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Muss ich Saccharose verwenden, um einen Lac-Promotor zu induzieren?


Ich möchte den Ausdruck eines F . optimierenab Fragment in Escherichia coli. Zur Induktion des lac Promotor auf dem pAK400-Vektor verwende ich IPTG und Saccharose. Optimiere ich den Ausdruck, falls ich nur IPTG hinzufügen würde?


Sie können das Lac-Operon durch zwei Dinge induzieren: Lactose (oder genauer Allolactose, ein Metabolit davon) und Lactose-Analogone, die von den Bakterien nicht metabolisiert werden.

Lactose induziert die Expression und wird metabolisiert, während IPTG kein Ziel der $eta$-Galactosidase ist und Ihnen eine starke und dauerhafte Induktion verleiht. Saccharose hat keine Wirkung auf den Promotor.


T7 und DH5 alpha - Hilf mir, einige Dinge zu klären (Feb/04/2010 )

Hallo!
Ich mache meine Masterarbeit und versuche, einige Dinge zu klären, damit ich sie vollständig verstehe. Jetzt untersuche ich das T7-Expressionssystem. Wenn ich die Dinge richtig verstehe, wird die T7-RNA-Polymerase normalerweise unter der Kontrolle eines lac-Operators in das chromosomale Genom eingebaut, der die Transkription unter Zugabe von IPTG startet. Dann findet die Polymerase den T7-Promotor auf dem Plasmid und beginnt die mRNA von dieser Stelle zu transkribieren.

Ich habe jedoch irgendwo gelesen, dass mein Bakterienstamm DH5 alpha kein eigenes T7-RNA-Polymerase-Gen trägt und dass dieses auf dem Plasmid vorhanden sein sollte und transformiert werden muss. Ist das wahr? Ich vermute, dass dies nicht der Fall ist, weil ich nicht sehen kann, dass meine Plasmide (pTZ19R und pSE420) so etwas enthalten. Könnten Sie mir helfen, die Dinge zu klären?

Was du liest ist richtig. Die meiste T7-Expression erfolgt in Bakterienstämmen, die mit dem DE3-Phagen lysogenisiert wurden und die T7-RNA-Polymerase unter der Kontrolle des lac-Promotors tragen. DH5a hat dies nicht. Normalerweise werden Stämme mit dieser Modifikation in ihrem Namen angegeben, wie z. B. BL21 (DE3). Der Grund, warum DH5a diese Modifikation typischerweise nicht trägt, ist, dass es für die Proteinexpression schlecht ist, da es immer noch die lon-Protease enthält, die dazu neigt, exprimierte Proteine ​​abzubauen. Der BL21-Stamm wird für diese und andere Proteasen ausgeschaltet.

Sie könnten sicherlich den lac-Promotor und das T7-RNA-Polymerase-Gen auf einem Plasmid (entweder das gleiche oder ein co-transformierendes) in DH5a tragen. Nur wenige Menschen tun dies, weil sie sich um die resultierende Proteinexpression kümmern.

Vielen Dank für Ihre Antwort ! Ich hatte gehofft, dass ich etwas falsch gemacht habe, damit sie jedoch mehr Sinn machen würden. Wenn DH5a ein schlechter Genexpressionsstamm ist, warum sollte das jemand tun wollen? Und wie erfolgt die Expression, wenn keine T7-RNA-Polymerase vorhanden ist?

Ich habe jetzt versucht, das Thema zu recherchieren, aber es verwirrt mich nur noch mehr. Ich habe dies in einem Informationsdokument von Invitrogen gefunden:
Wichtig: DH5α E. coli benötigt kein IPTG, um die Expression durch den lac-Promotor zu induzieren
obwohl der Stamm den Lac-Repressor exprimiert. Die Kopienzahl der meisten Plasmide überschreitet
die Repressorzahl in den Zellen. Wenn Sie sich Sorgen machen, maximale Werte von . zu erreichen
Expression, fügen Sie IPTG bis zu einer Endkonzentration von 1 mM hinzu.

Meine ursprüngliche Quelle erwähnt IPTG überhaupt nicht, und ich nahm an, dass es daran lag, dass sie nicht alle Informationen rund um die Produktion des Proteins geben wollten, aber vielleicht verwenden sie es einfach nicht?

Außerdem habe ich festgestellt, dass ich auf meiner SDS-PAGE klarere Ergebnisse erhalte, wenn ich eine Methode mit PMSF verwende. Meine Vorgesetzten sind der Meinung, dass es nicht benötigt wird, aber ich denke, es würde die lon-Protease blockieren und eine Art Wirkung haben? Ich werde wahrscheinlich noch einen Test dazu machen, nur zum persönlichen Vergnügen..

Ok, ich plappere nur mit meinen Fragen, aber die ersten sind die wichtigsten. Wo ist die Polymerase?

Das pTZ19R-Plasmid weist sowohl einen lac-Promotor als auch einen T7-Promotor stromaufwärts seiner multiplen Klonierungsstelle auf. In einem LacI-Stamm wird dies vom lac-Promotor exprimiert, was nichts mit dem T7-Promotor zu tun hat. Der T7-Promotor ist dazu da, die Expression in einem BL21 (DE3)-Stamm zu ermöglichen. Wenn mir das Protein wichtig wäre, würde ich in BL21 (DE3) subklonieren und mit IPTG induzieren, dann (wie Sie es tun) in Gegenwart von PMSF reinigen, obwohl dies bei BL21-Stämmen weniger wichtig ist.


T7-Expressionssysteme zur induzierbaren Produktion von Proteinen aus klonierten Genen in E coli

Induzierbare T7-Expressionssysteme sind in der Lage, eine Vielzahl von Proteinen in E coli. Zu den Verbesserungen gegenüber der üblichen Praxis gehören: (1) die Verhinderung einer unbeabsichtigten Induktion durch Etablierung und Aufrechterhaltung von Expressionsstämmen in nicht-induzierenden Wachstumsmedien, die vollständig aus gereinigten Komponenten anstelle von komplexen Wachstumsmedien bestehen, die Zielproteine ​​bei Annäherung an die Sättigung variabel induzieren können, und (2) die Expression vieler Zielproteine ​​parallel durch bequeme und produktive Autoinduktion in BL21(DE3) und anderen geeigneten Wirten anstelle von IPTG-Induktion. Von den frühesten Tagen an verhinderte die basale Expression die Etablierung induzierbarer Stämme zur Produktion von Proteinen, die für den Wirt stressig sind. Neu entwickelte pAL-Vektoren reduzieren nun die basale Expression auf ein Niveau, bei dem kodierende Sequenzen selbst für die stressigsten Proteine ​​aufrechterhalten und induziert werden können. Die asymmetrische Ligation ermöglicht eine einfache und effiziente Klonierung einzelner kodierender Sequenzen oder die gleichzeitige Klonierung von zwei oder drei kodierenden Sequenzen zur Co-Expression aus einem einzigen pAL-Vektor. © 2018 von John Wiley & Sons, Inc.


Ergebnisse

Engineering von Synechokokken 2973 für die Saccharoseproduktion

Um einen Saccharose-exportierenden . zu konstruieren Synechokokken 2973 Stamm, die Saccharosepermease cscB Gen wurde in ein neutrales Site 3 (NS3)-Targeting-Plasmid 17 kloniert, das dann in . eingeführt wurde Synechokokken 2973 über bakterielle Konjugation (Abb. 1B). Ein vollständig segregierter Stamm wurde durch mehrmaliges erneutes Patchen der Platten erhalten, und die korrigierte Genommodifikation wurde durch PCR-Genotypisierung bestätigt ( 1C ). Um die Saccharoseproduktion in zu testen Synechokokken 2973, die konstruierte 2973-cscB Stamm (Tabelle 1) wurde in BG11 mit 100–200 mM NaCl gezüchtet ( 2A ). IPTG (1 mM) wurde hinzugefügt, um zu induzieren cscB Genexpression. Die Überstände wurden für die Saccharoseanalyse gesammelt. Der höchste Saccharosetiter, 8 g L −1 in 5 Tagen, wurde in BG11 mit 150 mM NaCl beobachtet. Die höchste volumetrische Produktivität betrug 1,9 g L −1 Tag −1 in 4 Tagen, was einer Saccharoseausbeute von 3,1 g.g −1 Zellbiomasse entspricht. Diese Produktivität ist mehr als 2-mal höher als die der eng verwandten Belastung Synechokokken 7942 (Ergänzende Abb. S1). Der pH-Wert des Mediums war unter Saccharose-produzierenden Bedingungen niedriger, da Protonen mit Saccharose durch den CscB-Saccharose/H + -Symporter exportiert werden (Ergänzungstabelle S1). Darüber hinaus beobachteten wir, dass Salzstress zu einem beeinträchtigten Wachstum von Synechokokken 2973 (Abb. 2B), was zu einer verringerten OD . führt730 Werte mit steigender NaCl-Konzentration.

Saccharoseproduktion in cscB-ausdrücken Synechokokken 2973. (EIN) Zeitverlauf der Saccharoseproduktion im cscB-exprimierender Stamm in BG11-Medium mit verschiedenen Konzentrationen von NaCl. (B) OD730 des cscB- Belastung ausdrücken. (C) Kohlenstoffverteilung zwischen Saccharose und Zellbiomasse (BG11 mit 150 mM NaCl). (D) Saccharoseproduktion unter verschiedenen Kulturbedingungen mit 150 mM NaCl (5 Tage). Die Wachtturm-Gesellschaft Synechokokken 2973 wurde als Kontrolle aufgenommen. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. ND, nicht erkannt.

Um zu untersuchen, wie viel photosynthetisch fixierter Kohlenstoff unter Salzstressbedingungen zur Saccharoseproduktion geleitet wird, analysierten wir die Kohlenstoffverteilung zwischen Saccharose und Zellbiomasse (Abb. 2C). Während der ersten 24 Stunden des Wachstums wurden 71% des fixierten Kohlenstoffs (0,8 g L –1 ) für die Zellbiomassesynthese verwendet und in dieser Zeit wurden nur 0,3 g L –1 Saccharose produziert. Von Tag 1 bis Tag 4 stieg der Saccharose-Titer dramatisch an. An jedem dieser Tage war die Saccharoseproduktivität größer als 2 g L –1 Tag –1 . Die höchste Saccharosemenge wurde zwischen Tag 3–4 produziert, währenddessen erreichte die Saccharoseproduktivität 2,8 g L −1 . Nach Tag 3 wurden über 88% des fixierten Kohlenstoffs zu Saccharose geleitet. Der Titer nahm während des 4.–5. Tages ab, an dem nur 0,7 g L –1 Saccharose produziert wurden.

Darüber hinaus haben wir die Kapazität der Saccharoseproduktion ohne Zugabe von IPTG oder des Antibiotikums Kanamycin getestet. Ohne IPTG-Induktion ist das 2973-cscB Stamm produzierte 6,4 g L –1 Saccharose ( 2D ), was 21% weniger ist als unter IPTG-induzierten Bedingungen ( 2A ). Eine aktuelle Studie berichtete, dass IPTG-induzierbare Promotoren (trc, lac, und LlacO-1) sind undicht in Synechokokken 2973 18 . Unsere Daten zeigen auch, dass die lacUV5 Promoter ist undicht Synechokokken 2973. Ebenso die 2973-cscB Stamm produzierte 6,6 g L –1 Saccharose ohne Zugabe von Kanamycin ( 2D ). Obwohl die cscB Gen in das Genom eingefügt wurde, zeigt dieses Ergebnis, dass Kanamycin erforderlich ist, um eine hohe Saccharose-Produktivität in aufrechtzuerhalten Synechokokken 2973.

Untersuchung des Kohlenhydratstoffwechsels bei Saccharose-produzierenden Synechokokken 2973

Nach seiner exponentiellen Wachstumsphase Synechokokken 2973 akkumuliert eine beträchtliche Menge an Glykogen, um überschüssigen festen Kohlenstoff zu speichern 16 . Um die Kohlenstoffverteilung zwischen Glykogen und Saccharose besser zu verstehen, haben wir den Glykogengehalt in den Saccharose produzierenden Synechokokken 2973 Stamm. Die 2973-cscB Zellen wurden in BG11 mit oder ohne 150 mM NaCl gezüchtet und die Mengen an Glykogen und Saccharose wurden analysiert. Die Zellbiomasse war in BG11-Medium ohne Zugabe von NaCl 2fach höher (Fig. 3A). In Abwesenheit von NaCl, Synechokokken 2973 produzierte in 5 Tagen nur 0,4 g L −1 Saccharose, das ist 19-mal weniger als in Gegenwart des Salzes (Abb. 3B). Im Gegensatz dazu nahm der Glykogengehalt unter Saccharose-produzierenden Bedingungen signifikant ab. In Gegenwart von 150 mM NaCl wird das 2973-cscB Stamm akkumulierte Glykogen von weniger als 1% des Zelltrockengewichts (DW) während Tag 1 und Tag 3 (Fig. 3C). Am 5. Tag stieg der Glykogengehalt auf 10 % des DW, entsprechend 0,2 g L –1 Glykogen (40-fach niedriger als Saccharose). Ohne Zugabe von NaCl akkumulierten die Zellen nach 3 Tagen Glykogen auf mehr als 40% des DW ( 3C ). Diese Beobachtungen bestätigten weiter, dass Salzstress die Kohlenstoffflüsse von der Glykogenakkumulation zur Saccharoseproduktion in diesem gentechnisch veränderten Stamm umlenkte.

Analyse des Kohlenhydratstoffwechsels in Synechokokken 2973 cscB- Belastung ausdrücken. Zellen wurden in BG11-Medium mit oder ohne Zugabe von 150 mM NaCl gezüchtet. (EIN) Ansammlung von Biomasse. (B) Saccharose-Produktion. (C) Glykogengehalt. (D) Semiquantitative RT-PCR zur Überwachung der Genexpression bei Glykogen- und Saccharosesynthesen. Das Housekeeping-Gen rpoA diente als Kontrolle. Die Zahlen unter dem Gel stellen die relativen Bandenintensitäten von Proben dar, die mit 150 mM NaCl gegenüber 0 mM NaCl wachsen. Die Gele voller Länge sind in der ergänzenden Abb. S2 dargestellt. Die Daten in den Feldern A–C repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. DW, Zellentrockengewicht rpoA, RNA-Polymerase-Untereinheit α.

Als nächstes führten wir eine semiquantitative RT-PCR durch, um die Transkription von Genen zu untersuchen, die an der Glykogen- und Saccharose-Biosynthese beteiligt sind, einschließlich glgC, glgA, und sps (Abb. 1A). GlgC (ADP-Glucose-Pyrophosphorylase) und GlgA (Glykogen-Synthase) sind die Enzyme, die für die Glykogen-Biosynthese verantwortlich sind. In Synechococcus elongatus, weist das SPS-Enzym sowohl Saccharose-Phosphat-Synthase- als auch Saccharose-Phosphat-Phosphatase-Aktivitäten auf 19 . Daher Ausdruck der sps Gen wurde überwacht. Das Housekeeping-Gen rpoA (die für die RNA-Polymerase-Untereinheit α kodiert) wurde als Kontrolle für dieses RT-PCR-Experiment verwendet 20 . Transkriptstufen von glgC und glgA waren mit oder ohne Zugabe von NaCl nicht signifikant unterschiedlich (Fig. 3D). Im Gegensatz dazu ist das Saccharose-Synthese-Gen sps wurde unter Salzstressbedingungen stark exprimiert ( 3D ), was darauf hindeutet, dass die erhöhte Saccharoseproduktion im Salzmedium auf die Hochregulierung des Saccharosebiosynthesewegs zurückzuführen ist.

Engineering des Saccharose-Biosynthesewegs

Bei Cyanobakterien ist Salzstress erforderlich, um die Saccharoseproduktion zu induzieren. Das Saccharose-Biosynthese-Gen sps wird in Salz-BG11-Medium hochreguliert (Fig. 3D). Um die Anwendungsmöglichkeiten der Saccharoseproduktion in Cyanobakterien zu erweitern, haben wir entwickelt Synechokokken 2973, um Saccharose in BG11-Medium ohne Zugabe von NaCl herzustellen. Der Saccharose-Biosyntheseweg aus Synechozystis sp. PCC 6803 wurde in der 2973-cscB Dehnung (Abb. 4A). Es ist bekannt, dass die Überexpression der sps und spp Gene von Synechozystis 6803 führt zu einer 2-fachen Verbesserung der intrazellulären Saccharoseproduktion unter Salzstressbedingungen 14 . Um das auszudrücken Synechozystis 6803 sps und spp Gene in Synechokokken 2973 klonierten wir sie in das selbstreplizierende RSF1010-Plasmid 21 unter der Kontrolle eines IPTG-induzierbaren trc1O Promoter. Die Plasmide, die entweder sps allein oder sps-spp Gene wurden dann in die 2973-cscB Stamm (Tabelle 1). Beide sps und sps-spp Überexpressionsstämme waren in der Lage, Saccharose in BG11-Medium ohne zusätzliches NaCl zu produzieren ( 4B ). In Abwesenheit von IPTG ist die sps und sps-spp Stämme produzierten 1,6 g L -1 bzw. 3,4 g L -1 Saccharose in 3 Tagen, was 11-fach bzw. 23-fach höher war als bei der Kontrolle 2973-cscB Belastung (Abb. 4B). Für die sps Stamm zeigten die Saccharose-Titer mit oder ohne Zugabe von 1 mM IPTG keinen signifikanten Unterschied. Interessanterweise nahm der Saccharose-Titer bei Zugabe von 1 mM IPTG in der sps-spp (Abb. 4B), was darauf hinweist, dass die vollständige Induktion von sps und spp Expression kann schädlich für die Saccharoseproduktion sein.

Engineering des Saccharose-Biosynthesewegs in Synechokokken 2973. (EIN) Schemata zum Ausdrücken der Synechozystis 6803 sps und spp Gene in der 2973-cscB Belastung. (B) Saccharoseproduktion in sps und sps-spp Ausdrucksstämme. Die Zellen wurden in BG11-Medium für 3 Tage ohne Zugabe von NaCl kultiviert. Das „+“-Symbol zeigt an, dass der Stamm das/die angegebene(n) überexprimierte(n) Enzym(e) enthält. Die Daten repräsentieren den Mittelwert ± Standardabweichung von drei biologischen Replikaten. RBS, Ribosomenbindungsstelle.


Die σ ​​70-Untereinheit der RNA-Polymerase induziert lacUV5-Promotor-proximale Transkriptionspause

Die σ ​​70-Untereinheit von Escherichia coli RNA-Polymerase (RNAP) ist ein Transkriptionsinitiationsfaktor, der auch während der Elongation mit RNAP assoziiert werden kann. Wir liefern biochemische Beweise dafür, dass σ 70 eine Transkriptionspause am induziert lacUV5-Promotor, nachdem RNAP ein 17-Nukleotid-Transkript synthetisiert hat. Das σ 70 -abhängige Pausieren erfordert eine Interaktion zwischen σ 70 und einem Teil des lac Repressoroperatorsequenz, die einem Promotor-10-Konsensus ähnelt. Das Polysaccharid Heparin löst die Freisetzung von σ 70 aus den pausierten Komplexen aus, was die Ansicht stützt, dass beim Übergang von der Initiation zur Elongation die Wechselwirkungen zwischen σ 70 und der Kern-RNAP abgeschwächt werden. Wir schlagen vor, dass die Bindung und Retention von σ 70 in Elongationskomplexen durch seine Fähigkeit, Kontakte mit der DNA der Transkriptionsblase zu bilden, stabilisiert wird. Darüber hinaus schlagen wir vor, dass die σ 70-Untereinheit im Elongationskomplex ein Ziel für die Regulation der Genexpression sein könnte.


Embryonale

Klaus I. Matthaei , in Handbook of Stem Cells , 2004

Bakterielles Lac Operon

Die lac Operon im Bakterium Escherichia coli funktioniert durch einen Repressionsmechanismus, bei dem ein Inhibitorprotein (lacI) an regulatorische Stellen bindet (lacO) im Promotor und schaltet die Transkription aus (Abb. 59-2). Bei Zugabe von Lactose erfährt das lacI-Protein eine Konformationsänderung, die seine Bindungsaffinität für die lacO Sequenzen. Das lacI-Protein kommt dabei vom lacO Seiten, und es kann eine Transkription erfolgen. E coli verwendet dieses System, um die für die Verwendung von Laktose erforderlichen Gene streng zu kontrollieren, und es ist vollständig reversibel.

Abbildung 59-2 . Bakterielles lac-Operon. Die lac Operon funktioniert durch einen Repressionsmechanismus. (A) Ein Inhibitorprotein, lacI, bindet an regulatorische Stellen lacO im Promotor (P) und schaltet die Transkription der für den Laktosestoffwechsel benötigten Gene aus. (B) Bei der Zugabe von Lactose erfährt das lacI-Protein eine Konformationsänderung, die seine Bindungsaffinität für die lacO Sequenzen. Das lacI-Protein kommt dabei vom lacO Seiten und Transkription der lac Gene auftreten können. (A, Transacetylase Y, Permease und Z, β-Galactosidase.)


Materialen und Methoden

Xenopus Embryomanipulation

Xenopus Tropicalis Embryonen wurden durch in-vitro-Fertilisation erhalten, in 3% Cystein entjellit und in den gewünschten Stadien gesammelt. Befruchteten Eiern wurden im 1-Zell-Stadium 500 ng synthetische mRNA injiziert und kultiviert, bis Kontrollembryonen das Stadium 8 erreichten. Tierkappen wurden im Stadium 8 explantiert und bis zum Stadium 10,5 in 0,1 × MMR kultiviert. Tiernutzungslizenzen wurden durch die DEC-Genehmigungen RU-DEC 2012–116, 2014–122 und die CCD-Genehmigung AVD1030020171826 bereitgestellt.

Stadien- und gewebespezifische ATAC-seq

Nach dem Demultiplexen wurden die Reads mit fastp v0.20.1 (Chen et al, 2018 ) und ausgerichtet auf die X. Tropicalis genom (xt9.0 und xt10.0) mit bwa-mem v0.7.17 unter Verwendung der Standardeinstellungen. Reads, die auf mitochondriale DNA kartiert wurden, wurden zusammen mit minderwertigen Reads, einschließlich Wiederholungen und Duplikaten (MAPQ < 10), von der Analyse ausgeschlossen. Alle kartierten Reads wurden um + 4 bp für den + Strang und – 5 bp für den – Strang versetzt. Peaks wurden für jede Probe mit MACS2 v2.2.7 (Zhang et al, 2008 ) mit den Parametern „-q 0.05 --nomodel –shift −100 --extsize 200 –keep-dup 1“.

Einzelzell-ATAC-seq

Kerne wurden mit einem von Mariano adaptierten Verfahren isoliert (Mariano, 1964). Kurz, 100 Xenopus Embryonen wurden in 300 µl eiskaltem E1-Puffer (110 mM KCl, 50 mM Tris-HCl pH 7,4, 5 mM MgCl2, 0,1 mM EDTA, 2 mM DTT), enthaltend 0,25 M Saccharose. Zu der Probe wurden 2,4 ml eiskalter E1-Puffer mit 2,2 M Saccharose zugegeben und vorsichtig gemischt. Die Embryosuspension wurde dann in einem SW60 Beckman Polyallomer-Röhrchen auf ein 150 ul Kissen aus eiskalter 2,2 M Saccharose geschichtet. Kerne wurden durch Zentrifugation bei 130.000 . pelletiert g bei 4°C. Das Pellet wurde vorsichtig in 250 µl Kernpuffer (25% Glycerin, 25 mM Tris-HCl pH 7,4, 70 mM KCl, 5 mM MgCl .) resuspendiert2, 0,2 mM EDTA, 2 mM DTT) und die Kerne wurden zweimal gewaschen, indem sie durch ein 20 ul 80%iges Glycerinkissen geschleudert wurden. Nach dem letzten Waschgang wurden die Kerne in 200 µl 1x Nuclei-Puffer (10x Genomics) resuspendiert. Bibliotheken wurden unter Verwendung von Chromium Single Cell ATAC (v1.1 Chemistry 10× Genomics) erstellt. Base-Calling, Demultiplexing und Mapping wurden mit cellranger-atac (v1.2.0, 10× Genomics) durchgeführt. Die Reads wurden dem zugeordnet X. Tropicalis Genom (xt10.0), heruntergeladen von Xenbase (http://www.xenbase.org/, RRID:SCR_003280 Karimi et al, 2018). Sequenzierungs- und Mapping-Statistiken werden in Dataset EV7 präsentiert. Barcodes mit geringer Sequenzabdeckung (Zellen mit < 1.000 Transpositionsfragmenten), geringer Anreicherung (TSS-Anreicherung < 4,5) oder stark variabler Chromosomenabdeckung (eindeutige Fragmente pro Mbp, berechnet pro Chromosom Variationskoeffizient der Chromosomenabdeckung > 1) wurden vom Downstream ausgeschlossen Analyse.

Vorbereitung und Sequenzierung von Einzelzell-RNA- und Gesamt-RNA-Bibliotheken

Sezierte Embryo-Explantate wurden unter Verwendung von Ca 2+ und Mg 2+ freien Medien (Sive et al, 2007). 200 Zellen wurden für die Durchführung einer Einzelzell-RNA-seq unter Verwendung der modifizierten Version des STRT-seq-Protokolls (Islam et al, 2012 Dong et al, 2018 ) ERCC-Spike-in-RNA (Thermo Fisher Scientific, 4456740) wurde dem Lysepuffer zugesetzt. Nach der reversen Transkriptionsreaktion führten wir 4 + 16 Zyklen der PCR-Amplifikation für die cDNA-Synthese durch. Die amplifizierte cDNA wurde mit dem Zymo-Reinigungskit bzw. den Agencourt AMPure XP-Kügelchen gereinigt und ihre Konzentration wurde mit dem Qubit® 2.0 Fluorometer (Q32866, Life Technologies) gemessen. Die Qualität der amplifizierten cDNA und die Verteilung der DNA-Fragmentgröße wurden mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent Technologies) mit dem High Sensitivity DNA Kit (5067-4626, Agilent) bewertet. Die Sequenzierungsbibliotheken wurden mit dem KAPA Hyper Pre-Kit (KR0961 – v6.17, Kapa Biosystems) hergestellt. Die Konzentrationen der Fragmente mit den ungefähr indizierten Adaptern wurden durch Quantifizierung der KAPA-Bibliothek quantifiziert. Die Bibliotheken wurden in der Illumina-Plattform sequenziert und die Daten mit Bowtie (Version: 1.2.2 Langmead & Salzberg, 2012 ) auf die indizierten Dateien des xt9-Genoms (vgl. Datensatz EV7) abgebildet.

Die Gesamt-RNA wurde aus Tierkappen mit unserem hauseigenen angepassten Trizol-Zymo Hybrid-Protokoll extrahiert. Die Konzentrationen aller RNA-Proben wurden mit dem DeNovix dsDNA High Sensitivity Assay (Katalognummer: KIT-DSDNA-HIGH-1) gemessen. Die cDNA wurde unter Verwendung von KAPA RNA HyperPrep mit RiboErase (Katalognummer: 08278555702, Kapa Biosystems) konstruiert. Wir überprüften die Qualität der Proben durch RT-qPCR unter Verwendung von Primern, die kodierende Regionen von Kandidaten- und Housekeeping-Genen umspannen.

ATAC-seq-Datenanalyse

Einzelzell-RNA-seq-Datenanalyse

Der Datensatz wurde gefiltert und auf Zellen und Gene mit dem Paket Scatter (McCarthy et al, 2017). Der gefilterte Datensatz wurde weiter in das R-Paket Seurat (Satija et al, 2015). Die hypervariablen Gene wurden für die Hauptkomponentenanalyse verwendet, aus denen die statistisch signifikanten PCs für die UMAP-Projektion (Dimensionalitätsreduktion) verwendet wurden. Wir identifizierten sieben verschiedene Zellcluster mithilfe der FindClusters-Funktion in Seurat. Basierend auf den vorhergesagten Clustern wurden die für jeden Cluster relevanten Markergene zur weiteren Analyse mit anderen Datensätzen entnommen. Verarbeitung und Visualisierung der gesamten Embryo-Einzelzell-RNA-Sequenzierungsdaten (Briggs et al, 2018) wurden mit Scanpy durchgeführt (Wolf, Angerer & Theis, 2018). Einzelzellcluster der Stufe 10½ AC und DMZ wurden in die Gesamtembryodaten basierend auf Spearman-Korrelationen zwischen den Clustern beider Datensätze platziert, basierend auf der mittleren Cluster-Expression der hypervariablen Gene, die den beiden Datensätzen gemeinsam sind.

Integration von ATAC-seq und Einzelzell-RNA-seq

Top hypervariable Gene (HVGs) aus der scRNA-seq-Analyse wurden unter Verwendung der GREAT-Analyse mit den nächsten AC-DMZ-ATAC-seq-Peaks assoziiert (Fig. 5B und C). Dieses Peak-zu-Gen-Modell bestand aus einer Matrix mit Zeilen als Peak-Positionen und Spalten als Expressionswerte der Zielgene in den sieben Clustern. Dies wurde als Input für die Motivvorhersage unter Verwendung der Gimme-Maelstrom-Funktion von GimmeMotifs verwendet (Preprint: Bruse & Heeringen, 2018). Die mit den vorhergesagten Motiven assoziierten Transkriptionsfaktoren wurden dann basierend auf ihrer Korrelation zwischen der Motivaktivität und ihrer Genexpression über die Cluster hinweg gescreent.

  • Bulk-ATAC-Sequenzierung: GEO-Zugangsnummer GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Einzelzell-ATAC-Sequenzierung: GEO-Zugangsnummer GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Einzelzell-RNA-Sequenzierung: GEO-Zugangsnummer GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).
  • Bulk-RNA-Sequenzierung: GEO-Zugangsnummer GSE145619 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE145619).

Muss ich Saccharose verwenden, um einen Lac-Promotor zu induzieren? - Biologie

a) In Gegenwart hoher Tryptophankonzentrationen werden wegen der Abschwächung der Transkription 5' zu den Strukturgenen nur kurze Transkripte des trp-Operons synthetisiert. Dies wird durch die Erkennung von zwei Trp-Codons in der Leadersequenz vermittelt. Wenn diese Codons zu Amber-UAG-Nonsense-Mutationen mutiert wären, welche Auswirkung hätte dies auf die Regulation des Operons in Gegenwart oder Abwesenheit von Tryptophan? Erklären

Denken Sie daran, dass das t rp -Operon im Gegensatz zum his-Operon sowohl durch Repression als auch durch Dämpfung kontrolliert wird.

Wenn viel trp vorhanden ist, wird das Operon unterdrückt.

Die Wirkung der Nonsense-Mutationen würde sich unter mittleren trp-Spiegeln zeigen, wo der Attenuator normalerweise die Transkriptionsterminationseffizienz moduliert. Normalerweise terminieren bei mittleren trp-Konzentrationen einige Transkripte und einige durchlaufen das Operon, je nachdem, wie schnell die trp-Codons im Leader translatiert werden. Sie zu ändern, um Codons zu stoppen, würde dazu führen, dass die Ribosomen dort zum Stillstand kommen, was einen extremen trp-Aushunger effektiv nachahmt, was zu einer maximalen Expression des Operons führt.

Das trp-Operon würde in Abwesenheit von Tryptophan auf maximalen Niveaus exprimiert werden, da der trp-Repressor ungebunden wäre und die mutierte Leader-Region eine vollständige Expression ermöglichen würde.

b) Ein lacI-lacZ-Fusionsgen wurde identifiziert, das ein chimäres Protein mit sowohl Repressor- als auch ß-gal-Funktion produziert. Welche(n) Lac-Phänotyp(en) würden Sie von einem Stamm erwarten, der dieses Fusionsgen trägt.

Die Mutante sollte die lacZ-Aktivität konstitutiv exprimieren, jedoch in sehr geringen Mengen, da die Expression des Fusionsproteins vom lacI-Promotor gesteuert würde.

Dies wäre phänotypisch Lac – da die Expression auf niedrigem Niveau kein Wachstum auf Lactose erlauben würde. Denken Sie daran, dass es keine Möglichkeit gibt, die Synthese des Fusionsproteins oder des lacY-Gens zu induzieren, da die lac-Promotor-Operator-Region deletiert ist.

c) Wenn ein Hfr-Stamm, der einen Lambda-Prophagen trägt, mit einem nicht-lysogenen Empfänger gepaart wird, wird der Prophagen kurz nach der Übertragung auf den Empfänger zum lytischen Wachstum induziert. Was sagt dies über den Mechanismus aus, durch den der Lambda-Prophage im Bakterienchromosom gehalten wird?

Dies ist genau analog zum PaJaMo-Experiment und weist darauf hin, dass die Lysogenese durch Verdrängung kontrolliert wird.

d) Wenn ein Männchen aus einem P-Stamm von Drosophila mit einem M-Typ-Weibchen gekreuzt wird, sind die Nachkommen normalerweise steril. Wenn ein Männchen vom M- oder P-Typ mit einem Weibchen vom P-Typ gekreuzt wird, sind die Nachkommen fruchtbar.

i) Was bedeutet dies über den Mechanismus, durch den die P-Element-Transposition gesteuert wird?

Dies ist genau analog zum obigen Fall mit Lambda und zum PaJaMo-Expt. Sie bringen P-Elemente in einen M-Zytotyp und erhalten eine Transposition. Umgekehrt oder P in P passiert nichts. Die Kontrolle ist negativ.

ii) Warum sind die Nachkommen der P X &trade M-Kreuzung lebensfähig, aber steril?

Denn die Transposition ist auf die Keimbahn beschränkt. Die Mobilisierung der P-Elemente erfolgt nur in den Gonaden der Nachkommen. Somit sind die Nachkommen somatisch normal, aber wegen der massiven Mobilisierung von P-Elementen in ihren Gonaden unfruchtbar.

F) Ein Lehrassistent vor der Medizin entwickelte ein Experiment, um einer Laborklasse das Konzept der cis-dominanten Mutationen zu demonstrieren. Die TA ließ die Klasse zwei rekombinante Klone in dem Multicopy-Plasmidvektor pBR322 erzeugen. Das erste Plasmid trug die Wildtyp-lac-Promotor-Operator-Region und mutierte Z- und Y-Strukturgene. Das zweite Plasmid trug die Wildtyp-Promotor-Operator-Region und die Z+- und Y+-Gene. Die Plasmide wurden in E. coli-Stämme der Genotypen I + oc Z + Y + und I + oc Z – Y – eingeführt und auf lacZ-Aktivität durch Ausplattieren auf X-gal-Platten mit den folgenden Ergebnissen getestet:

Kolonie-Phänotyp auf X-gal-Platten

I + o + Z + Y + Kontrollstamm

I + o c Z + Y + Kontrollstamm

pBR322 o + Z - Y - / I + o c Z + Y +

pBR322 o + Z + Y + / I + o c Z - Y -

a) Warum waren die Ergebnisse für die TA überraschend?

Der TA erwartete, dass die Belastung in der unteren Reihe der Tabelle induzierbar und nicht konstitutiv ist. Die Ergebnisse in der Tabelle implizieren, dass die oc-Mutation trans-dominant und nicht cis-dominant ist.

b) Was ist schief gelaufen? Geben Sie eine Erklärung für die scheinbar anomalen Ergebnisse.

Das Problem ist auf das Multicopy-Plasmid zurückzuführen. Der TA wollte den diploiden Zustand nachahmen, verwendete jedoch anstelle einer Einzelkopie F' die Mehrfachkopie pBR322. Dies bedeutet, dass die Operatorsequenz in Mehrfachkopie vorhanden war und die begrenzte Menge an Repressor (

10 Moleküle), die im Wildtyp-Stamm vorhanden sind. Somit exprimierten die meisten Plasmide die lacZ- und Y-Gene in der unteren Reihe, was den Anschein erweckte, dass oc in trans wirkt.

c) Schlagen Sie ein Experiment vor, um Ihre Antwort auf Teil b) zu testen.

Falls zutreffend, sollte man in der Lage sein, die Situation nachzuahmen, indem man nur den Wildtyp-Operator (keine Z + - oder Y + -Gene) auf das Plasmid kloniert und diesen in einen Wildtyp-Stamm einführt. Man würde eine konstitutive lac-Expression erwarten, da der Plasmidoperator den Repressor titriert.

Ein zweiter Test würde darin bestehen, das Repressorgen auf dem Mehrfachkopie-Plasmid einzuschließen. In diesem Fall sollte ausreichend Repressor hergestellt werden, um alle o + -Operatoren zu reprimieren, und man würde den cis-dominanten Effekt der oc-Mutation sehen.

Ein dritter Test wäre die Verwendung eines Einzelkopie-Plasmids. Dort wäre die Situation wie bei einem F' und der cis-wirkende Charakter des oc-Allels wäre offensichtlich.

F) Die folgenden drei Grafiken zeigen das Wachstum von E. coli und die Produktion von ß-Galactosidase (lacZ-Produkt) bei Kultivierung in einem Medium mit sowohl Glucose als auch Lactose als Kohlenstoffquellen.

F) Die folgenden drei Grafiken zeigen das Wachstum von E. coli und die Produktion von ß-Galactosidase (lacZ-Produkt) bei Kultivierung in einem Medium mit sowohl Glucose als auch Lactose als Kohlenstoffquellen.

(a) Erklären Sie die Bedeutung des linken Graphen.

Die Grafik veranschaulicht den Prozess des diauxischen Wachstums. Die Zellen nutzen zuerst die bessere Kohlenstoffquelle (Glukose) und verwenden Laktose erst dann, wenn die Glukose aufgebraucht ist. Die lac-Gene bleiben trotz vorhandener Glukose reprimiert, obwohl der Induktor (Laktose) vorhanden ist, und werden erst synthetisiert, wenn Glukose aufgebraucht ist.

(b) Stimmen die in der mittleren und rechten Grafik gezeigten Ergebnisse mit der Vorstellung überein, dass Glucose-Lactose-Diauxie (Katabolitrepression) direkt durch die zelluläre cAMP-Konzentration reguliert wird? Erkläre warum oder warum nicht.

Nein, die Daten stimmen nicht mit der Idee überein. Das mittlere Diagramm zeigt, dass B-gal in Gegenwart von Glucose mit hoher Geschwindigkeit synthetisiert wird, wenn kein Repressorprotein vorhanden ist. Dies weist darauf hin, dass der CRP-cAMP-Komplex auch in Gegenwart von Glucose an den lac-Operon-Promotor gebunden werden muss. Gemäß dem cAMP-Konzentrationsmodell sollten die cAMP-Spiegel in Glucose niedrig sein und somit sollte das lac-Operon selbst in Abwesenheit von Repressor im Wesentlichen ausgeschaltet sein. Die Daten in der rechten Grafik legen im Wesentlichen dasselbe nahe. Bei Zugabe des Induktors IPTG in Gegenwart von Glucose wird das lac-Operon sofort induziert. Dies weist auch darauf hin, dass CRP-cAMP in Gegenwart von Glucose an den lac-Promotor gebunden werden muss.

6) HIV infiziert menschliche Zellen durch einen Prozess, der eine physikalische Wechselwirkung zwischen dem viralen Hüllglykoprotein gp120 und dem CD4-Protein beinhaltet, das auf der Oberfläche vieler Zellen des Immunsystems vorhanden ist. Damit HIV in die Zellen eindringen kann, wird angenommen, dass gp120 auch mit dem ccr-5-Genprodukt (auch bekannt als ckr-5) interagieren muss. Eine alternative Möglichkeit besteht darin, dass das virale Kapsidprotein mit CCR-5 interagiert, nachdem die Zellmembran und die viralen Hüllen fusioniert sind, und dass diese Wechselwirkung dem viralen Kapsid ermöglicht, in das Zytoplasma einzutreten.

a) Schlagen Sie einen Gentest vor, der unterscheidet, ob gp120 oder das Kapsidprotein physisch mit CCR-5 in Kontakt kommt. Skizzieren Sie die Experimente, einschließlich aller Kontrollen, die Sie für nützlich halten, und geben Sie die erwarteten Ergebnisse an, wenn die erste Hypothese zutrifft.

Verwenden Sie das Zwei-Hybrid-System. Fusion von CCR-5 und CD4 mit der lexA-DNA-Bindungsdomäne und gp120 und Kapsidprotein mit der GAL4-Transkriptionsaktivierungsdomäne. Konstruieren Sie ein Reporterkonstrukt, das lacZ unter die Kontrolle eines Hefe-Basalpromotors und lexA-Operatorstellen stellt. Testen Sie die verschiedenen Fusionsproteine, indem Sie die lacZ-Expression betrachten. Hohe Konzentrationen an ß-gal-Aktivität weisen auf eine positive Wechselwirkung zwischen dem an die DNA-Bindungsdomäne fusionierten Protein und dem an die Aktivierungsdomäne fusionierten Protein hin.


Arten von induzierbaren Promotoren

Chemische Mittel, Temperatur und Licht sind alles Beispiele für Faktoren, die zur Induktion eines Promotors führen können. Nachfolgend finden Sie eine kurze Beschreibung dieser drei Arten von induzierbaren Promotoren und Beispiele für jeden Typ. Viele dieser Promotorsysteme sind bei Addgene erhältlich!

Chemisch induzierbare Promotoren

Chemisch regulierte Promotoren gehören zu den am häufigsten induzierbaren Promotoren. The positive inducible tetracycline ON (Tet-On) system, a versatile tool developed for use in prokaryotes and eukaryotes, works via direct activation. In diesem System ist die activator rtTA (reverse tetracycline-controlled transactivator) is normally inactive and cannot bind the tetracycline response elements (TRE) in a promoter. Tetracycline and its derivatives serve as inducing agents to allow promoter activation.

One of the most commonly used prokaryotic promoters is the negative inducible pLac promoter. This promoter requires removal of the lac repressor (lacI protein) for transcription to be activated. In the presence of lactose or lactose analog IPTG, the lac repressor undergoes a conformational change that removes it from lacO sites within the promoter and ceases repression of the target gene. A simplified lac inducible system is found in many bacterial expression vectors.

Negative inducible promoter pBad is another popular prokaryotic promoter often used for bacterial protein purification. When arabinose is absent, regulatory protein AraC binds O and I1 sites upstream of pBad, blocking transcription. The addition of arabinose causes AraC to bind I1 and I2 sites, allowing transcription to begin. In addition to arabinose, cAMP complexed with cAMP activator protein (CAP) can also stimulate AraC binding to I1 and I2 sites. Supplementing cell growth media with glucose decreases cAMP and represses pBad, decreasing promoter leakiness.

Other examples of chemically induced promoters include positive inducible Alkohol und steroid regulated promoters commonly used in plant research.

Temperature inducible promoters

Temperature sensitive expression systems are typically less leaky than chemically induced promoters they show near-zero expression at regular temperatures but can be induced by heat or cold exposure. Examples include the heat shock-inducible Hsp70 or Hsp90-derived promoters, in which a gene of choice is only expressed following exposure to a brief heat shock. In the case of Hsp70, the heat shock releases heat shock factor 1 (HSF-1), which subsequently binds to heat shock elements in the promoter, thereby activating transcription. Addgene depositors have developed heat shock-inducible Cre and Cas9 for easy genome engineering in species like C. elegans and Drosophila.

Light inducible promoters

Light is another way to activate gene expression, and two-component systems used in synthetic biology use light to regulate transcription. Red flame plasmid pDawn contains the blue-light sensing protein YFI. When light is absent, YFI phosphorylates FixJ, which binds to the FixK2 promoter to induce transcription of the phage repressor cI. Repressor cI inhibits transcription from phage promoter pR, preventing expression of a reporter gene. When light is present, YFI is inactive, preventing repressor cI synthesis and allowing reporter gene transcription to take place. Addgene also has yellow flame light-regulated two component systems designed by the Tabor lab.


Diese Arbeit wurde durch Stipendien des National Key R&D Program of China (2018YFA0900600), der National Natural Science Foundation of China (31788103, 31971370 und 31900301), der Chinese Academy of Sciences (QYZDY-SSW-SMC030) und des F&D Program in . unterstützt Schlüsselbereiche der Provinz Guangdong (2018B020202005).

Sinian Xing und Kunling Chen trugen gleichermaßen zu dieser Arbeit bei.

Mitgliedschaften

State Key Laboratory of Plant Cell and Chromosom Engineering, Center for Genome Editing, Institute of Genetics and Developmental Biology, Innovation Academy for Seed Design, Chinese Academy of Sciences, Peking, China

Sinian Xing, Kunling Chen, Haocheng Zhu, Rui Zhang, Huawei Zhang und Caixia Gao

College of Advanced Agricultural Sciences, University of Chinese Academy of Sciences, Peking, China