitenketten. Jede Proteinart unterscheidet sich in ihrer Sequenz und Anzahl der Aminosäuren daher ist es die Abfolge der chemisch unterschiedlichen Seitenketten (mehr.)

Panel 3-1

Die 20 Aminosäuren in Proteinen.

Abbildung 3-3

Die 20 Aminosäuren in Proteinen. Es werden sowohl dreibuchstabige als auch einbuchstabige Abkürzungen aufgeführt. Wie gezeigt, gibt es gleich viele polare und unpolare Seitenketten. Zu ihren atomaren Strukturen siehe Tafel 3-1 (S. 132�).

Wie in Kapitel 2 besprochen, verhalten sich Atome fast so, als wären sie harte Kugeln mit einem bestimmten Radius (ihr van der Waals-Radius). Die Forderung, dass sich keine zwei Atome überlappen, schränkt die möglichen Bindungswinkel in einer Polypeptidkette stark ein (Abbildung 3-4). Diese Einschränkung und andere sterische Wechselwirkungen schränken die Vielfalt der dreidimensionalen Anordnungen von Atomen (oder Konformationen) das sind möglich. Trotzdem kann sich eine lange flexible Kette, wie zum Beispiel ein Protein, immer noch auf enorm viele Arten falten.

Abbildung 3-4

Sterische Beschränkungen der Bindungswinkel in einer Polypeptidkette. (A) Jede Aminosäure trägt drei Bindungen bei (rot) zum Rückgrat der Kette. Die Peptidbindung ist planar (graue Schattierung) und lässt keine Drehung zu. Im Gegensatz dazu kann eine Drehung um (mehr.)

Die Faltung einer Proteinkette wird jedoch durch viele verschiedene Gruppen von schwachen nichtkovalente Bindungen die sich zwischen einem Teil der Kette und einem anderen bilden. Dabei handelt es sich um Atome im Polypeptidrückgrat sowie um Atome in den Aminosäureseitenketten. Es gibt drei Arten von schwachen Bindungen: Wasserstoffbrücken, ionische Bindungen, und Sehenswürdigkeiten von van der Waals, wie in Kapitel 2 erläutert (siehe S. 57). Einzelne nichtkovalente Bindungen sind 30� mal schwächer als die typischen kovalenten Bindungen, die biologische Moleküle erzeugen. Aber viele schwache Bindungen können parallel agieren, um zwei Regionen einer Polypeptidkette fest zusammenzuhalten. Die Stabilität jeder gefalteten Form wird daher durch die kombinierte Stärke einer großen Anzahl solcher nichtkovalenter Bindungen bestimmt (Abbildung 3-5).

Abbildung 3-5

Drei Arten von nichtkovalenten Bindungen, die Proteine ​​bei der Faltung unterstützen. Obwohl eine einzelne dieser Bindungen ziemlich schwach ist, bilden viele von ihnen oft zusammen eine starke Bindungsanordnung, wie im gezeigten Beispiel. Wie in der vorherigen Abbildung wird R als allgemeines verwendet (mehr. )

Eine vierte schwache Kraft spielt ebenfalls eine zentrale Rolle bei der Bestimmung der Form eines Proteins. Wie in Kapitel 2 beschrieben, neigen hydrophobe Moleküle, einschließlich der unpolaren Seitenketten bestimmter Aminosäuren, dazu, in wässriger Umgebung zusammengedrängt zu werden, um ihre störende Wirkung auf das wasserstoffbrückengebundene Netzwerk von Wassermolekülen zu minimieren (siehe S. 58 und Panel 2-2, S. 112�). Daher ist ein wichtiger Faktor, der die Faltung jedes Proteins steuert, die Verteilung seiner polaren und unpolaren Aminosäuren. Die unpolaren (hydrophoben) Seitenketten in einem Protein, das zu Aminosäuren wie Phenylalanin, Leucin, Valin und Tryptophan gehört, neigen dazu, sich im Inneren des Moleküls zu gruppieren (genauso wie hydrophobe Öltröpfchen in Wasser zu einem großen Tröpfchen verschmelzen) . Dadurch vermeiden sie den Kontakt mit dem Wasser, das sie innerhalb einer Zelle umgibt. Im Gegensatz dazu neigen polare Seitenketten, wie die von Arginin, Glutamin und Histidin, dazu, sich außerhalb des Moleküls anzuordnen, wo sie mit Wasser und anderen polaren Molekülen Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können (Abbildung 3-6). Wenn polare Aminosäuren im Protein vergraben sind, werden sie normalerweise über Wasserstoffbrücken zu anderen polaren Aminosäuren oder zum Polypeptidrückgrat gebunden (Abbildung 3-7).

Abbildung 3-6

Wie sich ein Protein zu einer kompakten Konformation faltet. Die Seitenketten der polaren Aminosäuren neigen dazu, sich an der Außenseite des Proteins zu sammeln, wo sie mit Wasser interagieren können.

Abbildung 3-7

Wasserstoffbrückenbindungen in einem Proteinmolekül. Zwischen benachbarten Regionen der gefalteten Polypeptidkette bilden sich viele Wasserstoffbrückenbindungen und tragen zur Stabilisierung ihrer dreidimensionalen Form bei. Das abgebildete Protein ist ein Teil des Enzyms Lysozym und der Wasserstoff (mehr. )


Kann die Proteinstruktur durch Röntgenbeugung in einem einzigen Bild bestimmt werden? - Biologie

1 Nur als Beispiel: Unter der Annahme einer Elementarzelle mit 100 Å Achsen in einem wohlgeordneten Proteinkristall und einem bevorzugten Mindestabstand von fünf Pixeln zwischen benachbarten Bragg-Peaks beträgt die maximal erreichbare Auflösung für ein einzelnes Quad ungefähr 3,5 & #197, wenn der Direktstrahl auf den Detektor zentriert ist. Für denselben Kristall würde die Kachelung von vier Quads wie hier dargestellt die maximale Auflösung, bei der Bragg-Flecken identifiziert werden können, auf über 1,0 Å hinaus erhöhen, wiederum unter der Annahme eines zentralen Direktstrahls.

Danksagung

Wir danken Wolfgang Kabsch für ein Programm zur Korrektur elliptischer Verzerrungen und für Diskussionen über die Datenverarbeitung. Wir danken Kay Diederichs und Sven Hovmöller für Diskussionen zur Datenverarbeitung. Wir danken Henning Stahlberg und Kenneth Goldie für Unterstützung und Diskussionen. Wir danken Rishi Matadeen, Sacha de Carlo, Thorsten Blum und Igor Nederlof für die Unterstützung bei der Probenvorbereitung und Datenerfassung. Wir danken Robbie Joosten und Garib Murshudov für Diskussionen über die Modellverfeinerung. Wir danken ASI (Amsterdam Scientific Instruments) für die Unterstützung bei Detektoren, Auslesung und Software. Wir danken Jan Visser und Bas van der Heijden (NIKHEF, Amsterdam) für frühen Support, Design und Tests.

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Die Strukturbiologie umfasst Techniken und Prinzipien der Molekularbiologie, Biochemie und Biophysik, um die molekulare Struktur und Dynamik biologisch relevanter Moleküle aufzuklären. Jüngste Fortschritte bei der Instrumentierung haben der Strukturbiologie einen neuen Schub gegeben, da komplexe biologische Moleküle jetzt mit beispielloser Leichtigkeit und Effizienz analysiert werden können. Die dreidimensionale Struktur von Proteinen und Proteinkomplexen bietet große Einblicke in die Gesetzmäßigkeiten der Lebensaktivitäten und Mechanismen von Krankheiten und ermöglicht dadurch ein rationales Design neuer diagnostischer und therapeutischer Wirkstoffe. Es gibt drei Hauptforschungstechniken für die Strukturbiologie: Einkristall-Röntgenbeugung (SC-XRD), Kernspinresonanz (NMR) und Kryo-Elektronenmikroskopie (Cryo-EM). Es gibt jedoch keine Allzweckmethode, da alle drei einzigartige Vorteile sowie Einschränkungen bieten.

Abb.1. Drei Hauptforschungstechniken für die Strukturbiologie. Laut den Statistiken von PDB (https://www.rcsb.org/) wurden mehr als 120.000 Proteinstrukturen durch SC-XRD aufgelöst, was fast 90% der Gesamtmenge ausmacht. Und es gibt etwa 12.000 Proteinstrukturen, die durch NMR erhalten wurden. Obwohl die Gesamtzahl der durch Cryo-EM aufgelösten Proteinstrukturen nicht mit der der ersten beiden Techniken vergleichbar ist, ist das explosive Wachstum der Strukturen dieser Technik in den letzten Jahren bemerkenswert.

Röntgenkristallographie verwendet Röntgenstrahlen, um die Position und Anordnung von Atomen in einem Kristall zu bestimmen. Das klassischste Verfahren der Röntgenkristallographie ist die Einkristall-Röntgenbeugung, bei der Kristallatome bewirken, dass der einfallende Röntgenstrahl Streustrahlen erzeugt. Wenn die gestreuten Strahlen auf dem Detektor landen, erzeugen diese Strahlen ein Speckle-Beugungsmuster. Wenn der Kristall allmählich gedreht wird, können der Winkel und die Intensität dieser gebeugten Strahlen gemessen werden, und dann wird ein dreidimensionales Bild der Elektronendichte innerhalb des Kristalls erzeugt. Anhand dieser Elektronendichte können die durchschnittliche Position von Atomen im Kristall, chemische Bindungen, Kristallbarrieren und verschiedene Informationen bestimmt werden. Für einen Einkristall mit ausreichender Reinheit, Homogenität und Regelmäßigkeit können die Röntgenbeugungsdaten den durchschnittlichen chemischen Bindungswinkel und die durchschnittliche Länge auf wenige Zehntel Grad bzw. auf wenige Tausendstel Angström bestimmen.

Abb.2. Physik und mathematische Prinzipien der Röntgenkristallographie zur Auflösung einer Struktur

Die Einkristall-Röntgenbeugungstechnik wurde 1912 vorgeschlagen und entwickelt und ist seit der ersten Bestimmung der Proteinstruktur von Myoglobin im Jahr 1958 zum wichtigsten und nützlichsten Werkzeug zur Bestimmung der Proteinstruktur geworden. Heutzutage gibt es mehr als 140.000 Proteinstrukturen wurden in einer Proteindatenbank (https://www.rcsb.org/) hinterlegt, von denen fast 90% mit Einkristall-Röntgenbeugungstechnik aufgelöst werden, was auf ihre Vorteile bei der Untersuchung der Struktur biologischer Makromolekülkristalle hindeutet.

Das Verfahren der Einkristall-Röntgenbeugungstechnik kann grob in vier Schritte unterteilt werden. Der erste Schritt besteht darin, hochwertige Einkristalle des Zielproteins zu erhalten, die als Proteinkristallisation bezeichnet wird. Wenn die Lösung des solubilisierten Proteins eine Übersättigung erreicht, fördert es die Proteinaggregation und Nukleation. Letztendlich ordnen sich einzelne Proteinmoleküle in einer sich wiederholenden Reihe von Elementarzellen an, indem sie eine einheitliche Orientierung annehmen. Qualifizierte Kristalle müssen eine ausreichende Größe (normalerweise größer als 50 μm in allen Dimensionen) und Qualität (regelmäßige Struktur, keine Risse oder Zwillinge) aufweisen. Die Gewinnung von Einkristallen von hoher Qualität ist der limitierende Schritt, um mit dieser Methode eine Struktur zu lösen.

Nach Erhalt eines Einkristalls ist ein Beugungsexperiment erforderlich. Der Kristall wird in einem intensiven Röntgenstrahl immobilisiert, wodurch ein Beugungsmuster erzeugt wird, das als Beugungsdaten (Winkel und Intensität der gebeugten Röntgenstrahlen) aufgezeichnet wird. Wenn der Kristall allmählich gedreht wird, verschwinden die vorherigen Reflexionen und neue Reflexionen entstehen. Die Beugungsintensität an jedem Fleck wird aus jeder Richtung des Kristalls aufgezeichnet.

Anschließend werden die aus dem Beugungsmuster erhaltenen Beugungsdaten mit verschiedenen Methoden der Strukturanalyse und Datenanpassung kombiniert, um die Elektronendichteverteilung im dreidimensionalen Raum innerhalb der Elementarzelle zu analysieren.

In the last step, based on the electron density map, a model of atomic arrangement in the crystal can be produced and refined.

Fig.3. The process of single crystal X-ray diffraction technique

This method may yield high atomic resolution and is not limited by the molecular weight of the sample. It is suitable for water-soluble proteins, membrane proteins as well as macromolecular complexes. When manipulated properly, it becomes a powerful tool to deliver reliable structural data of biological macromolecules and determine the position and structure of the active center, and helps understand how the protein recognizes and binds ligand molecules at the atomic level.

However, the single crystal X-ray diffraction method also has several disadvantages. First, the sample must be crystallizable, but crystallization of biological macromolecules with large molecular weight can be difficult, particularly, membrane proteins are more challenging to crystallize because of its large size and poor solubilization. Second, an organized single crystal must be obtained to allow appropriate diffraction. Finally, the obtained three-dimensional structure of biological sample only represents a static form of the tested molecule (one of many possibilities), rather than a dynamic one.

The second method is nuclear magnetic resonance (NMR). Nuclei are charged, fast spinning particles, which are similar to outer electrons. The gyromagnetic ratios of different atomic nuclei are different and therefore have different resonance frequencies. The movement of the nucleus is not isolated--it interacts with the surrounding atoms both intra- and inter-molecularly. Therefore, through nuclear magnetic resonance spectroscopy, structural information of a given molecule can be obtained. Taking protein as an example, its secondary structure, such as α-helix, β-sheet, turn, circular, and curl, reflect the different arrangement of the main chain atoms of protein molecules three-dimensionally. The spacing of the atomic nuclei in different secondary domains, the interaction between nuclei, and the dynamic characteristics of polypeptide segments all directly reflect the three-dimensional structure of proteins. These nuclear features all contribute to spectroscopic behaviors of the analyzed sample, thus providing characteristic NMR signals. Interpretation of these signals by computer-aided methods leads to deciphering of the three-dimensional structure.

Fig.4. Nuclear spin

Since the first observation of condensed-state NMR signals in 1946, NMR technology has experienced a rapid development for over 70 years, and its application has been extended from the area of physics such as nuclear magnetic moment determination to chemistry, medicine, material science, life science and many others. Notably, in the 1980s, NMR technology was applied in the structural analysis of protein creatively, thus promoting the application of NMR in biological field. Although the amount of three-dimensional structure data of proteins obtained by NMR technology is not comparable to that of single crystal X-ray diffraction, the unique advantages of NMR technology have been widely noticed: NMR is able to provide information on a kinetic basis, such that the internal movement of proteins over multiple time scales and their binding mechanism to ligands can therefore be solved.

There are four main steps in an NMR experiment: sample preparation, data acquisition, spectral processing, and structural analysis. NMR analysis is performed on aqueous samples of protein with high purity, high stability, and high concentration. A sample volume ranging from 300 to 600 μL with a concentration range of 0.1-3 mM. The use of stable isotopes 15N, 13C and 2H for protein labeling can effectively increase signal intensity and resolution. Selective labeling of certain amino acids or chemical groups of proteins can greatly reduce signal overlap. Multidimensional NMR experiments are utilized to acquire information about the protein. The spectral processing is then performed to determine the atoms of the protein corresponding to each spectral peak on different NMR spectra. Finally, a series of spatially structured information such as NOE and J coupling constants are used to calculate the spatial structure using distance geometric or molecular dynamics methods.

Fig.5. The process of nuclear magnetic resonance technology

The most important feature of the NMR method is that the three-dimensional structure of macromolecules in the natural state can be measured directly in solution, and NMR may provide unique information about dynamics and intermolecular interactions. The resolution of the macromolecular three-dimensional structure can be as low as sub nanometer.

However, the NMR spectrum of biomolecules with large molecular weight is very complicated and difficult to interpret, thereby limiting the application of NMR in analyzing large biomolecules. Additionally, this technique requires relatively large amounts of pure samples (on the order of several mg) to achieve a reasonable signal to noise level.

The third approach is the cryo-electron microscopy (Cryo-EM) technique, which includes three different methods: single particle analysis, electron tomography and electron crystallography. The essential mechanism of Cryo-EM is electron scattering. The basic principle is described as follows. Samples are prepared through cryopreservation prior to analysis. The coherent electrons are used as a light source to measure the sample. After the electron beam passes through the sample and the nearby ice layer, the lens system converts the scattered signal into a magnified image recorded on the detector. And signal processing is performed to obtain the three-dimensional structure of the sample.

Electron microscopy three-dimensional reconstruction technology was first discovered in 1968. The three-dimensional structure of T4 phage tail was reconstructed by electron micrographs. And then the general concept and methods of three-dimensional reconstruction of electron microscopy were proposed. For reducing the radiation damage, cryogenic electron microscopy was created in 1974. After more than 30 years of development, Cryo-EM has become a powerful tool for studying the structure of biological macromolecules. In recent years, the Cryo-EM technology has made revolutionary progress, particularly in the single particle analysis. Since 2013, with the tremendous advances in electron detector and image processing, Cryo-EM single particle analysis has progressed so rapidly that the resolution of Cryo-EM is now comparable to single crystal X-ray diffraction. At present, Cryo-EM is becoming a powerful tool for determining high resolution structure of biological macromolecules.

Before using the Cryo-EM to observe the sample, negative staining EM can be utilized for rapid screening of homogeneous sample. The Cryo-EM single particle analysis technique begins with the sample vitrification. During this process, the protein solution is instantly cooled, so that the water molecules do not crystallize, forming an amorphous solid. The frozen sample is then screened and data is collected in the system. A series of two-dimensional images can be taken during this period. Next, based on plenty of two-dimensional images acquired, particle alignment and classification are carried out. In the end, the data is processed by reconstruction software to generate a three-dimensional structural model.

Fig.6. The process of Cryo-EM single particle analysis technique

Compared to single crystal X-ray diffraction, the rapid freeze treatment of the sample maintains its closer-to-native state. Moreover, this method requires only a small amount of sample (about 0.1 mg), is more forgiven on sample purity, and does not need the protein to crystalize.

The main defect in this technique is that the particles are detected in unknown orientations. High levels of noise, due to the use of limited electron doses to minimize radiation damage, especially at high resolution, tends to complicate the determination of these orientations, and this is particularly a concern for smaller particles. Hence, structure determination of biological macromolecules by Cryo-EM was limited to large complexes or low-resolution models over the last few years.

Fig.7. Cryo-electron microscopy

In summary, each technology has its own advantages in certain applications such that one method might be used extensively in some cases but rarely in others. Thus, understanding the nature of the analysis is the key in method selection. Not only will the inappropriate selection of method produce compromised results, it may also cause significant delays of the project, and result in financial losses. For more information, please see Table 1.


Abstrakt

Single-crystal X-ray diffraction analysis was performed on a magnetically oriented microcrystal array (MOMA a composite in which microcrystals are oriented three-dimensionally in a polymer matrix) to demonstrate its potential to determine protein structure from a powder sample. Recrystallized hen egg-white lysozyme was pulverized to prepare a microcrystalline powder as a model system from which a MOMA was prepared. The microcrystalline powder was suspended in an ultraviolet (UV)-curable monomer and rotated nonuniformly in a static magnetic field (8 T), and then, the crystalline alignment was consolidated by UV light irradiation. The obtained sample was subjected to conventional single-crystal X-ray diffraction measurement. The structure determined for the MOMA was found to belong to the space group P212121 with unit-cell dimensions ein = 51.26, B = 59.79, and C = 29.95 Å, in agreement with the structure of the single crystal from which the MOMA was prepared. The protein structure was refined at the highest resolution of 3.0 Å, which agreed with that determined with an independently grown single crystal under comparable conditions. The fabrication method presented here provides a powerful means of determining the structure of proteins that do not crystallize to sizes suitable for conventional single-crystal X-ray analyses.


Abstrakt

We demonstrate that ion-beam milling of frozen, hydrated protein crystals to thin lamella preserves the crystal lattice to near-atomic resolution. This provides a vehicle for protein structure determination, bridging the crystal size gap between the nanometer scale of conventional electron diffraction and micron scale of synchrotron microfocus beamlines. The demonstration that atomic information can be retained suggests that milling could provide such detail on sections cut from vitrified cells.

Despite the explosive growth in cryoelectron microscopy (cryo-EM) following the “resolution revolution” (1), X-ray methods were responsible for nearly 20-fold as many macromolecular structure depositions as single-particle cryo-EM in 2017, and diffraction remains the favored method for genuine atomic resolution analysis. Crystal growth is often a bottleneck for such analyses, and it can sometimes be difficult to grow crystals of sufficient size for analysis at conventional synchrotron macromolecular crystallography (sMX) beamlines. This has led to the development of microfocus beamlines that can routinely analyze crystals down to ∼5 μm (2). However, it is unknown how often crystallographic analyses fail due to the failure to recognize smaller crystals. The next generation of synchrotron beamlines may reduce the size requirement to around 1 μm, and the potential for structure determination from submicron crystals has been demonstrated by application of X-ray free electron laser (XFEL) sources, which achieve a brightness ∼10 8 -fold greater than a typical synchrotron beamline (3). XFEL sources also sometimes mitigate, by achieving “diffraction before destruction,” the radiation damage problem that limits the collection of synchrotron X-ray data (4, 5).

Electron diffraction (ED) can provide high-resolution structure determination from 3D crystals (6 ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ –12). Electrons have potential advantages over X-rays for the analysis of very small crystals: Their interaction with matter is sufficiently strong for a measurable signal to be obtained from a typical laboratory instrument the experiment is performed in a vacuum, thereby reducing background scatter and the useful data obtained before radiation damage occurs are much greater (6, 13, 14). However, the strong interaction with matter is also a limitation for ED, since the beam is absorbed very strongly by a few hundred nanometers of crystal. Furthermore, it has often been held that kinematic theories of diffraction, upon which X-ray analysis rests, are useless for crystals of such thickness (15, 16). For protein crystals, due to the large size of the unit cell, many diffracted beams are stimulated simultaneously and, through conservation of energy, the amplitude of each is greatly reduced, mitigating the effects of multiple scattering. Although dynamical effects have been observed with thicker protein crystals (6), the utility of the kinematic theory for thin crystals is shown in our study below, where systematic absences, which would be polluted by multiple scattering, are maintained. Indeed, in recent years, the power of ED to analyze nanometer-sized crystals has been amply demonstrated (6, 12, 17) however, there remains a significant range of size, from a few hundred nanometers to a few microns, that is accessible only using XFEL radiation, which is both hard to access and extremely expensive.

Micromachining using a focused ion beam (FIB milling) has been established in physical science applications for many years (18), and, although far from routine, cryo-FIB milling is now increasingly applied in the life sciences, for instance, to create thin lamella milled from frozen, hydrated cells to reveal cellular architecture (19). Cryo-FIB milling has been shown to preserve the structure of frozen, hydrated biological samples better than mechanical cryosectioning, although how far the preservation of order extends has not been established (19).


Methods

Proteinexpression und -reinigung

HCA II was expressed in BL21 DE3 pLysS E coli cells that were transformed with an expression plasmid based on pET31F1 coding for protein with UniProt accession code P00918 45 . The cells were grown in shaker incubators at 180 rpm and 37 °C in LB media supplemented with 0.1 mg/ml ampicillin. Once the cells reached an optical density of

1 at 600 nm, protein expression was induced with the addition of 1 mM isopropyl β- d -1-thiogalactopyranoside (IPTG) and 1 mM ZnSO4. Protein expression was allowed to continue for 3 h. At this point, the cells were harvested by centrifugation in a JLA 8.1 rotor (Beckman) at

6800 × g for 20 min and frozen at −20 °C. Cells were resuspended in buffer A (0.2 M Na2SO4, 100 mM Tris, pH 9.0) and lysed by addition of lysozyme while stirring in the cold room for 3–4 h. The cell lysate was centrifuged in a JA-25.50 rotor (Beckman) at

18,000 × g for 60 min at 4 °C, and the supernatant containing the soluble cellular fraction was loaded onto affinity resin (para-aminomethylbenzensulfonamide, Sigma Aldrich A0796). Unbound protein and nucleic acids were removed by repeated wash steps with buffer A, followed by buffer B (0.2 M Na2SO4, 100 mM Tris, pH 7.0). Bound HCA II was eluted with 50 mM Tris, pH 7.8, and 0.4 M NaN3. The eluted protein was concentrated with Amicon Ultra concentration devices (10 kDa molecular weight cutoff), purified, and buffer-exchanged by size-exclusion chromatography on HiLoad 26/600 Superdex 75 (GE Healthcare Life Sciences) in 50 mM Tris, pH 8.5. Fractions were collected and analyzed by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis to assess protein purity and homogeneity prior to crystallization. Eluted fractions containing HCA II were pooled and concentrated to

20 mg/ml by using Amicon Ultra Centrifugal Filter Units (Merck) with a molecular weight cutoff of 10 kDa.

Kristallisation

Crystals of HCA II were grown in sitting-drop vapor-diffusion setups using microbridges (Hampton Research) and 24-well Linbro crystallization plates (Hampton Research). The drops were prepared by mixing 10 μl of protein solution (20 mg/ml) with 10 μl of precipitant solution (2.8 M (NH4)2SO4, 0.1 M Tris, pH 8.5), and were equilibrated against 1 ml of reservoir solution of the precipitant. Plates were incubated at 20 °C, and crystals appeared in 2–3 days. Crystals were harvested by crushing and repeated pipetting into 1.5 ml Eppendorf tubes to collect slurries of small crystals in mother liquor and stored at 20 °C until cryo-grid preparation.

Sample preparation

Complexes of HCA II with inhibitor AZM (Sigma Aldrich, A6011) were prepared by soaking the crystal slurries with inhibitor solubilized in dimethyl sulfoxide (DMSO) for 20 min, with a final concentration of 0.5 mM HCA II and 4.5 mM AZM. Grids were prepared by pipetting 3 μl on a QUANTIFOIL 1.2/1.3 (300 mesh) Cu holy carbon TEM grid. Excess liquid was removed via pressure-assisted backside blotting using Preassis 46 . The grid was vitrified manually by flash-cooling in liquid ethane. The sample was transferred to a Gatan 914 cryo-transfer holder.

Datenerfassung

Microcrystal electron-diffraction data were collected on a JEOL JEM-2100 (LaB6 filament) TEM operated at 200 kV equipped with a Timepix hybrid pixel detector (Amsterdam Scientific Instruments). Grids were screened for suitable microcrystals in defocused diffraction mode, and diffraction data were collected from an area of 1.5 μm diameter defined by a selected-area aperture using the Instamatic software interface 40 . The effective sample-to-detector distance was 1481.74 mm. Data were collected using continuous rotation with an angular increment of 0.68° and an exposure time of 1.5 s per frame. Individual crystal datasets were typically collected over a tilt range of on average 10–30°, with an acquisition time of 22–66 s per crystal dataset. The total range of tilt angles covered during data collection from several crystals was −60 to +60°. The electron dose rate applied during data collection was approximately 0.1 e − /Å 2 /s, and the total exposure dose for each crystal dataset was within 2.0–6.0 e − /Å 2 .

Data processing

Data were integrated using XDS 47 with the Laue group constrained to 2/m. Reflections from different crystal datasets were merged in XSCALE 47 using a weighted average of the unit-cell parameters obtained from individual crystal processing (see Supplementary Tables 1 and 2). Selection criteria for including data were based on merging statistics and correlation coefficients between individual datasets as reported by XSCALE. A cutoff value of 0.7 was used for the ligand-bound HCA II data for the native HCA II data, a cutoff of 0.6 was used. Data were truncated at approximately ichich ≥ 1.0 and CC1/2 ≥ 0.4 with a correlation significant at the 0.1% level 48 (see Supplementary Tables 3 and 4). Data were merged and converted into MTZ format using AIMLESS 49 .

Structure solution

A search model of the apo structure with the metal cofactor, ligands, and water removed was generated from a high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4 29 ) using Sculptor 50 . The structure was solved using maximum-likelihood molecular replacement in Phaser 36 using the MicroED reflection intensities. For both native and ligand-bound data, a well-contrasting single solution was found with LLG = 1871, TFZ = 18.6, and LLG = 2494, TFZ = 19.6, respectively.

Model building and refinements

Starting electrostatic potential maps were generated from the molecular replacement solution using rigid-body refinement in phenix.refine 51 . The starting model and maps were used for remodeling several side chains and manually placing the metal cofactor Zn 2+ using Coot 37 . After restrained reciprocal space refinement in phenix.refine, the resulting map was inspected for any difference potential, indicating the presence of the bound inhibitor. The AZM ligand was imported in Coot using the get monomer command, and we used the find ligands command to fit the ligand using the precalculated mFo–DFc difference potential map at 2.8σ.

Furthermore, upon inspection of the map, a clear blob of difference potential was observed in the solvent region, appropriate for accommodating a single DMSO molecule that was used as solvent to solubilize the ligand. The DMSO molecule was manually fitted using the get monomer command in Coot. Its position is in agreement with the neutron structure (PDB ID 4g0c) 30 where the space is occupied by three waters, and with a glycerol (GOL) solvent molecule occupying the same region in the high-resolution X-ray model (PDB ID 3hs4) 29 .

The HCA II:AZM model was then completed, automatically placing water molecules, and using restrained reciprocal space refinement in phenix.refine 51 . All refinement steps were preformed using a test set representing 5% of all reflections, atomic scattering factors for electrons, automatic weighting of the experimental data to stereochemistry and atomic displacement parameter terms, and group B-factor refinement per residue 51 .

Validierung

The geometry of the native and ligand-bound structural models was validated using MolProbity 52 (Table 1). A simulated annealing (SA) composite omit map was calculated using phenix.composite_omit_map 51 by sequentially omitting 5% fractions of the structure. No missing reflections were filled in for map calculations. The MicroED model of the native structure shows a backbone Cα root-mean-square (r.m.s.) deviation of 0.23 Å with a structure from joint refinement against neutron and X-ray diffraction data (PBD ID 3tmj) 27 , and 0.22 Å with an X-ray structure of native HCA II (PBD ID 3ks3) 53 . The inhibitor-bound MicroED model shows a backbone Cα r.m.s. deviation of 0.29 Å with a previously determined model from joint X-ray and neutron refinement (PDB ID 4g0c 30 ), and of 0.22 Å with a high-resolution X-ray model of the same inhibitor-bound complex (PDB ID 3hs4) 29 , that was used as search model for molecular replacement. Root-mean-square deviation values between structural models were calculated by the secondary-structure matching (SSM) tool 54 .

Figuren

Figures 2–4 were prepared using the PyMOL Molecular Graphics System, version 2.2.3 Schrödinger, LLC.

Reporting summary

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der Nature Research Reporting Summary, die mit diesem Artikel verlinkt ist.


Docking of X-Ray Crystallographic Structures Within Cryo-EM Maps

In the past decade, the most widely accepted combinatorial approach of X-ray crystallography and cryo-EM technique has been the practice of docking X-ray crystallographic atomic models into a cryo-EM map at low resolution. 5 This practice started in 1990s when crystal structures were attempted to be docked into low-resolution cryo-EM maps of icosahedral viruses or cytoskeletal helical filaments. 6 In the past two decades, several dozen docking software packages have been developed but only a few are still being actively developed today. The docking methods can be classified mainly into two categories: rigid-body docking and flexible docking. Rigid-body docking is used to find the optimal orientation and position of sub-component atomic crystallographic structures in the cryo-EM map. The most popular docking software packages include Situs, 7 EMfit, 8 and UCSF Chimera docking utility. 9 In cases where some minor conformational differences exist between the crystal structure of an individual component and its counterpart in the cryo-EM map, flexible docking algorithms, such as normal mode analysis and molecular dynamic simulation, are used by introducing conformational changes to the X-ray structure to fit into the cryo-EM map while maintaining the stereo-chemistry of the atomic models. Some flexible docking software packages include Situs, Flex-EM, 10 MDFF, 11 iMODFIT 12 and more recently Rosetta. 13

The docking can be quite useful in defining the protein location and protein–protein interface within a complex and new interaction modes that are not revealed by X-ray crystallography. If the cryo-EM density is of good enough quality, the docking can be quite precise even at lower resolution. In a recent example, the crystal structure of Ryanodine receptor 1's SPRY2 domain (∼50 kDa) was docked as a rigid body into a 10 Å resolution cryo-EM map of the entire complex (∼1.5 MDa) (Fig. 2). 14 The best scored result by the Colores program of Situs turned out to define the domain's location and orientation quite precisely to agree with the same domain in the high resolution structure of the complex in a 3.8 Å structure solved more recently by single particle cryo-EM. 15 The RMSD between the Cα atoms of the docked SPRY2 model and the high resolution atomic model of the complex was only 2.1 Angstrom. This underscores both the quality of the low-resolution cryo-EM map and the robustness of the docking algorithm.

Docking of atomic models into the 3D cryo-EM map of Ryanodine receptor 1 complex at 10 Angstrom resolution. The 3D EM map of the Ryanodine receptor 1 (EMD-5041) is shown in semi-transparent rendering in two orthogonal views. The atomic model of a ryanodine receptor monomer (grey) is docked in the map. The atomic model of SPRY2 domain docked in the map with rigid docking algorithm is shown in red color. Its equivalent domain in the atomic model of the full-length protein is shown in blue color. The atomic models of the two SPRY2 domain are in very similar orientation and location.

In our study, elucidating the architecture of yeast RNA exosome complex, docking of atomic models into low-resolution EM 3D reconstruction maps was critical for us to uncover new mechanistic insights of the complex's function. We solved a 3D reconstruction of the yeast exosome complex comprising ten subunits using single particle EM at about 18 Angstrom resolution, in which we were able to dock homologous atomic models of the nine-subunit human core complex and bacterial RNase III protein determined by X-ray crystallography. 16 This allowed us to reveal the mode of interaction between the Rrp44 subunit and the core complex. In a later study, we docked the crystal structure of RNA-bound yeast exosome 10-mer 17 into a 3D EM reconstruction of the complex in conformations induced by different lengths of RNA substrates with high fidelity. 18 Alternatively, we revealed a different conformation of the exosome bound by RNAs with short 3′-ss tails and built atomic models by docking available crystal structures of the core complex and Rrp44 separately in the 3D EM reconstruction. The two docking results allowed us to reveal distinct pathways of RNA substrate recruitment and processing within the complex. Interestingly, the most recent near-atomic-resolution structure of the apo-exosome complex (PDBID: 5G06) 19 verified the interfaces between the subunits calculated from the previous docking models in the low-resolution cryo-EM map of the apo-exosome complex.


Protein Mapping

Mapping of the location and expression level of proteins in specific cells, tissues, and organs aids in the functional study of the proteome. Spatial distribution of proteins is key to protein function, with improper localization or expression triggering various disease states. Mapping projects such as the Human Protein Atlas provide a proteomic resource for biomarker discovery and aid in the understanding of disease pathology. Mapping of the interactome helps define the molecular interactions that occur on a cellular level, assisting in the understanding of protein function and providing valuable potential drug targets for disease.