Information

Wofür steht die 34/70 in Saccharomyces pastorianus Weihenstephan 34/70?


Ich habe überall gesucht.
Keine Wikipedia-Seite.
Keine Informationen über NCBI.
Ich habe alle Vorkommen von 34/70 in einigen Primärforschungsartikeln durchsucht!
Das Beste, was ich gefunden habe, ist dieses Brauereiforum, in dem jemand die gleiche Frage gestellt hat.

Und der User rockfish42 antwortete:

Keine Ahnung, warum sie diese Nummer verwenden, aber es ist die Katalognummer der Hefebank Weihenstephan.


Ich ging auf die Website der Yeastbank in Weihenstephan, um einige Informationen zu erhalten. Das Schlüsselwort hier ist "Stamm", was auf Deutsch für Stamm, Klade, Clan oder Stamm steht. Ich würde das also so verstehen, dass die 34/70 ein Isolat (#70) der Sorte 34 ist. Zwei der Stärken der 34/70, laut dem obigen Link, sind sauberes Bier und ergeben ein angenehmes Geschmacksprofil aufgrund seiner geringes hefeartiges Aroma im fertigen Bier. Das kann ich aus erster Hand bestätigen, da ich in seiner Heimatstadt Freising schon mehrfach das Vergnügen hatte, das Weihenstephaner Bier zu trinken.


Ich bin mir nicht sicher, warum Sie sagen, dass es keine Informationen gibt… eine schnelle Google-Suche ergab ein paar interessante Seiten…

In diesem Papier:

Fortschritte im Metabolic Engineering von Saccharomyces cerevisiae - Nevoigt, Microbiol Mol Biol Rev. 2008

der Autor sagt:

Die Identifizierung der gesamten genomischen Sequenz eines häufig verwendeten Lagerbierhefestamms, d. h. Weihenstephan Nr. 34 (34/70), stellt einen Durchbruch in der molekularen Analyse von Lagerbierhefe dar.

Es sieht also so aus, als wäre 34/70 nur eine Katalognummer ohne spezifische Bedeutung.

Seltsamerweise laut Wikipedia-Seite auf Saccharomyces pastorianus:

S. pastorianus wächst nie über 34 °C (93 °F)

Ich kann also die Hypothese nicht ausschließen, dass 34 von dort kommen könnte, obwohl ich persönlich für die Katalognummer plädiere.

Weitere interessante Links:

Das Papier über die S. pastorianus Genomsequenzierung:
Genomsequenz der Lagerbierhefe, einem Interspezies-Hybrid. - Nakao et al., DNA Res. 2009

Ein Artikel, der zwei verschiedene Stämme von vergleicht S. pastorianus, 34/70 und 34/78 (wieder scheint die Katalognummernhypothese die naheliegendste Erklärung zu sein)

Molekulare Spezies von Phosphatidylethanolamin aus kontinuierlichen Kulturen von Saccharomyces pastorianus syn. Carlsbergensis-Stämme. - Tosch, Hefe. 2006

Die NCBI-Taxonomieseite (Eintrag #520522)


Saccharomyces pastorianus: genomische Erkenntnisse, die Innovationen für die Industrie inspirieren

Eine Kombination von biologischen und nicht-biologischen Faktoren hat zu den interspezifischen Hybridhefearten geführt Saccharomyces pastorianus zu einem der wichtigsten Industrieorganismen der Welt. Diese Hefe wird bei der Herstellung von Lagerbieren verwendet, deren Gärung im Vergleich zu anderen industriellen Gärungsverfahren sehr niedrige Temperaturen erfordert. Diese Gruppe von Organismen hat sowohl von der Duplikation des gesamten Genoms in ihrer Vorfahrenlinie als auch von dem anschließenden Hybridisierungsereignis zwischen profitiert S. cerevisiae und S. eubayanus, was zu einer starken fermentativen Fähigkeit führt. Der Hybrid hat Schlüsselmerkmale, wie Kältetoleranz und gute Fähigkeit zur Verwertung von Maltose und Maltotriose, die entweder von der Elternart geerbt wurden oder aus genetischen Interaktionen zwischen den Elterngenomen stammen. Die Instabilität im entstehenden allopolyploiden Hybridgenom kann zu einer schnellen Evolution der Hefe beigetragen haben, um Bedingungen zu tolerieren, die in der Brauumgebung vorherrschen. Die jüngste Entdeckung von S. eubayanus hat neue Einblicke in die Evolutionsgeschichte von S. pastorianus und kann neue Möglichkeiten für die Erzeugung neuer industriell vorteilhafter Lagerhefestämme bieten. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.


EINLEITUNG

Studien zu induzierbaren homologen Promotoren zur Regulation der Genexpression in selbstklonierenden Hefen sind begrenzt. Die bisherige Forschung konzentriert sich hauptsächlich auf die Induktion, die durch Zusatzstoffe wie Kupfer und Galactose ausgelöst wird (West, Yocum und Ptashne 1984, Labbe und Thiele 1999, Farhi et al. 2006) oder Induktion, die während der sequentiellen Verwendung von Kohlenhydraten auftritt (Lagunas 1993). Der Zusatz von Stoffen wie Kupfer oder Galactose ist für die Lebensmittel- und Getränkeindustrie nicht zulässig deren Verwendung ist in der Unionsliste der Lebensmittelzusatzstoffe (Kommissionsverordnung Nr. 1129/2011) geregelt. Darüber hinaus unterscheiden sich die Kohlenhydrat- und freien Aminostickstoff (FAN)-Zusammensetzungen der Würze von Stock zu Stock (Lea, Piggott und Piggott 2003). Daher ist die Verwendung von durch diese Bedingungen induzierten Promotoren nicht günstig.

Die Stressantworten von Hefen und die damit verbundene Genregulation könnten eine Option sein, um die Induktion der Genexpression während der industriellen Fermentationsverfahren erfolgreich zu steuern. Industriehefen passen sich während des Fermentationsprozesses unterschiedlichen Belastungen an, darunter Belastungen wie osmotischer Druck, unzureichende Zufuhr von FAN, Temperaturverschiebungen und erhöhte Ethanolkonzentrationen, insbesondere unter industriellen Bedingungen (Gibson et al. 2007). Diese Anpassung wird durch verschiedene Stress-Antwort-Gene erzeugt, die durch Transkriptionsfaktor-Bindungsstellen an ihren Promotoren und Transkriptionsfaktoren reguliert werden, einschließlich des Stress-Antwort-Elements, das Msn2/4-Transkriptionsfaktoren bindet, des Hitzeschock-Elements, das von Hsf1 . gesteuert wird und das AP-1-responsive Element, das an die Transkriptionsfaktoren Gcn4 und Yap bindet (Estruch 2000 Kandror et al. 2004 Aguilera, Randez-Gil und Prieto 2007 Ma und Liu 2010 Schade et al. 2004). Nur wenige Studien haben sich auf die Genregulation während des Wechsels zu kalten oder nahe dem Gefrierpunkt konzentriert (Kondo und Inouye 1991 Kowalski, Kondo und Inouye 1995 Sahara, Goda und Ohgiya 2002 Becerra et al. 2003 Homma, Iwahashi und Komatsu 2003 Schade et al. 2004 Murata et al. 2006) oder hohe Temperaturen (Estruch 2000 Izawa et al. 2008). Gene, die an der Trehalose- und Glykogenproduktion beteiligt sind, werden während des Wechsels zu niedriger Temperatur hochreguliert (TPS1 und TPS2), ebenso wie Gene, die mit Zellwand-Mannoproteinen assoziiert sind (TIP-verwandte Gene). Eine 2-fache Zunahme der Induktion von TPS1, TPS2, UBI4 und SSA3 wurde nach einer Temperaturverschiebung auf 10 °C berichtet (Sahara, Goda und Ohgiya 2002). Die Exposition gegenüber 4°C führt zu einer >2-fachen Hochregulierung von TIR1, TIR2, TPS1, TIP1 und SSA3 (Homma, Iwahashi und Komatsu 2003). Eine weitere Analyse der Genexpression nach Temperaturverschiebungen in die Nähe des Gefrierpunkts (4 °C) zeigt die höchste Expression von TIR1 und TIR2 zu Beginn der Schocksituation (mit einer Veränderung von 9,0 bzw. 6,2 nach 6 h), mit viel kleinere Faltenänderungen von 3,2 bzw. 1,9 nach 48 h (Murata et al. 2006). Darüber hinaus werden TIR1 und TIR2 stark durch eine Temperaturabnahme induziert, was mit ihrer geringen basalen Expression während der Fermentation übereinstimmt (Kowalski, Kondo und Inouye 1995). Außerdem werden beim Kälteschock Gene aus der Familie der Hitzeschockproteine ​​(HSP) induziert (Homma, Iwahashi und Komatsu 2003 Murata et al. 2006 et al. 2008). Diese Proteine ​​fungieren als molekulare Chaperone, um geschädigte Proteine ​​neu zu falten, thermisch geschädigte Proteine ​​vor Aggregation zu schützen und zur Umstrukturierung der Zellwand beizutragen (Verghese et al. 2012). Eine höhere Ethanolkonzentration führt auch zu Stress, der mit einer induzierten Genexpression verbunden ist. Es wurde berichtet, dass mindestens 4 % (v/v) Ethanol für eine bemerkenswerte Induktion der HSP-Expression erforderlich sind (Piper et al. 1994 Piper 1995). Untergruppen von HSP-Genen zeigen jedoch ideale Expressionsmuster bei unterschiedlichen Ethanolkonzentrationen (Piper et al. 1994). Außerdem wurde der Promotor von TPS1 für die Ethanol-induzierte Hefeflockung verwendet (Li et al. 2012).

Selbstklonierende Hefen bieten verschiedene Vorteile für die industrielle Anwendung bei der Lebensmittel- und Getränkeherstellung. Beispielsweise konzentrierte sich die Forschung zur Würzefermentation auf eine verbesserte Ausflockung nach der Fermentation (Ishida-Fujii et al. 1998), verkürzte Reifezeit (Kusunoki und Ogata 2012) und verbesserter Glutathiongehalt und Schaumstabilität (Wang, He und Zhang 2007 Wang et al. 2008, 2009). Im Gegensatz zur genetischen Veränderung entstehen beim Selbstklonen keine gentechnisch veränderten Organismen (Fischer, Procopio und Becker 2013). Aufgrund der Selbstklonierung werden nur homologe Nukleinsäuren verwendet. Bei der Bierhefe konzentriert sich die Forschung nicht stark auf den Lagerhefestamm Saccharomyces pastorianus div. carlsbergensis diese Sorte trägt jedoch zu 90% zum weltweiten Biermarkt bei (Kodama, Kielland-Brandt und Hansen 2006 Saerens, Duong und Nevoigt 2010). Die Lagerhefe ist eine allotetraploide Hybride der Bierhefe S. cerevisiae und ein S. eubayanus Stamm (Bing et al. 2014) und aufgrund der genetischen Unterschiede zur Bierhefe sind weitere Untersuchungen notwendig.

In der vorliegenden Studie wurden insgesamt 10 verschiedene native Promotoren von temperaturinduzierten Genen während des Brauprozesses evaluiert. Neben Promotoren der HSP-Genfamilie (Fischer et al. 2016) wurden auch Promotoren der TIP-verwandten Genfamilie aufgrund der Vielzahl der Ergebnisse zu Temperaturverschiebungen in die Nähe des Gefrierpunkts durch Laborhefen, wie oben erwähnt, berücksichtigt. Neben der Induktion dieser Promotoren durch unterschiedliche Temperaturverschiebungen wurde auch der Einfluss unterschiedlicher Ethanolgehalte untersucht. Um die Genregulation während dieser Stresssituationen zu verstehen, wurde eine auf Enhanced Green Fluorescence Protein (EGFP) basierende Methode unter industriellen Fermentationsbedingungen (Fischer et al. 2016).


Ausblick

Basierend auf den neuen Erkenntnissen ist es in Finnland Anfang 2015 gelungen, durch künstlich erzeugte Hybridisierung von S. eubayanus mit S. cerevisiae . Es ist zu hoffen, dass eine breite Auswahl an Ausgangsstämmen der beiden Elternarten zu bisher nicht erreichten günstigen Eigenschaften der neuen Typen führt: Verarbeitung von Maltotriose , Produktion höherer Alkohole als aromatische Träger usw. Neue Hybridisierungen dieser beiden oder anderer Saccharomyces ist damit zu rechnen, dass sich das Angebot an untergärigen Bieren in Zukunft deutlich erweitern wird, auch wenn Saccharomyces eubayanus selbst sollte keine kommerzielle Nutzung finden.


Dothideomyceten Bearbeiten

  • Aureobasidium pullulans, A. melanogenum, A. subglacialeund A.Namibia, polyextremotolerant (2014 [1] )
  • Hortaea werneckii, extrem halotolerant (2013 [2] 2017 [3] )
  • Leptosphaeria maculans, Pflanzenpathogen (2011 [4] )
  • Macrophomina phaseolina, Pflanzenpathogen (2012 [5] )
  • Mycosphaerella fijiensis, Pflanzenpathogen (2007 [6] )
  • Mycosphaerella graminicola IPO323, Weizenpathogen (2008 [7] )
  • Phaeosphaeria nodorum SN15, Weizenerreger (2005 [8] )
  • Pyrenophora tritici-repentis Pt-1C-BFP, Weizenpathogen (2007 [9] )

Eurotiomyceten Bearbeiten

  • Ajellomyces capsulatamehrere Stämme, Morbus Darling (2009, unveröffentlicht [10] )
  • Ajellomyces dermatitidismehrere Stämme (2009, unveröffentlicht. [11] )
  • Arthroderma benhamiaeCBS 112371, Hautinfektion (2010, unveröffentlicht [12] )
  • Arthroderma GipsCBS 118893, Fußpilz (2008 [13] )
  • Arthroderma otaeCBS 113480, Fußpilz (2008 [13] )
  • Aspergillus aculeatus ATCC16872, industrielle Verwendung (2010 [14] )
  • Aspergillus carbonarius ITEM 5010, Lebensmittelpathogen (2009 [15] )
  • Aspergillus clavatus Stamm:NRRL1 (2008 [16] )
  • Aspergillus fumigatus Stamm:A1163, humanpathogen (2008 [16] )
  • Aspergillus fumigatus Stamm:Af293, humanpathogen (2005 [17] )
  • Aspergillus kawachii IFO 4308, Lebensmittelindustrie (2011 [18] )
  • Aspergillus nidulans Stamm:FGSC A4, Modellorganismus (2005 [19] )
  • Aspergillus niger Stamm:ATCC 1015 (DOE Joint Genome Institute)
  • Aspergillus niger Stamm:CBS 513.88, industrielle Verwendung (2007 [20] )
  • Aspergillus oryzae Stamm:RIB40, industrielle Verwendung (2005 [21] )
  • Aspergillus terreus NIH 2624, Statin-Produzent und Erreger (2005, unveröffentlicht [22] )
  • Coccidioides immitis, humanpathogen, Talfieber (2009 [23] )
  • Coccidioides posadasiiC735 Delta-SOWgp, humanpathogen, Talfieber (2009 [23] )
  • Neosartorya fischeri Stamm:NRRL181 (2008 [16] )
  • Paracoccidioides brasiliensis, mehrere Stämme, humanpathogen (2007 [24]
  • Penicillium chrysogenum Stamm: Wisconsin54-1255, industrielle Verwendung (2008 [25] )
  • Penicillium digitatum Stamm PHI26 (2012 [26] )
  • Penicillium digitatum Stamm Pd1 (2012 [26]
  • Talaromyces marneffei, humanpathogen (2011 [27]
  • Uncinocarpus reesii (2009 [23] )

Leotiomyceten Bearbeiten

  • Blumeria graminis ffsp hordei Stamm:DH14, Pflanzenpathogen (2010)
  • Botrytis cinerea (Botryotinia fuckeliana) Stamm:B05.10 und T4, Pflanzenpathogen (2011 [28] )
  • Glarea lozoyensis (2012 [29] )
  • Sklerotinia sclerotiorum Stamm: 1980 (2011 [28] )
  • Ascocoryne-Sarkoide Stamm: NRRL50072 (2012 [30] )

Pezizomyceten Bearbeiten

Saccharomyceten Bearbeiten

  • Ashbya gossypii Stamm:ATCC 10895, Pflanzenpathogen (2004 [33] )
  • Candida albicans Stamm:SC5314, humanpathogen (2004 [34] )
  • Candida albicans Stamm:WO-1, humanpathogen (2009 [35] )
  • Candida dubliniensis CD36, humanpathogen (2009 [36] )
  • Candida glabrata Stamm:CBS138, humanpathogen (2004 [37] )
  • Candida guilliermondii, humanpathogen (2009 [35] )
  • Candida lusitaniae, humanpathogen (2009 [35] )
  • Candida-Parapsilose, humanpathogen (2009 [35] )
  • Candida orthopsilosis'', humanpathogen (2012 [38] )
  • Candida Tropicalis, humanpathogen (2009 [35] )
  • Debaryomyces hansenii Stamm:CBS767, industrielle Verwendung (2004 [37] )
  • Debaryomyces hansenii Stamm:MTCC 234, salztolerant (2012 [39] )
  • Dekkera bruxellensis Stamm:CBS2499, Weinhefe (2012 [40] )
  • Hansenula polymorpha NCYC 495 leu1.1, industrielle Verwendung (2010 [41] )
  • Kluyveromyces aestuariiATCC 18862 (2010, unveröffentlicht. [42] )
  • Kluyveromyces lactis Stamm:CLIB210, industrielle Verwendung (2004 [37] )
  • Kluyveromyces wickerhamiiUCD 54-210 (2010, unveröffentlicht. [43] )
  • Lachancea kluyveri (Saccharomyces kluyveri) NRRL Y-12651, Pflanzenpathogen (2009 [44] )
  • Lodderomyces elongisporus, humanpathogen (2009 [35] )
  • Naumovozyma castellii Stamm:AS 2.2404, CBS 4309 (Saccharomyces castellii 2003, [45] 2011 [46] )
  • Naumovozyma dairenensis Stamm: CBS 421 (2011 [46] )
  • Saccharomyces bayanus (2003, [45][47] 2011 [48] )
  • Saccharomyces arboricolus (2013, [49] )
  • Saccharomyces cerevisiae Stamm:JAY291, Industrie/Modell (2009 [50] )
  • Saccharomyces cerevisiae Stamm:S288C, Industrie/Modell (1996 [51] )
  • Saccharomyces cerevisiae Stamm: Sigma1278b, industriell/Modell (2010 [52] )
  • Saccharomyces kudriavzevii (2003 [45][48] )
  • Saccharomyces mikatae (2003, [45][47] 2011 [48] )
  • Saccharomyces paradoxus (2003 [47] 2009 [53] )
  • Saccharomyces pastorianusWeihenstephan 34/70, industriell, Bier (2009 [54] )
  • Scheffersomyces-Stipitis (Pichia stipitis) CBS 6054, Lignin/Xylose-Abbaustoff (2007 [55] )
  • Spathaspora passalidarum NRRL Y-27907, Modell Xylose-Fermenter (2010 [56] )
  • Tetrapisispora phaffii van der Walt Y 89, CBS 4417 (2011 [46] )
  • Torulaspora delbrueckii Stamm:Wallerstein 129, CBS 1146 (2011 [46] )
  • Vanderwaltozyma polysporaDSM 70294 (2007 [57] )
  • Yarrowia lipolytica Stamm:CLIB99, industrielle Verwendung (2004 [37] )
  • Zygosaccharomyces rouxii Stamm CBS732, Lebensmittelverderber (2009 [58] )

Schizosaccharomyceten Bearbeiten

  • Schizosaccharomyces japonicus yFS275, Modell für invasives Wachstum (2006 [59] )
  • Schizosaccharomyces pombe Stamm:972h, Modell-Eukaryot (2002 [60] )

Sordariomyceten Bearbeiten

  • Colletotrichum graminicola, Mais-Erreger (2012 [61] )
  • Colletotrichum higginsianum, Arabidopsis thaliana Erreger (2012 [61] )
  • Chaetomium cochliodes Stamm:CCM F-232, Bodenpilz (2016 [62] )
  • Chaetomium globosum Stamm: CBS 148.51, Bodenpilz (2005 [63] )
  • Chaetomium thermophilum Stamm:CBS 144.50, Bodenpilz (2011 [64] )
  • Fusarium oxysporum F. sp. lycopersici 4287, Human-/Pflanzenpathogen (2010 [65] )
  • Gibberella moniliformis 7600, Pflanzenpathogen (2010 [65] )
  • Gibberella zeae PH-1, Pflanzenpathogen (2008 [66] )
  • Gaeumannomyces graminis triticiR3-111a-1 (2010, unveröffentlicht. [67] )
  • Grosmannia clavigera kw1407, Pflanzenpathogen (2011 [68] )
  • Magnaporthe grisea, Pflanzenpathogen (20054 [69] )
  • Metarhizium acridum CQMa 102 und
  • Metarhizium anisopliae ARSEF 23, Insektenpathogene (2011 [70] )
  • Neurospora crassa, Modell-Eukaryot (2003 [71] )
  • Neurospora tetrasperma FGSC 2508 Matte A, Modell (2010 [72] )
  • Nectria haematococcaMPVI, Kunststoff-/Schädlings-/Ligninabbauer (2009 [73] )
  • Podospora anserina:S-Matte+[74]
  • Sporotricum thermophil, thermophiler Celluloseabbauer (2010 [75] )
  • Thielavia terrestris, Modell thermophil/industriell (2010 [76] )
  • Trichoderma atrovirid, Industrie/Boden, (2010 [77] )
  • Trichoderma reeseiQM6a, Biomasse abbauend (2008 [78] )
  • Trichoderma virens Gv29-8, industriell/pathogen (2007 [79] )
  • Verticillium albo-atrum VaMs.102, Pflanzenpathogen (2008, unveröffentlicht [80] )

Agaricomyceten Bearbeiten

  • Agaricus bisporus var. Bisporus Stamm:H97, Champignon (2009 [81] )
  • Agrocybe aegerita, ack Pappel oder Schwertgürtelpilz (2018 [82] ) )
  • Auricularia delicata (2012 [83] )
  • Auricularia heimuer, Chinesische Auricularia (2019 [84] )
  • Coniophora puteana (2012 [83] )
  • Coprinopsis cinerea (Coprinus cinereus), Modellorganismus für vielzellige Pilze (2010 [85] )
  • Dichomitus squalens (2012 [83] )
  • Fibroporia radiculosa Stamm:TFFH 294 (2012 [86] )
  • Fomitiporia mediterranea (2012 [83] )
  • Fomitopsis pinicola (2012 [83] )
  • Gloeophyllum trabeum (2012 [83] )
  • Hebeloma cylindrosporumhttp://genome.jgi.doe.gov/Hebcy2/Hebcy2.home.html
  • Heterobasidion annosum, Pflanzenpathogen (2009 [87] )
  • Laccaria zweifarbig Stamm:S238N-H82, Mykorrhiza (2008 [88]), Shiitake-Pilz (2016 [89])
  • Moniliophthora perniciosa, Hexenbesenkrankheit des Kakaos (2008 [90] )
  • Phanerochaete chrysosporium Stamm:RP78, Mycoremediation (2004 [91] )
  • Piriformospora indica Endophyt (2011 [92] )
  • Pleurotus ostreatus, industrieller/Ligninabbauer (2010 [93] )
  • Pleurotus Knollenregium, Weißfäulepilz (2018 [94] )
  • Postia placenta, Zelluloseabbauer (2008 [78][95] )
  • Punctularia strigosozonata (2012 [83] )
  • Gemeinde Schizophyllum, Pilz (2010 [96] )
  • Serpula lacrymans, Pflanzenpathogen (2011 [97] )
  • hirsutum des stereums (2012 [83] )
  • Trametes versicolor (2012 [83] )
  • Wolfiporia Kokos (2012 [83] )

Pucciniomycetes (ehemals Urediniomycetes) Bearbeiten

  • Melampsora laricis-populina, Erreger von Populars (2008 [98] )
  • Puccinia graminis F. sp. tritici, Pflanzenpathogen (2011 [99][100][101] )
  • Puccinia triticina 1-1 BBBD Rasse 1, Erreger von Weizen( [101] )
  • Rhodotorula graminis Stamm WP1, Pflanzensymbionten (2010 [102] )
  • Sporobolomyces roseus, assoziiert mit Pflanzen ( [103] )

Tremellomyceten Bearbeiten

  • Cryptococcus (Filobasidiella) neoformans JEC21, humanpathogen (2005, [104] andere Stämme unveröffentlicht [105] )
  • Dakryopinax sp. (2012 [83] )
  • Tremella mesenterica (2012 [83] )

Ustilaginomyceten Bearbeiten

  • Malassezia globosa CBS 7966, Schuppen-assoziiert (2007 [106] )
  • Malassezia restriktiv CBS 7877, Schuppen-assoziiert (2007 [106] )
  • Sporisorium rellianum, Pflanzenpathogen (2010 [107] )
  • Ustilago maydis, Pflanzenpathogen (2006 [108] )

Wallemiomyceten Bearbeiten

Chytridiomycota umfasst Pilze mit Sporen, die Geißeln (Zoosporen) aufweisen und sind eine Schwestergruppe zu fortgeschritteneren Landpilzen, denen Geißeln fehlen. Mehrere Chytrid-Arten sind Krankheitserreger, deren Genome jedoch noch nicht sequenziert wurden.


Selbstklonende Bierhefe: eine neue Dimension in der Getränkeherstellung

Seit Mitte der 1990er Jahre hat die Biotechnologie Fortschritte gemacht und der Einsatz gentechnisch veränderter Hefen bei der Herstellung von fermentierten Getränken und der Herstellung von Bioethanol immer stärker in den Fokus gerückt. Hefe ist der primäre Mikroorganismus für fermentierte Getränke wie Bier, Wein und Sake. Bestehende Einzelstämme werden jedoch zukünftige Anforderungen an eine effiziente und qualitativ hochwertige Fermentation nicht vollständig erfüllen. In diesem Fall haben mehrere Forschungsgruppen an gentechnischen Veränderungen der Hefe gearbeitet, um eine zeitgemäße Anwendung zu schaffen. Gentechnisch veränderte Organismen (GVO) wie Hefe, Nutzpflanzen und Pflanzen in der Lebensmittel- und Getränkeproduktion sind vom Verbraucher nicht erwünscht. Eine mögliche Lösung, um die Abneigung der Verbraucher gegenüber Produkten zu überwinden, die als GVO enthaltend gekennzeichnet sind, könnte die Anwendung von selbstklonierenden Hefen sein. Somit erfolgt die Modifikation des Genoms konnotiert ohne heterologe DNA. Diese Übersicht gibt einen Überblick über die aktuelle Forschung zum Einsatz von Selbstklonierungshefe in der Brau-, Wein-, Backwaren- und Sake-Produktion. Das Hauptaugenmerk dieser Arbeit liegt auf den Möglichkeiten der Promotorverwendung und der Konstruktion von Selbstklonierungshefen und dem Monitoring von Selbstklonierungshefen.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Malz
68,4% — Mekka-Grade Estate Malt Pelton: Gerstenmalz nach Pilsner-Art — Getreide — 1,8 SRM
26,1% — Weyermann Barke Pilsner — Getreide — 1,8 SRM
4,7%) — BestMalz Chit Malt — Getreide — 1,3 SRM
0,9%) — Weyermann Caramunich II — Getreide — 63 SRM

Sonstiges (RO-Wasser)
1,25 g — Calciumchlorid (CaCl2) — Maische
1,25 g — Konservensalz (NaCl) — Maische
2 g — Bittersalz (MgSO4) — Maische
2,1 g — Gips (CaSO4) — Maische
8,5 ml — Milchsäure 88% — Maische

Maische
Proteinpeptidase — 126 °F — 10 min
Temperatur — 151 °F — 40 min
Ausmaischen — 171 °F — 10 min

Hopfen
2,5 oz (22 IBU) — Tettnang 3,5% — Kochen — 60 min
1,75 oz (15 IBU) — Tettnang 3,5% — Kochen — 45 min
1,25 oz (1 IBU) — Hersbrucker 2,3% — Aroma — 20 min Hopfenstand bei 180 °F
1,25 oz (2 IBU) — Tettnang 3,5% — Aroma — 20 min Hopfenstand bei 180 °F

Trockenhopfen
0,53 oz — Tettnang 4,5% — Trockenhopfen — Tag 2
0,53 oz — Tettnang 3,5% — Trockenhopfen — Tag 2
1,2 oz — Hersbrucker 2,3% — Trockenhopfen — Tag 10
1,2 oz — Tettnang 3,5% — Trockenhopfen — Tag 10

Hefe
Fermentis W-34/70 und Tum 35

Fermentation
Primär — 53 °F — 7 Tage
Primär — 58 °F — 3 Tage
Konditionierung — 33 °F — 14 Tage


Ergebnisse

Analyse der Maltose- und Maltotriose-Verwertung durch Saccharomyces Stämme

Um die Nutzungsmuster von Maltose und Maltotriose einer größeren Anzahl von Labor- und Industriehefestämmen zu analysieren und gleichzeitig den hohen Preis von Maltotriose zu berücksichtigen, haben wir uns entschieden, 96-Well-Mikrotiterplatten und einen Tecan GENios-Reader zu verwenden, um Wachstumskurven für die 53 verschiedene Hefestämme, die in den Tabellen 1 und 2 beschrieben sind. Zu diesen Hefestämmen gehörten neun Labor- und 20 Industriehefestämme S. cerevisiae Stämme, sowie eine S. bayanus und drei S. cerevisiae × S. bayanus Hybriden und 20 Lagerbier-Sorten der Art S. pastorianus. Alle analysierten Stämme verwerteten Maltose effizient und erreichten mit dieser Kohlenstoffquelle nach 15–30 h Inkubation die stationäre Wachstumsphase, obwohl die Wachstumsrate und die maximal erreichte OD je nach analysiertem Stamm unterschiedlich stark variierten (Abb. 1) .

Wachstum auf YP-reichem Medium, das 2% Maltose (linkes Bild) oder Maltotriose (rechtes Bild) enthält, durch repräsentative Hefestämme (a) der Gruppe 1 (G1) oder (b) der Gruppe 2 (G2) und Gruppe 3 (G3 .) ). G1: () 1403-7A () CBS1513 () CBS1260 () DBVPG6283 () WY2124 und () CLIB180 G2: () LCM001 () SA-1 und () CBS1503 G3: () LCM003 () CBS1486 und () GDB- 379.

Es wurden jedoch drei verschiedene Wachstumsmuster während der Maltotriose-Verwertung durch dieselben Hefezellen beobachtet. Die 27 Stämme der Gruppe 1 – Zellen, die sowohl Maltose als auch Maltotriose effizient als Kohlenstoffquellen für das Wachstum nutzten (Abb. 1a) – umfassten nur neun der 29 S. cerevisiae Stämme (zwei Labor-, sechs Bäcker- und ein Bierbrauhefestamm), aber die Mehrheit (17 von 20) der S. pastorianus Lagerbierhefe und auch die S. pastorianus (monacensis) Brennhefe (Tabelle 3). Alle diese Stämme erreichten die stationäre Wachstumsphase nach 15–30 h Inkubation in Gegenwart von Maltotriose, und die Analyse der Ethanolproduktion durch mehrere Stämme dieser Gruppe 1 zeigte eine effiziente Maltose- und Maltotriose-Fermentation mit Ethanolkonzentrationen von 5–7 gl –1 zum Zeitpunkt der Zuckererschöpfung aus dem Medium (Daten nicht gezeigt).

Gruppe 1 Effiziente Maltose- und Maltotriose-Verwertung
Stämme 1403-7A CEN.PK2-1C G11 G13 G14 G15 G30 G35 GSY924 CBS1174 CBS1483 CBS1484 CBS2156 CBS6903 CLIB180 DBVPG6033 DBVPG6047 DBVPG6257 DBVPG6282 DBVPG6283 DBVPG6284 DBVPG6285 DBVPG6560 LBCC-L52 W-34/70 WY2124, WY2206
Gruppe 2 Effiziente Maltose-Verwertung und langsame/verzögerte Maltotriose-Verwertung
Stämme CAT-1 G34 LBCC-A3 LCM001 PE-2 SA-1 UCD522 UCD819 VR-1 CBS2440 DBVPG6258 DBVPG6261
Gruppe 3 Effiziente Maltoseverwertung, keine Maltotrioseverwertung
Stämme CMY001 GSY2 GDB-178 GDB-379 LCM003 RM11-1a Y55 YJM789 UFMG-A905 UFMG-A1007 CBS7001 Y251 Y165

Die zu Gruppe 2 gehörenden Hefestämme (12 Stämme, siehe Tabelle 3) wiesen im Vergleich zu den Stämmen in Gruppe 1 ein sehr unterschiedliches Muster der Maltotriose-Verwertung auf (Fig. 1b). Diese Hefen verwerteten und fermentierten Maltose effizient, aber wenn sie in Gegenwart von Maltotriose kultiviert wurden, wurde in einigen Fällen eine sehr langsame Wachstumsrate beobachtet, die Wachstumsrate verbesserte sich erst nach mehreren Tagen Inkubation in dieser Kohlenstoffquelle. Die meisten Stämme dieser Gruppe waren industriell S. cerevisiae Stämme (nur einer, LCM001, war ein Laborstamm) sowie drei S. pastorianus brauen Sorten. Schließlich werden die verbleibenden Hefestämme (insgesamt 13 Stämme, einschließlich der acht verbleibenden) S. cerevisiae Laborstämme) gehörten zu Gruppe 3 (siehe Tabelle 3) und waren durch ihre vollständige Unfähigkeit gekennzeichnet, auf Maltotriose zu wachsen (siehe 1b), während die Maltose-Fermentation und -Verwertung durch diese Zellen normal war. Innerhalb dieser Gruppe war auch die S. bayanus div. uvarum CBS7001 Hefestamm sowie zwei S. cerevisiae × S. bayanus Hybridsorten, die für die Wein- und Apfelweinproduktion verwendet werden.

Microarray-Karyotypisierung von Saccharomyces cerevisiae Stämme

Wir stellten die Hypothese auf, dass Gen-CNVs zwischen den Hefestämmen für einige der Unterschiede in der beobachteten Maltotriose-Verwertung und Fermentationseffizienz verantwortlich sein könnten, und führten daher aCGH an jedem der Stämme durch, um zu bestimmen, ob es beobachtbare CNVs gab. Da die Mikroarray-Karyotypisierung Veränderungen der DNA-Kopienzahl relativ zu einem Referenzgenom (in diesem Fall dem Genom des Laborstamms S288C) erkennt, können Genduplikationen oder -deletionen, die zu einer CNV führen, leicht erkannt werden. Wie in Abb. 2a gezeigt, können die aCGH-Ergebnisse leicht das Vorhandensein eines gelöschten AGT1 Gen im Genom des Stamms LCM001, aber nicht in dem ansonsten isogenen Wildtyp-Stamm 1403-7A, von dem es abstammt, während dieselben Daten darauf hindeuten, dass diese beiden Stämme Amplifikationen relativ zu S288C beider MALx1 und MALx2 Gene (aus früheren Arbeiten bekannt durch die MAL31 Maltosepermease und die MAL12 und MAL32 Maltasen im Genom des Stamms S228C, siehe Feuermann et al. 1995 und Volkkaert et al. 1997 ).

Korrelation zwischen der Mikroarray-Karyotypisierung des Laborstamms 1403-7A und seiner isogenenagt1 Stamm LCM001 (a). Die Microarray Comparative Genome Hybridization (aCGH)-Daten (in Protokoll2 des R/G-Verhältnisses) für die MAL Die analysierten Gene sind hervorgehoben. Chromosomales Blotting (b) der angegebenen Hefestämme mit dem AGT1 Gen (oberes Feld) oder MAL31 Gen (unteres Feld) als Sonde, und (c) Korrelation der Kopienzahlvariation der AGT1 (offene Symbole) und MALx1 (schwarze Symbole) Gene, bestimmt durch aCGH (ausgedrückt als Protokoll2 des R/G-Verhältnisses) und Chromosomenblotting (Protokoll2 der Genkopienzahl pro diploidem Genom), vorhanden in den Stämmen CAT-1 (Kreise), PE-2 (Dreiecke), VR-1 (Rauten), SA-1 (Quadrate), 1403-7A (umgekehrte Dreiecke), LCM001 ( Sterne) und UFMG-1007 (Kreuze). Für das Chromosomen-Blotting wurde ein willkürlicher Wert von <0·05 für Stämme ohne AGT1 Gen.

Chromosomenblotting und Hybridisierung mit MAL31 und AGT1 Sonden zeigten tatsächlich das Vorhandensein mehrerer (MAL21, MAL31 und MAL41) Maltosepermease-Gene in den Chromosomen dieser beiden Stämme (1403-7A und LCM001), während erwartungsgemäß nur dem Stamm LCM001 die AGT1 Permease (Abb. 2b). Die meisten von den S. cerevisiae analysierte Stämme enthielten auch mehrere Maltose-Permease-Gene. Zum Beispiel hatten die Stämme VR-1 und SA-1 Maltose-Permeasen auf beiden Chromosomen VII (MAL11) und Chromosom II (MAL31), während die Stämme CAT-1 und UFMG-A1007 ebenfalls diese beiden Maltose-Transporter-Gene aufwiesen, aber für Chromosom VII heterozygot waren, da sie beide die AGT1 und MAL11 Permeasegene in jedem der beiden Chromosomen dieser diploiden Hefestämme (siehe Daten für Stamm VR-1 und CAT-1 in Fig. 2b). Der Stamm PE-2 ähnelte den Stämmen CAT-1 und UFMG-A1007 (AGT1/MAL11 und MAL31), sondern enthielt auch die MAL41 Permease (Chromosom XI) in seinem Genom (Abb. 2b). Tatsächlich wurde eine gute Korrelation zwischen der Gen-CNV dieser im Genom der Hefestämme vorhandenen α-Glucosid-Transporter, wie durch Chromosomen-Blotting gezeigt, und den aCGH-Daten für die entsprechenden AGT1 und MAL31 Gene (Abb. 2c).

Die aCGH-Daten von MAL Gene vorhanden unter ausgewählten S. cerevisiae Hefestämme in Abb. 3 zeigt, dass die Kopienzahl von MPH2-MPH3 Gene hat wahrscheinlich wenig Einfluss auf die Verwertung von Maltotriose (und Maltose) durch die S. cerevisiae Hefen analysiert, da Stämme, denen diese beiden Gene fehlen, in allen drei Gruppen von Stämmen mit unterschiedlichen, zuvor beschriebenen Maltotriose-Verwertungsprofilen gefunden wurden. Hinsichtlich der MALx1 Transporter zeigten praktisch alle in Abb. 3 analysierten Stämme eine erhöhte Kopienzahl dieses Gens im Vergleich zu S288C, was darauf hindeutet, dass mehr als ein funktioneller MAL locus ist in diesen Stämmen vorhanden, was eine effiziente Maltoseverwertung ermöglicht.

Microarray-Karyotypisierungsdaten der relativen Genkopienzahlvariation (im Vergleich zum Stamm S288C), die in den Genomen ausgewählter Hefestämme aus Gruppe 1 (G1), Gruppe 2 (G2) oder Gruppe 3 (G3) vorhanden sind.

Die CGH-Ergebnisse zeigten ein ganz anderes Muster bezüglich der AGT1 Permease (Abb. 3). Alle effizienten Maltotriose-Verwertungsstämme (Gruppe 1), die durch Microarray-Karyotypisierung analysiert wurden, haben dieses Gen in ihrem Genom, während die meisten Stämme, die entweder zu Gruppe 2 (langsame/verzögerte Maltotriose-Verwertung) oder Gruppe 3 (keine Maltotriose-Verwertung) gehören, eine niedrigere Kopie aufwiesen (nur ein Gen pro diploidem Genom) oder fehlte sogar die AGT1 Gen (Abb. 3, siehe auch Abb. 2c). Obwohl unsere Mikroarrays entwickelt wurden, um Gen-CNVs in S. cerevisiae Genome, Abb. 3 zeigt auch die S. cerevisiae-bezogene aCGH-Daten für eine interspezifische Hybride zwischen dieser Art und S. bayanus (Sieb CLIB180). Wie für diesen Stamm, der zur Gruppe 1 gehört, zu sehen ist, weisen die aCGH-Ergebnisse auf das Vorkommen des AGT1 Durchdringung und Verstärkung der MALx1 Gene, ähnlich wie im S. cerevisiae Stämme der Gruppe 1.

Neue Phänotypen der Maltotriose-Verwertung in Saccharomyces Hefen

Die in 1 gezeigten Ergebnisse bezüglich des langsamen/verzögerten Maltotriose-Verwertungsmusters (Gruppe 2), das für einige Hefestämme beobachtet wurde, waren ziemlich unerwartet und veranlassten uns, eine detailliertere Analyse dieser neuen Phänotypen durchzuführen. Abbildung 4 zeigt die Muster der Maltotriose-Verwertung durch zwei Labor S. cerevisiae Stämme (CEN.PK2-1C und 1403-7A) und ihre entsprechenden agt1Δ isogene Hefestämme (LCM003 bzw. LCM001). Wie wir bereits für den Stamm LCM003 ( Alves et al. 2008), diese agt1Δ-Zellen sind sogar nach einer ausgedehnten (>8 Tage) Inkubation in Gegenwart dieser Kohlenstoffquelle nicht in der Lage, Maltotriose zu verwerten. Jedoch und in Übereinstimmung mit den in Fig. 1 gezeigten Wachstumsassays, Stamm LCM001 (auch agt1Δ) hatte einen unerwarteten anderen Phänotyp: Es wuchs während der ersten 3-4 Tage der Inkubation nicht auf Maltotriose, aber nach dieser ausgedehnten Verzögerungsphase begannen die Zellen, den Zucker zu verbrauchen, was ein effizientes aerobes Wachstum auf Maltotriose ermöglichte (beachten Sie jedoch, dass beim Zuckerkonsum wurde kein Ethanol produziert, siehe Abb. 4c). Dieser umfangreiche Lag-Phasen-Phänotyp war immer reproduzierbar und tritt auch dann auf, wenn exponentiell in Maltotriose wachsende Zellen (zum Beispiel nach 100 h Inkubation in dieser Kohlenstoffquelle) in neues YP-2% Maltotriose-Medium zurückverdünnt werden nicht nur wegen der Selektion neuer fermentativer Maltotriose-Hefemutanten (Daten nicht gezeigt).

Typisches Zellwachstum (a), Zuckerverbrauch (b) und Ethanolproduktion (c) während des Wachstums auf Maltotriose durch Zellen der Laborstämme CEN.PK2-1C (schwarze Dreiecke) und deren isogen Δagt1 Stamm LCM003 (offene Dreiecke) oder von Stamm 1403-7A (schwarze Kreise) und seine isogenenagt1 Stamm LCM001 (offene Kreise).

Ähnliche Phänotypen der Maltotriose-Verwertung wurden bei einigen anderen beobachtet S. cerevisiae Industriehefestämme der Gruppe 2. Zum Beispiel zeigten Zellen des Industriestamms VR-1 auch lange Verzögerungszeiten (3–4 Tage), bevor sie begannen, Maltotriose für das Wachstum zu verbrauchen, und aus dieser Kohlenstoffquelle wurde kein Ethanol hergestellt, obwohl dies Hefe verbraucht und fermentiert Maltose effizient (Abb. 5c). Somit ähnelt dieser VR-1-Hefestamm dem Phänotyp, der für die beobachtet wurde agt1Δ Der oben gezeigte LCM001-Stamm zeigt tatsächlich, dass unsere aCGH- und Chromosomen-Blotting-Ergebnisse diesem Stamm die AGT1 Permease in seinem Genom (siehe Abb. 2b–c). Für die verbleibenden Mitglieder der Gruppe-2-Hefen (die industriellen Kraftstoff-Ethanol-Stämme CAT-1, SA-1 und PE-2) wurde jedoch noch ein weiterer neuer Phänotyp beobachtet: Wie LCM001 und VR-1 konsumierten diese Stämme Maltotriose erst nach eine ausgedehnte Lag-Phase, aber im Gegensatz zu LCM001 und VR-1 produzierten sie Ethanol aus Maltotriose. Note that maltose consumption and fermentation was normal in the CAT-1, SA-1 and PE-2 strains. Nevertheless, in most cases, the ethanol yields on maltotriose were significantly lower than those obtained during maltose fermentation, as shown in Fig. 5c for the industrial S. cerevisiae yeast strain PE-2.

Typical cell growth (a), sugar consumption (b) and ethanol production (c) during growth on maltose (circles) or maltotriose (triangles) by cells of the industrial strains PE-2 (black symbols) or VR-1 (open symbols).


Ergebnisse

Electrophoretic karyotyping of brewing yeast strains reveals chromosome pattern variability

Firstly, we have evaluated the chromosome profiles of 29 brewing yeast strains both top-fermenting ale strains and bottom-fermenting lager strains that were purchased from multiple suppliers and classified as S. cerevisiae (Table ​ (Table1, 1 , Fig. ​ Fig.1 1 ).

The dendrogram of chromosome band-based similarity created after electrophoretic karyotyping of 30 brewing yeast strains (lanes von 1 zu 30). The yeast S. cerevisiae chromosome marker YNN295 (BIORAD) is also presented (lane M). Lager strains (strains 6, 7, 18, and 29) are denoted as L, whereas cider strain (strain 26) is denoted as C. Strains 4, 6, 8, and 9 with various chromosome profiles were selected for further analysis (in red frames) (Color figure online)

Indeed, after PFGE separation, we were able to observe S. cerevisiae-like chromosome profiles (Fig. ​ (Fig.1). 1 ). In general, the chromosome number of analyzed strains is 16 (Fig. ​ (Fig.1). 1 ). However, some additional bands can be also observed e.g., an additional band between chromosomes IV and VII was shown for strains 6, 7, 18, and 29 that is a characteristic feature of Saccharomyces bayanus karyotype (Naumov et al. 1992). Perhaps, some of analyzed strains may be considered as hybrids between S. cerevisiae und S. bayanus. Indeed, strains 6, 7, 18, and 29 are bottom-fermenting lager strains, and in general, lager yeasts are natural hybrids between S. cerevisiae und S. eubayanus (Dunn and Sherlock 2008 Walther et al. 2014 Wendland 2014). Some other chromosome variabilities may also reflect increased level of translocations and aneuploidy events and dynamic nature of industrial yeast genomes (Bond et al. 2004 Querol and Bond 2009). Similar chromosome profiles among analyzed strains were revealed using UPGMA clustering e.g., lager strains were grouped together (Fig. ​ (Fig.1). 1 ). Four strains, namely strains 4, 6, 8, and 9, representing different karyotype profiles were then selected for further analysis (Fig. ​ (Fig.1, 1 , in red frames). Additionally, one cider yeast strain (strain 26) was included for chromosome comparison (Fig. ​ (Fig.1 1 ).

Differences in growth rate, viability, and ploidy state

Secondly, the kinetics of growth of selected brewing yeasts both top-fermenting strains (strains 4, 8, and 9) and bottom-fermenting strain (strain 6) was inspected using standard yeast growth medium (YPD medium) (Fig. ​ (Fig.2 2 a).

Growth rate, viability, and ploidy state of selected brewing yeast strains. ein Yeast growth was monitored turbidimetrically at 600 nm in a microplate reader every 2 h during a 10 h. Bars indicate SD, n =ਆ. B Cell viability was estimated with a LIVE/DEAD® Yeast Viability Kit using the standard protocol according to the manufacturer’s instructions. The percentage of live and dead cells is shown. n =򠈀. C Fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based analysis of DNA content of strains 4, 6, 8, and 9. Representative histograms are shown. Diploid, triploid, and tetraploid reference strains are also presented

The growth rate of strains 4 and 9 was accelerated compared to the growth rate of strains 6 and 8 in the first 6 h of experiment (Fig. ​ (Fig.2a). 2 a). However, the delay of growth of strains 6 and 8 was overcome in the next 2 h, and after 10 h, the growth yield was comparable between all analyzed strains (Fig. ​ (Fig.2a). 2 a). The viability of cells at the logarithmic phase of growth was similar and ranging from 99.5 to 98 % (Fig. ​ (Fig.2b). 2 b). Fluorescence-activated cell sorting (FACS)-based analysis of DNA content revealed diverse ploidy states of analyzed strains (Fig. ​ (Fig.2c). 2 c). Strains 4 and 9 are tetraploid and strain 8 is diploid. The histogram for strain 6 is more ambiguous and shows some features of the tetraploid reference strain histogram (Fig. ​ (Fig.2 2 c).

Intracellular redox equilibrium is shifted toward more oxidation state in Saflager W-34/70 strain and, to lesser degree, in Windsor British ale strain

We then analyzed intracellular reactive oxygen species (ROS) production and superoxide production in the control growth conditions (Fig. ​ (Fig.3 3 ).

Intracellular redox state of selected brewing yeast strains. Reactive oxygen species (ROS) production was assessed using H2DCF-DA fluorogenic probe (ein), and superoxide production was monitored using dihydroethidium fluorogenic probe (B). The results are presented as relative fluorescence units per minute (RFU/min). Bars indicate SD, n =਄. C The level of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG) was analyzed using ELISA-based assay. Bars indicate SD, n =ਃ, *P <਀.05 compared to strain 6 (ANOVA and Tukey’s a posteriori test)

Redox imbalance was observed in strains 6 and 9 compared to strains 4 and 8 (Fig. ​ (Fig.3). 3 ). Higher level of ROS production of approximately 3.5-fold and 1.8-fold was shown in strains 6 and 9, respectively (Fig. ​ (Fig.3a). 3 a). In contrast, augmented superoxide production was only observed in strain 6 (Fig. ​ (Fig.3b). 3 b). Intracellular superoxide production was higher approximately 2-fold in strain 6 compared to other strains (Fig. ​ (Fig.3b). 3 b). Statistically significant higher level of ROS and superoxide production was observed in strain 6 compared to other strains analyzed (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.3a, 3 a, b). Redox disequilibrium resulted in elevated levels of oxidative DNA damage (the level of 8-hydroxy-2′-deoxyguanosine (8-oxo-dG)) in strains 6 and 9 (Fig. ​ (Fig.3c). 3 c). Increased 8-oxo-dG levels of approximately 60 % were observed in strains 6 and 9 compared to strains 4 and 8 (Fig. ​ (Fig.3c). 3 c). Statistically significant higher level of oxidative DNA damage was noticed in strain 6 compared to strains 4 and 8 (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.3 3 c).

Subtelomeric regions are sites of the most accented differences in the gene copy number and loci-specific gains and losses

The genome of selected strains was further characterized using array-based comparative genomic hybridization (array-CGH) (Figs. ​ (Figs.4 4 and ​ and5 5 ).

Analysis of the variability in the gene copy number of strains 4, 6, 8, and 9 using array-CGH. ein Array-CGH profiles are shown. Jeder gray dot represents the value of the log2 ratio for an individual gene. Blue lines were provided to emphasize the most accented differences (DNA losses and gains). B The relatedness of strains analyzed using cluster analysis. Similarity tree is shown (Color figure online)

The divergence of relative abundance of genes as determined by array-CGH represented by standard deviation (SD) of log2 ratio values for each gene in strains 4, 6, 8, and 9. ein The summary plot for the whole genome. B Individual plots for each chromosome. Blue dots indicate the SD values for individual genes, the rote Linien denote the smoother trend calculated by moving average of SD values to expose the genome regions of higher log2 ratio divergence, and green triangles indicate centromere position. Individual plots for mitochondrial genome are also presented (Mt) (Color figure online)

The genome of strain 4 of a euploid nature was characterized by decreased number of subtelomeric genes (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). The gains of chromosomes I, III, and VI were observed in strain 8, whereas the losses of chromosomes I, III, VI, and IX were shown in strain 9 (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). The most affected genome was strain 6 compared to the other analyzed genomes with the majority of its chromosomes containing gains and/or losses (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). The gains of fragments of chromosomes II, III, VII, VIII, and XI and the losses of fragments of chromosomes III, V, and X were observed (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). Moreover, some other losses were much more accented, e.g., gross deficiencies of chromosomes I, VI, XII, and XVI (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). In the case of chromosome XII, the lack of whole chromosome and, in the case of chromosome XVI, the lack of distal part of right arm were observed (Fig. ​ (Fig.4a). 4 a). Additionally, array-CGH profiles were used to estimate the level of similarity (relatedness) between selected strains analyzed on the basis of observed genomic diversity (Fig. ​ (Fig.4b). 4 b). As expected, the most variable was lager strain (strain 6) with its own category (Fig. ​ (Fig.4b). 4 b). All three ale strains were grouped together (Fig. ​ (Fig.4b). 4 b). Array-CGH data allowed us also to analyze the diversity of the copy number of individual genes among all brewing yeast strains studied. As a measure of this diversity, we used standard deviation (SD) of log2 ratio values. Figure ​ Figure5 5 plots SD of log2 ratio values for all genes. Figure ​ Figure5a 5 a gives an overview of the whole yeast genome, and Fig. ​ Fig.5b 5 b shows an expanded view of the same data divided into individual chromosomes. The data points for single genes (blue dots) are overplayed with the red line representing the moving average of the individual data points to visualize greater regions of high diversity. According to these plots, the most evident diversity in the gene copy number was revealed within subtelomeric regions in almost all analyzed chromosomes and also within short intrachromosomal regions of chromosomes IV, IX, XII, and XIII (Fig. ​ (Fig.5). 5 ). Also, highly diverse is the whole mitochondrial chromosome (Fig. ​ (Fig.5b, 5 b, Mt).

Gene ontology overrepresentation profiles vary between strains

As the observed differences in the gene copy number and loci-specific gains and losses may affect the functional properties of brewing strains, the genes that were most divergent according to array-CGH-based analysis (showing log2 ratio values higher than 2 or lower than 𢄢 for at least one of analyzed strains) were then subjected to gene ontology overrepresentation analysis (Fig. ​ (Fig.6 6 ).

A heat map generated from array-CGH data. Functional categories overrepresented in the group of genes that were the most divergent among analyzed strains are shown. The strains were ordered according to the result of clustering analysis (Fig. ​ (Fig.4b), 4 b), and the selected genes were grouped according to their functional assignment. Positive and negative log2 ratio values represent higher and lower than average abundance of the gene, as determined by array-CGH analysis

Five functional categories overrepresented in the group of selected genes were revealed, namely (1) maltose metabolism and transport, (2) response to toxin, (3) siderophore transport, (4) cellular aldehyde metabolic process, and (5) L-iditol 2-dehydrogenase activity (P <਀.05) and are presented as a heat map in Fig. ​ Fig.6. 6 . Within two functional categories of genes involved in response to toxin and cellular aldehyde metabolic process, the loss of aryl alcohol dehydrogenase (AAD) genes was observed in strains 6 and 9 with unbalanced redox equilibrium (Figs. ​ (Figs.3 3 and ​ and6). 6 ). The effects were statistically significant for AAD3, AAD6, AAD10, und AAD15 genes (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.6), 6 ), whereas similar but weak tendency for AAD4 und AAD14 genes was not significant (Supplementary Material). Moreover, the most accented loss of genes involved in siderophore transport was also shown in strain 6 (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.6). 6 ). In contrast, the most evident loss of genes involved in maltose metabolism was observed in strain 8 (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.6). 6 ). A heat map generated from array-CGH data reflecting the variability in the gene copy number of the whole genome of brewing strains analyzed is also presented in Supplementary Material.

Validation of array-based comparative genomic hybridization data

To test if the variations in the gene copy number are reflected by the levels of mRNA for those genes, qRT-PCR assay was employed for FIT3, MAL13, AAD10, und ALD2 genes representing major functional categories depicted in Fig. ​ Fig.6. 6 . The qRT-PCR results are presented in Table ​ Table3 3 .

Tisch 3

The relative mRNA levels for genes selected from the set shown in Fig. ​ Fig.6 6

BelastungGen
FIT3 MAL13 AAD10 ALD2
40.0180 ±਀.00101.0668 ±਀.06930.2257 ±਀.04170.4143 ±਀.0423
60.0004 ±਀.00010.9243 ±਀.00670.0003 ±਀.00010.5779 ±਀.0418
80.0558 ±਀.00210.0004 ±਀.00010.4108 ±਀.00840.5524 ±਀.0461
90.0264 ±਀.00180.9239 ±਀.04351.3551 ±਀.02740.0004 ±਀.0003

The numbers represent the levels of respective transcripts normalized to the data for a housekeeping gene ALG9, relative to the normalized levels of transcript in BY4741 strain. The data represent the mean ± SD from at least three independent experiments

Moreover, the comparison of gene copy number and mRNA levels for these genes is shown in Fig. ​ Fig.7 7 .

Validation of gene copy number data obtained using array-CGH analysis with mRNA levels determined by qRT-PCR. The comparisons to the array-CGH results were made for genes selected from the set shown in Fig. ​ Fig.6. 6 . The qRT-PCR data from Table ​ Table3 3 were normalized with the average of the data for each gene and converted to log2 values to bring them to the same format as array-CGH data. The correlation coefficient between both sets of data is 0.89. ein Log2 values obtained with both methods. B Graphical representation of these data

To make this comparison possible, the qRT-PCR data had to be processed in the same way as array-CGH data. Therefore, the individual data points for each gene were divided by the average of the values for that gene in all strains. The resulting normalized data were converted to log2 Werte. As seen in Fig. ​ Fig.7, 7 , the results obtained with both methods correlate very well, with correlation coefficient of 0.89. The negative values obtained for the genes that were absent in some strains are lower using qRT-PCR method than using array-CGH assay, but this is because the former method is more sensitive. Yet, array-CGH result for a gene that is below 𢄢 means that this gene is absent in that strain.

Genomic stability and nucleolus state are affected in Saflager W-34/70 strain

We were then interested if strains with redox disequilibrium and decreased dosage of genes involved in stress responses, e.g., strain 6, may be susceptible to DNA breaks and changes in nucleolus state. Indeed, strain 6 was found to be the most affected by DNA double-strand breaks (DSBs) in the control growth conditions (P <਀.05) (Fig. ​ (Fig.8 8 a).

Evaluation of genomic instability and nucleolus state in selected brewing yeast strains in the control growth conditions. ein The susceptibility to DNA double-strand breaks (DSBs). DSBs were assessed using neutral comet assay. As a DNA damage marker, the % tail DNA was used. Die Riegel indicate SD, n =򠅐, *P <਀.05 compared to strain 6 (ANOVA and Tukey’s a posteriori test). The typical micrographs are shown (rechts). DNA was visualized using YOYO-1 staining (Grün). B Western blot analysis of Nop1, Fob1, Rad1, and Rap1 contents. Anti-Tub1 antibody served as a loading control. Anti-Act1 antibody was ruled out as a loading control because analyzed strains are characterized by different levels of beta-actin. C Analysis of chromosome I, XI, and XII signals using fluorescence in situ hybridization and whole-chromosome painting probes (WCPPs). Chromosome-specific signals were scored in 100 nuclei and presented as a percentage, n =򠄀. Three categories were considered, i.e., cells with one, two, and more than two chromosome specific signals. D Analysis of rDNA content. rDNA was visualized using WCPP specific to chromosome XII that contains rDNA locus in yeast. Fluorescence signals of chromosome XII were quantified using ImageJ software. The integrated fluorescence density is presented in relative fluorescence units (RFUs). Kasten-and-whisker plots are shown, n =򠄀. The typical micrographs are shown (rechts). The cells were labeled with FITC to detect chromosome XII-specific signals (Grün). DNA was visualized using DAPI staining (Blau) (Color figure online)

We have then compared the levels of protein involved in DNA damage repair, namely Rad1p, but its level was not lower in strain 6 compared to other strains analyzed in the control growth conditions (Fig. ​ (Fig.8b). 8 b). In contrast, the levels of nucleolar proteins Nop1 and Fob1 and transcription regulator Rap1 were lower in strain 6 compared to other strains analyzed in the control growth conditions (Fig. ​ (Fig.8b). 8 b). Interestingly, anti-Act1p antibody cannot be considered as a loading control in strain 6 because strain 6 is characterized by very low level of beta-actin compared to other analyzed strains (Fig. ​ (Fig.8b). 8 b). We selected then three chromosomes of different size, namely small chromosome I, medium-sized chromosome XI, and large chromosome XII to analyze their signal variability in brewing strains using FISH with WCPPs (Fig. ​ (Fig.8c). 8 c). One should remember that array-CGH method is a population-scale approach and is not designed to study the discrete cellular observations, whereas FISH, here single-cell analysis of chromosome instability, can be used to address cellular heterogeneity. Some of our FISH data are in agreement with array-CGH results, especially on genomic diversity observed in strain 6 (Figs. ​ (Figs.4 4 and ​ and8c). 8 c). Gross deficiencies of chromosomes I and XII (Fig. ​ (Fig.4) 4 ) were revealed using array-CGH that may reflect low frequency of signals of chromosomes I and XII observed using WCPPs (Fig. ​ (Fig.8c). 8 c). Analogically, the gains of chromosome XI (Fig. ​ (Fig.4) 4 ) were correlated with higher frequency of signals of chromosome XI in strain 6 compared to other strains (Fig. ​ (Fig.8c). 8 c). Interestingly, higher frequency of signals of chromosome XII was observed in strain 8 (Fig. ​ (Fig.8c, 8 c, d). Because similar effect was not revealed using array-CGH not detecting rDNA sequences, higher frequency of signals of chromosome XII that contains rDNA locus in yeast may suggest chromosome XII fragmentation and/or nucleolus (rDNA) fragmentation in strain 8. Chromosome XII (rDNA) signals were also quantified (Fig. ​ (Fig.8d). 8 d). However, except of strain 4, rDNA content was comparable among analyzed strains (Fig. ​ (Fig.8d). 8 d). Perhaps, chromosome XII fragmentation does not affect rDNA levels in strain 8 (Fig. ​ (Fig.8 8 d).

Tolerance to fermentation-associated stress stimuli is diminished in Saflager W-34/70 strain

We then asked the question of whether lower copy number of aryl-alcohol dehydrogenase (AAD) genes, imbalanced redox homeostasis, and genetic instability in strain 6 compared to other strains analyzed may also affect fermentation performance in strain 6. First, the utilization of non-fermentable carbon sources, namely glycerol and ethanol, was investigated (Fig. ​ (Fig.9 9 a).

Analysis of the utilization of non-fermentable carbon sources (ein) and tolerance to fermentation-associated stress stimuli in selected brewing yeast strains (strains 4, 6, 8, and 9) (B) using spot assay. ein Yeast cells at the logarithmic phase of growth were diluted (1 ×ꀐ 7 , 1 ×ꀐ 6 , 1 ×ꀐ 5 , 1 ×ꀐ 4 , and 1 ×ꀐ 3 cells/ml), and growth on solid YPG and YPE media was inspected after 48 h. The growth of strain 6 was improved in the presence of 0.1 % glucose in YPG medium. B Yeast cells at the logarithmic phase of growth were diluted (1 ×ꀐ 7 , 1 ×ꀐ 6 , 1 ×ꀐ 5 , 1 ×ꀐ 4 , and 1 ×ꀐ 3 cells/ml), and growth on solid YPD medium in the presence of different stress stimuli was inspected after 48 h. In the case of hydrogen peroxide, cells were incubated with hydrogen peroxide for 40 min and then transferred to solid YPD medium. The growth of cells incubated at 4 ଌ was inspected after 120 h. Representative photographs are shown

The growth capacity of strain 6 was diminished in YPG and YPE media compared to control YPD medium and also to growth of other strains analyzed (Fig. ​ (Fig.9a). 9 a). The growth of strain 6 was improved when YPG medium was supplemented with 0.1 % glucose (Fig. ​ (Fig.9a). 9 a). Second, the tolerance to fermentation-associated stress stimuli was considered, namely salt, osmotic, oxidative, ethanol, high glucose, and cold/heat stresses (Fig. ​ (Fig.9b). 9 b). In general, diminished resistance to stress stimuli of strain 6 was observed compared to other strains analyzed (Fig. ​ (Fig.9b). 9 b). Strain 6 was found to be more sensitive to NaCl, KCl, sorbitol, hydrogen peroxide, ethanol and high-glucose treatments, and heat stress (Fig. ​ (Fig.9b). 9 b). Strain 6 was unable to grow at 37 ଌ (Fig. ​ (Fig.9b). 9 b). In contrast, cryotolerant lager strain 6 grew better at 4 ଌ compared to ale strains (strains 4, 8, and 9) (Fig. ​ (Fig.9 9 b).


Example 8

The parent strain and ScCTT1-highly expressed strain obtained in Example 7, are used to carry out fermentation test under the following conditions.

The fermentation broth was sampled with time to observe the cell growth (OD660) (FIG. 10) and extract consumption with time (FIG. 11). Quantification of sulfite concentration at completion of fermentation was carried out by collecting sulfite into hydrogen peroxide aqueous solution by distillation under acidic condition, and titration with alkali (Revised BCOJ Beer Analysis Method by the Brewing Society of Japan).

As shown in FIG. 12, the ScCTT1-highly expressed strain produced sulfite approximately 1.7 times greater than the parent strain. In addition, significant differences were not observed between the parent strain and the highly expressed strain in cell growth and extract consumption in this testing.