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Was ist das Hintergrundsignal in einem Western Blot?


Ich habe einen Western Blot gemacht und möchte das Hintergrundsignal entfernen, wenn ich eine Densitometrieanalyse meiner interessierenden Proteinbanden durchführe. Ich habe online einige Artikel wie diesen gelesen, die sich mit einem hohen Hintergrund in Western Blots befassen. Ich habe gelernt, dass es viele Faktoren gibt, die zu einem hohen Hintergrund in einem Western Blot beitragen können. Ich bin mir jedoch immer noch nicht sicher, was genau als Hintergrund definiert ist. Bezieht es sich auf unspezifische Antikörperbindung an der Membran oder kann es sich auch auf Regionen auf der Membran beziehen, in denen keine Bindung an ein Protein besteht?

Alle Einblicke werden geschätzt.


In diesem Zusammenhang (und vielen anderen) können die Begriffe "Hintergrundsignal" und "Rauschen" fast synonym verwendet werden, wenn das hilft.

Im Allgemeinen bezieht sich Rauschen oder Hintergrund auf jedes Signal, das nicht von dem Ding stammt, das Sie erkennen möchten (normalerweise in Bezug darauf, wie dieses Signal mit Ihrem "wahren" Signal interferiert oder verwechselt werden könnte). Eine unspezifische Bindung könnte also als Hintergrund gelten, kann sich aber auch auf Regionen der Membran beziehen, die keine Proteinbindung aufweisen sollten (mit einer Vielzahl von Ursachen). Eine Ausnahme, die mir in der Praxis einfällt, ist, wenn Sie ein bestimmtes Nicht-Zielband haben, das ständig auftaucht, das technisch der Definition entsprechen könnte (sensu streng) von "Rauschen", aber ein Molekularbiologe wird es eher als "technisches Artefakt" und nicht als "Hintergrund" bezeichnen.

Trotzdem gibt es immer noch eine Reihe verschiedener Arten von "Rauschen" oder "Hintergrund", die auf Western-Blots auftauchen können, und der Artikel, auf den Sie verwiesen haben, beschreibt sie ziemlich gut, aber es könnte von der Einbindung einiger Bilder profitieren. Hier ist eine ähnliche Anleitung mit weiteren Bildern und Links zu anderen westlichen Anleitungen zur Fehlerbehebung. Ich hoffe es hilft.


15.4: Western Blots beinhalten viele Schritte

  • Beigetragen von Clare M. O&rsquoConnor
  • Außerordentlicher Professor Emeritus (Biologie) am Boston College

In einem Western-Blot-Verfahren werden Proteine ​​zunächst auf einem SDS-PAGE-Gel aufgetrennt und dann auf eine Membran übertragen. Diese Membranreplik wird mit Antikörpern behandelt, die spezifisch ein interessierendes Protein oder Epitop erkennen. Zusätzliche Verarbeitungsschritte erzeugen ein Signal an der Position des gebundenen Antikörpers. Zwischen den Schritten werden verschiedene Waschungen durchgeführt, um das Signal-Rausch-Verhältnis auf dem endgültigen, entwickelten Blot zu erhöhen. Die wichtigsten Schritte in einem typischen Western-Blot sind auf der folgenden Seite grafisch dargestellt und in den folgenden Abschnitten ausführlicher besprochen:

  • Elektrophoretischer Transfer von Proteinen von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Membran
  • Blockierung unspezifischer Proteinbindungsstellen auf Transfermembranen
  • Inkubation der Membran mit einem primären Antikörper, der für das interessierende Epitop spezifisch ist
  • Inkubation mit einem sekundären Antikörper, der primäre Antikörper erkennt
  • Visualisierung gebundener Antikörper

Elektrophoretischer Transfer von Proteinen von einem SDS-PAGE-Gel auf eine Membran

Der erste Schritt in einem Western Blot besteht darin, eine Replik des SDS-PAGE-Gels zu erzeugen, indem Proteine ​​elektrophoretisch auf eine synthetische Membran mit einer hohen Proteinbindungskapazität übertragen werden. In unseren Experimenten verwenden wir Membranen aus Polyvinylidinfluorid (PVDF), einer Art Kunststoff. PVDF-Membranen sind hydrophob und die trockenen Membranen werden nicht richtig mit Wasser benetzt. Daher werden PVDF-Membranen zuerst mit Methanol benetzt, dann mit entionisiertem Wasser gespült und schließlich mit Transferpuffer gespült. Sie dürfen während der Transfer- und Immunoblot-Verfahren nicht austrocknen. Wenn sie austrocknen, müssen sie mit Methanol wieder benetzt und mit Wasser gespült werden, bevor Sie fortfahren.

Während des Transfervorgangs werden Gel und Membran in einem „Sandwich&rdquo aus angefeuchteten Filterpapieren und Schaumstoffpolstern direkt aneinander gelegt (siehe Abbildung unten). Während des elektrophoretischen Transfers sollte der Strom gleichmäßig über die gesamte Oberfläche des Gels fließen. Es ist daher wichtig, dass keine Luftblasen zwischen Gel und Membran eingeschlossen werden. Nach dem elektrophoretischen Transfer, der in wenigen Stunden oder über Nacht mit reduzierter Spannung durchgeführt werden kann, kann die Membranreplik mit den transferierten Proteinen austrocknen und zur späteren Visualisierung mit Antikörpern aufbewahrt werden.

Blockierung unspezifischer Proteinbindungsstellen auf Membranen

Die in Western Blots verwendeten Transfermembranen binden Proteine ​​unspezifisch. Bevor die Membranen mit spezifischen (und teuren) Antikörpern inkubiert werden, müssen sie mit Blockierungslösungen vorbehandelt werden, die hohe Konzentrationen an reichlich vorhandenen (und billigen) Proteinen enthalten, um unspezifische Bindungsstellen zu sättigen. Stellen Sie sich diesen Schritt analog zu einem Künstler vor, der eine Leinwand mit einer Farbe geringerer Qualität grundiert, bevor das teurere Medium aufgetragen wird. Wenn die Transfermembranen vor dem Auftragen des Antikörpers nicht ausreichend blockiert werden, absorbieren die unspezifischen Stellen auf den Membranen einen Teil der Antikörper, wodurch die Menge an verfügbarem Antikörper zum Binden der
Zielproteine. In unseren Experimenten werden wir Caseinproteine ​​aus Milch als Blockierungsreagenzien verwenden. Da unsere Experimente keine hohe Sensibilität erfordern, ist rehydrierte fettfreie Trockenmilch (direkt aus dem Supermarkt!) eine angemessene Kaseinquelle.

Primäre Antikörperbindung

Als primärer Antikörper für Western-Blots können entweder polyklonale oder monoklonale Antikörper verwendet werden. Antikörper können gegen ein natürlich vorkommendes Protein gerichtet sein oder gegen ein Epitop, das an ein überexprimiertes Protein gebunden ist (wie wir es tun). Forscher verwenden in ihren Experimenten zunehmend Epitop-markierte Proteine, da Antikörper gegen natürlich vorkommende Proteine ​​teuer und zeitaufwendig in der Herstellung sind. Außerdem kann ein gegen ein Epitop gerichteter Antikörper verwendet werden, um viele verschiedene Proteine, die dasselbe Epitop tragen, nachzuweisen. In unseren Western-Blots verwenden wir einen monoklonalen Maus-Antikörper, der das V5-Epitop an Met- und LacZ-Proteinen bindet, die vom pYES2.1-Plasmid exprimiert werden.

Sekundärantikörperbindung

Die in Western Blots verwendeten Sekundärantikörper sind so konzipiert, dass sie die FC-Fragmente binden
von Primärantikörpern, wobei die speziesübergreifenden Unterschiede in den Antikörpersequenzen ausgenutzt werden. Sekundäre Antiseren werden im Allgemeinen hergestellt, indem einem Tier FC-Fragmente von IgGs einer zweiten Spezies injiziert werden. Das erste Tier erkennt die FC-Fragmente als fremde Antigene und produziert Antikörper, die die FC-Fragmente binden. Der sekundäre Antikörper in unserem Experiment ist ein polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der gegen die FC-Domänen von Maus-IgGs hergestellt wurde. Der Antikörper bindet die FC-Domänen der Maus-Anti-V5-Antikörper, die an die pYES2.1-kodierten Proteine ​​gebunden sind.

Visualisierung gebundener Antikörper

In diesem letzten Schritt wird der Western Blot mit Substraten für das an den Sekundärantikörper konjugierte Enzym inkubiert. Unser sekundärer Antikörper wurde an HRP konjugiert, ein robustes Enzym mit einer hohen Umsatzzahl. (Die Umsatzzahl ist die Anzahl der Produktmoleküle, die pro Sekunde am aktiven Zentrum eines Enzyms produziert werden.) HRP katalysiert die Reaktion von Wasserstoffperoxid und 3,3,5,5, - Tetramethylbenzidin (TMB), wodurch ein dunkelblau-graues Reaktionsprodukt entsteht das an der Reaktionsstelle des Western-Blots ausfällt. Farbiges Reaktionsprodukt reichert sich mit der Zeit an, bis die Reaktion durch Abwaschen von nicht umgesetztem Substrat gestoppt wird. Die Reaktion sollte beendet werden, bevor die unspezifische Antikörperbindung problematisch wird, was durch das Auftreten vieler schwach färbender Banden belegt wird.


Western Blotting ist eine zuverlässige Methode zur Abtrennung von Antigenen aus einer gemischten Proteinprobe. Antigene sind Fremdstoffe, die eine Immunantwort auslösen. Western-Blot-Ergebnisse haben eine hohe Sensitivität und eine hohe Spezifität, was bedeutet, dass es nur sehr begrenzte falsch-negative Ergebnisse bzw. falsch-positive Ergebnisse gibt. Einfacher ausgedrückt liefert eine hohe Sensitivität genaue Ergebnisse aus Proben mit Anzeichen einer Krankheit, und eine hohe Spezifität identifiziert hohe Raten bei denen, die diese Krankheit nicht haben.

Trotzdem ist ein Western-Blot-Ergebnis nicht ausfallsicher. Antikörper können mehr als einen Antigentyp nachweisen. Wenn beispielsweise jemand auf eine HIV-Infektion getestet wird und gleichzeitig an einer Lungeninfektion leidet, können Antikörper die Atemwegsinfektion erfassen und das Vorhandensein von HIV nicht melden. Präzision bei jedem Western-Blot-Schritt ist entscheidend, um die Testgenauigkeit zu erhöhen.

Dieser Test weist das Vorhandensein spezifischer Proteine ​​in einer gemischten Gewebe-, Blut-, Urin- oder Speichelprobe nach. Es wird verwendet, um Krankheiten, die Auswirkungen von Arzneimitteln und Sportdoping zu erkennen. Es spielt auch eine wichtige Rolle in allen Bereichen der wissenschaftlichen und klinischen Forschung.

Die Western-Blot-Analyse wird im Bereich der Molekularbiologie eingesetzt und in Anlehnung an seinen Vorgänger, den Southern-Blot-Test, benannt, der DNA-Sequenzen in DNA-Fragmenten nachweist. Ein weiterer ähnlich benannter Test ist der Northern Blot, der RNA-Moleküle lokalisieren kann.

Es gibt acht Western-Blot-Schritte, die alle genau durchgeführt werden müssen:

  • Vorbereitung des Western-Blot-Puffers
  • Probenvorbereitung
  • Trennung von Proteingemischen mittels Gelelektrophorese
  • Transfer getrennter Proteine ​​auf eine Membran (Blotting)
  • Inkubation mit Membranblockierung
  • Nachweis des Zielproteins
  • Datenanalyse

Puffervorbereitung

Western-Blot-Tests erfordern verschiedene Puffer, die Veränderungen des pH-Werts der Probe während des Testprozesses widerstehen. Auch Färbemittel – zum Beispiel Coomassie Brillantblau und Pinceau S – und Entfärbelösungen müssen nach Standardrezepturen gemischt und verdünnt werden.

Puffer werden während der Zelllyse (Zerfall), der Proteintrennung, des Proteintransfers und der Blockierungsphasen verwendet.

Probenvorbereitung

Für die Western-Blot-Analyse benötigen Sie zunächst eine Gewebeprobe. Auch diese Probe muss vorbereitet werden. Probenzellen werden mit mechanischen Methoden bei niedrigen Temperaturen aufgebrochen. Niedrige Temperaturen verhindern den Abbau von Proteinen. Methoden des Zellaufschlusses sind:

  • Homogenisierung: Mischen von Partikeln zu einer Emulsion oder Lösung
  • Beschallung: Verwendung von Schallenergie (Ultraschallfrequenzen), um Partikel zu bewegen und zu mischen
  • Hochdruckaufschluss: Homogenisieren unter Hochdruck

Die Probe wird dann mit einem Puffer weiter zerlegt. Es muss der richtige Lysepuffer verwendet werden oder das zu untersuchende Protein kann nicht ausreichend extrahiert werden.

Proteintrennung

Gewebebasierte Proben sind komplex. Sie enthalten eine große Anzahl, Typen und Strukturen kleinerer Polypeptidketten und größerer Proteine. Sie können auch Lipide und Kohlenhydrate enthalten.

Jede Zelle enthält Organellen, die teilweise oder hauptsächlich aus Proteinen aufgebaut sind, von Mikrotubuli bis zu Mitochondrien. Der Nachweis eines Proteintyps aus einer Gewebeprobe ist ohne Labortechniken wie Western Blotting nicht möglich.

Der nächste Western-Blot-Schritt besteht daher darin, diese Makromoleküle innerhalb einer Probe zu trennen. Während die Präparation ganze Zellen aufbricht, geht die Proteintrennung noch einen Schritt weiter. Die Standardmethode zur Proteintrennung ist die Gelelektrophorese. Die Gelelektrophorese verwendet einen elektrischen Strom, um Makromoleküle durch eine Gelplatte zu zwingen.

Eine typische Elektrophoresekammer besteht aus einer Gelplatte, die zwischen zwei Glas- oder Pappplatten sitzt. Abstandshalter innerhalb der Gelplatte halten die Kammer gleichmäßig. Je dicker die Platte ist, desto mehr Proben kann sie aufnehmen, jedoch wird die Wärme nicht so effizient abgeleitet und die Ergebnisse werden weniger genau. Elektrophoresekammern werden in einem Elektrophoresetank platziert, der das erforderliche elektrische Feld bereitstellt.

Es gibt zwei Arten der Elektrophorese – ein- und zweidimensional. Die eindimensionale Methode trennt Routineproteine. Mit der zweidimensionalen Elektrophorese können Sie mehrere Proteinproben gleichzeitig und auf demselben Gel vergleichen. Unterschiedliche Zielproteine ​​werden mit unterschiedlichen Farbstoffen markiert. Dieser Artikel beschreibt die eindimensionale Form.

Native Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) und Natriumdodecylsulfat-PAGE (SDS-PAGE) sind die am häufigsten verwendeten Methoden der Proteintrennung in der Western-Blot-Analyse. Diese verwenden ein einziges auflösendes Gel. Ein anderer Name für das Auflösen von Gel ist Trenngel.

Andere Chemikalien werden kurz vor der Durchführung des Tests hinzugefügt, um innerhalb des Gels zu polymerisieren (Molekülketten zu erzeugen). Diese werden ohne Anwesenheit von Sauerstoff als O . zugegeben2 stört den Polymerisationsprozess. Dies bedeutet, dass die Elektrophoresekammer zuerst entgast werden muss. Die Polymerisation beeinflusst die Größe der durch das Gel verlaufenden Poren und macht das endgültige Western-Blot-Ergebnis genauer.

Ein weiteres Gel – ein Stapelgel – bewirkt, dass sich Probenproteine ​​aneinanderreihen. Stapelgele fungieren als Äquivalent zur Startlinie bei einem Pferderennen und stellen die Teilnehmer auf, bevor sie sich (viel langsamer) durch das sich auflösende Gel bewegen.

Da verschiedene Proteine ​​unterschiedliche Molekulargewichte haben, bewegen sie sich mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten durch das sich auflösende Gel und auf eine Membran. Dadurch werden sie voneinander getrennt.

Protein- oder Western-Blot-Transfer

Der Proteintransfer ist das Ergebnis einer elektrischen Ladung, die die Probenproteine ​​umgibt. In einem kontrollierten elektrischen Feld werden Proteine ​​vom Gel zur Membran geleitet und geschoben. Wenn die getrennten Proteine ​​die Membran erreichen, „blotten“ sie darauf.

Der Western-Blot-Transfer erfolgt entweder nass oder halbtrocken. Andere, langsamere Methoden sind Diffusion, Kapillarwirkung und Vakuumübertragung. Während nasses Elektroblotting in einem Elektrophoresetank genauere Ergebnisse liefert, sind halbtrockene Techniken schneller.

Die Blotting-Membran sitzt am nächsten an der positiven Elektrode des Gelelektrophoresetanks und geladene Proteine ​​werden dorthin gezogen. Sie sind zu Beginn der Proteintrennphase von negativ geladenen Ionen umgeben. Wenn ein elektrischer Strom zugeführt wird, schieben Pufferchemikalien negativ geladene Ionen vor und hinter die Proteine. Diese negativ geladenen Ränder bewegen sich dann mit unterschiedlichen Geschwindigkeiten entlang der Kammer, angezogen von der positiven Ladung in der Nähe der Membran. Die Geschwindigkeit wird durch das Molekulargewicht einzelner Proteine ​​gesteuert (Molekularsiebung).

Die abgetrennten Proteine ​​werden schließlich auf die Membran blot. Diese Proteinstapel, die zwischen negativ geladenen Ionen eingebettet sind, erzeugen je nach Probenmenge gefärbte Linien unterschiedlicher Dicke, die je nach Molekulargewicht auf unterschiedlichen Niveaus erscheinen. Die Porengröße beeinflusst, wie viele Proteine ​​sich durch die Gelplatte bewegen – größere Proteine ​​werden durch kleinere Poren blockiert.

Es ist möglich, Elektrophoresekammern mit vormarkierten Proteinen zu kaufen, deren genaue Molekulargewichte bekannt sind. Diese werden Kalibriergele genannt und dienen als Referenzmarker zur Bestimmung der Molekulargewichte weniger bekannter Proteine.

Membranblockierung

Blockierungspuffer sind für genaue Western-Blot-Ergebnisse unerlässlich. Sie verhindern die Bindung von Antikörpern an die Blotting-Membran.

Nach dem Protein-Blotting ist die Membran mit Proteinen gesättigt, es gibt jedoch noch leere Bereiche. Da diese Membran speziell zum Auffangen und Festhalten von Proteinen entwickelt wurde – und da Antikörper auch Proteine ​​sind – könnte die Membran selbst das Endergebnis beeinflussen.

Ohne Membranblockierung würde ein Western-Blot-Ergebnis das Äquivalent von Hintergrundrauschen auf einer Videoaufnahme zeigen, wodurch das Bild unscharf würde. In Bezug auf Western-Blot-Blockierungspuffer ist dieses Rauschen eine Quelle falsch positiver Signale. Ein anderer Begriff für Membranblockierung ist Antikörpersondierung.

Blockierungspuffer füllen Leerräume innerhalb der Membran aus. Überraschenderweise ist Magermilchpulver ein häufig verwendeter Puffer. Andere Blockierungspuffer werden aus Produkten wie Fischgelatine, Albumin, Blutserum und dem proteinfreien Polyvinylpyrrolidon (PVP) hergestellt.

Antikörper-Inkubation

Es gibt zwei Verfahren zur Antikörperinkubation, die auf direkten und indirekten Proteinnachweistechniken basieren. Direct Western Blot verwendet einen einzelnen (primären) Antikörper, um ein einzelnes Protein nachzuweisen. Dieser markierte Antikörper bindet an das Zielprotein das Tag ist ein Farbstoff oder Enzym, das die Ergebnisse sichtbar macht.

Die indirekte Western-Blot-Methode verwendet zwei Antikörper – einen Primärantikörper, der an das Zielprotein bindet, und einen markierten Sekundärantikörper, der die Position des Primärantikörpers erkennt und markiert und ihn sichtbar macht.

In gentechnisch veränderten Tieren werden große Mengen an Antikörpern (Immunglobulinen) hergestellt. Monoklonale Antikörper sind rein künstlich hergestellt. Sie erkennen nur eine Art von Antigen-Epitop – den Teil eines Antigens, an den Immunglobuline binden. Monoklonale Antikörper sind teuer, liefern jedoch in vielen Fällen genauere und konsistentere Ergebnisse als polyklonale Antikörper.

Polyklonale Antikörper sind Immunglobulin (Ig)-Gruppen, die mehrere Epitope erkennen. Jeder Antikörper innerhalb dieser Gruppe verhält sich jedoch wie ein monoklonaler Ig – er erkennt ein Epitom auf einem Antigen. Bei Verwendung polyklonaler Antikörper im Western Blot ist der Test kostengünstiger durchzuführen, jedoch besteht ein höheres Risiko der Kreuzreaktivität – des Nachweises ähnlicher, aber nicht gleicher Antigene.

Die Inkubationszeiten des Primärantikörpers hängen davon ab, wie leicht es für das Ig ist, sich an das Zielprotein zu binden – seine Bindungsaffinität. Durchschnittliche Zeiten sind ungefähr zwei Stunden bei Raumtemperatur (20 °C oder 68 °F) oder über Nacht bei Temperaturen von 4 °C (39,2 °F). Zu lange Inkubationszeiten erzeugen mehr Signalrauschen.

Für die indirekte Inkubation muss die Membran vor dem Auftragen des Sekundärantikörpers mehrmals im entsprechenden Waschpuffer gespült werden. Die Inkubationszeiten des sekundären Antikörpers sind ungefähr die gleichen wie bei der Anwendung des primären Antikörpers.

Nachweis des Zielproteins

Die Nachweisverfahren variieren je nach Western-Blot-Techniken, gemäß denen Antikörper-Tags verwendet wurden. Antikörpermarkierungen können mit bloßem Auge oder mit Hilfe von Röntgenfilm, Lichtsensorkameras (ladungsgekoppelte Vorrichtung), fluoreszierenden digitalen Bildgebern und Nahinfrarot-Spektroskopieinstrumenten nachgewiesen werden.

Vor dem Nachweis müssen alle primären oder sekundären Antikörper von der Membran gespült werden. Dadurch werden weitere Reaktionen verhindert.

Eine gute Proteinvisualisierung ist für eine korrekte Analyse der Ergebnisse unerlässlich. Eine schlechte Proteinerkennung wird normalerweise durch menschliches Versagen oder kontaminierte, fehlerhafte oder veraltete Lösungen, Materialien und Geräte verursacht.

Datenanalyse

Die Western-Blot-Datenanalyse erfordert heute normalerweise die Umwandlung von Membranscans in ein digitales Format.

Die Werte der Proteinbanden werden gemessen, indem sie mit einem Marker verglichen werden, dessen Molekulargewicht bekannt ist.

Die Analyse muss mehrere wichtige Faktoren berücksichtigen:

  • Nachweisgrenze: Einige Proteine ​​sind nicht so leicht nachweisbar.
  • Signalstabilität: Andere Reaktionen, wie z. B. bakterielle Kontamination, können dazu führen, dass Signale mit der Zeit verblassen oder sogar verschwinden.
  • Linearer Dynamikbereich: Bei guter Nachweisgrenze ist der Dynamikbereich – das Verhältnis von Proteinmenge zur Signalintensität – linear.
  • Signal-Rausch-Verhältnis: Proteine, die den Zielproteinen ähnlich sind, werden ebenfalls erkannt – diese erzeugen Hintergrundrauschen für alle Zielproteinsignale.

Westlicher Fleck

Einführung

Das Analyseverfahren Western Blot (oder Immunoblot) ermöglicht die Identifizierung und Quantifizierung einzelner Proteine ​​aus einem komplexen Gemisch (z. B. Zell- oder Gewebeextrakt). Im Allgemeinen umfasst die Technik die Trennung von Proteinen unter denaturierenden Bedingungen durch Gelelektrophorese, die elektrophoretische Übertragung oder das "Blotting" der Proteine ​​vom Gel auf eine feste Trägermembran, die Sondierung der Membran mit einem für ein Zielprotein spezifischen Antikörper und die anschließende Visualisierung des gebundenen Antikörpers unter Verwendung markierter sekundärer immunologischer Reagenzien. Daher ist die Western-Blot-Technik ein wesentlicher Assay für die proteomische Analyse von Geweben in Gesundheit und Krankheit oder kultivierten Zellen unter unterschiedlichen Bedingungen. Im Folgenden sind spezifischere technische Überlegungen zur Durchführung einer Western-Blot-Analyse aufgeführt.


Western Blot Doctor™ — Blot-Hintergrundprobleme

28.02.23 09:30 AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN und LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0

Der Western Blot Doctor ist eine Anleitung zur Selbsthilfe, mit der Sie Ihre Western Blot-Probleme beheben können. In diesem Abschnitt finden Sie Lösungen für Probleme mit dem Blot-Hintergrundsignal.

Andere Abschnitte im Western Blot Doctor:

Probleme und Lösungen

Klicken Sie auf das Miniaturbild, das für Ihren eigenen Fleck am repräsentativsten ist, um die wahrscheinlichen Ursachen zu ermitteln und spezifische Lösungen für das Problem zu finden.

Problem: Weiße Flecken oder Regionen auf dem Fleck

Schaumstoffpads für Bio-Rad Nasstank-Blotting-Systeme:

  • Mini Trans-Blot ®-System (1703933)
  • Kriterium&Trade Blotter (1704086)
  • Trans-Blot-System (1703914)
  • Trans-Blot Plus-System (1703995)

Als diagnostischer Test können Sie die Übertragungsqualität überprüfen, indem Sie Proteine ​​auf dem Gel und Blot abbilden. Wenn Sie planen, den Blot in nachfolgenden Schritten zu verwenden, stellen Sie sicher, dass Ihr Farbstoff entfernt werden kann oder mit dem Antikörpernachweis kompatibel ist. Coomassie und kolloidales Gold sind beispielsweise nicht mit nachfolgenden Schritten kompatibel (siehe Bio-Rad Protein Stains und die Auswahlanleitung für Proteine).

  • Hochintensive Transfers in Tank-Blotting-Proben können zu einer Puffererwärmung führen, die zur Blasenbildung führt, stellen Sie sicher, dass der Puffer kühl bleibt
    • Reduzieren Sie den Strom und erhöhen Sie die Übertragungszeit, um dies zu kompensieren
    • Führen Sie den Transfer in einem Tankgerät durch, das in Eis oder einem temperaturgeregelten Raum (4°.C) platziert ist
    • Puffer vor Gebrauch kühlen
    • Verwenden Sie eine Kühlschlange oder einen &ldquoblue ice&rdquo-Einsatz in der Zelle
    • Mini-Trans-Blot-System (1703919)
    • Kriterium Blotter (1704076, 1704087)
    • Trans-Blot-System (1703912)
    • Trans-Blot Plus-System (1703990)
    • Nitrozellulose: Weiße Bereiche auf der Nitrozellulosemembran zeigen trockene Bereiche an, in denen Protein nicht bindet. Wenn die Benetzung durch Eintauchen der Folie in Transferpuffer nicht sofort eintritt, destilliertes Wasser bis knapp unter den Siedepunkt erhitzen und die Membran bis zur vollständigen Benetzung einweichen. Äquilibrieren in Transferpuffer bis zur Verwendung
    • PVDF: Weiße Bereiche auf der PVDF-Membran zeigen Bereiche an, in denen die Membran entweder nicht richtig vorbenetzt wurde oder austrocknen konnte. Aufgrund der hydrophoben Natur von PVDF muss die Membran vor dem Äquilibrieren in wässrigem Transferpuffer in Methanol vorbenetzt werden. Wenn die Membran nass ist, darf sie nicht austrocknen. Wenn die Membran trocknet, in Methanol wieder befeuchten und in TBS-T äquilibrieren (Vorsicht: kann nachgeschaltete Detektionsprozesse beeinträchtigen)

    Problem: Hoher Hintergrund auf Blot

    • Erhöhen Sie die Konzentration des Blockers (z. B. 3 und 5 % BSA, Kasein oder fettfreie Trockenmilch)
    • Verlängern Sie die Dauer des Blockierungsschritts (über Nacht bei 4°C statt 1 Stunde bei Raumtemperatur oder längere Inkubation bei Raumtemperatur)
    • Temperatur erhöhen, bei der gesperrt wird (bis Raumtemperatur)
    • Verwenden Sie ein anderes Blockierungsreagenz (Albumin, Gelatine, BSA, Kasein oder fettfreie Trockenmilch)
    • Weitere Blockierungsreagenzien:
    • Verwenden Sie ein reines Protein wie BSA oder Casein als Blocker (siehe Detergenzien und Blockierungsreagenzien).
    • Blockierpuffer nicht wiederverwenden
    • Reduzieren Sie die Inkubationszeit mit dem Nachweissubstrat
    • Wenn Sie ein kolorimetrisches Reagenz verwenden, entfernen Sie den Blot aus der Substratlösung, wenn das Signal-Rausch-Verhältnis akzeptabel ist, und tauchen Sie ihn in entionisiertes Wasser ein
    • Reduzieren/optimieren Sie die Konzentrationen von primären und/oder sekundären Antikörpern
    • Verwenden Sie einen Dot-Blotting-Versuch, um die Antikörperkonzentrationen zu optimieren
    • Inkubationszeiten reduzieren/optimieren
    • Stellen Sie sicher, dass alle Inkubationstabletts zwischen den Experimenten vollständig gereinigt sind
    • Verwenden Sie Einweg-Tabletts
    • Übermäßige Proteinbeladung
    • Zu viele SDS im Übertragungspuffer
    • Übermäßige Proteinbeladung:
    • Reduzieren Sie die Proteinmenge auf dem Gel
    • Probenbeladung optimieren siehe Bestimmung der geeigneten Probenbeladung für das Western Blots-Protokoll
    • Reduzieren Sie die Konzentration von SDS im Transferpuffer
    • Fügen Sie eine zweite Membranfolie hinzu, um überschüssiges Protein zu binden
    • Probieren Sie andere Blockierungsreagenzien aus, z. B. Albumin, Gelatine, BSA, Casein oder fettfreie Trockenmilch (siehe Bio-Rad-Detergenzien und Blockierungsreagenzien und weitere Blockierungsreagenzien).
    • Verwenden Sie keine Milch, um die Membranen zu blockieren, wenn Sie das Avidin-Biotin-System verwenden, da Milch Biotin enthält
    • Länge und/oder Anzahl der Waschschritte erhöhen (mindestens 5 x 5 min)
    • Verwenden Sie eine größere Menge Waschpuffer
    • Verwenden Sie eine kürzere Belichtungszeit
    • Verwenden Sie die Multi-Acquisition-Funktion der Datenerfassungssoftware
    • Filmbenutzer:
      • Warten Sie 5 und 10 Minuten und belichten Sie dann den Fleck erneut mit dem Film (Film)
      • Reduzieren Sie die Belichtungs- und/oder Entwicklungszeit (Film)
      • Erwägen Sie den Wechsel zu einem digitalen Bildgebungssystem wie Bio-Rad&rsquos ChemiDoc&trade Imaging Systems
      • Stellen Sie sicher, dass die Membran zu Beginn des Verfahrens gründlich benetzt ist
      • Wiederholen Sie den Vorgang und achten Sie darauf, dass der Blot bei keinem Schritt austrocknet, indem Sie währenddessen ausreichende Volumina verwenden und rühren
      • Stellen Sie sicher, dass die Membran während aller Schritte in den Inkubations- und Waschpuffern eingetaucht bleibt
      • Verwenden Sie ein frisches Aliquot des Antikörpers, das bei &ndash20°C oder darunter gelagert wurde
      • Wenn Sie einen Antikörper über einen sehr langen Zeitraum lagern, sollten Sie ihn bei &ndash80°C . lagern
      • Stellen Sie Antikörper-Aliquots her und tauen Sie nur eines nach dem anderen auf, wenn dies für die Blots erforderlich ist
      • Vermeiden Sie wiederholte Einfrier-Auftau-Zyklen
      • Versuchen Sie es mit einer niedrigeren Inkubationstemperatur wie 4°.C
        Hinweis: Die Inkubationszeit muss verlängert werden
      • Versuchen Sie es stattdessen mit Nitrocellulose (siehe Western Blotting-Membranen)
      • Erhöhen Sie die Stringenz der Waschschritte:
      • Verwenden Sie TBS mit 0.05&ndash0.1% Tween 20
      • Versuchen Sie es mit einem stärkeren Reinigungsmittel wie NP-40
      • Verwenden Sie frische Puffer
      • Filtern Sie alle Puffer durch einen 0,2-Mikrometer-Filter, bevor Sie ihn zum Waschen oder Blockieren verwenden und bevor Sie Antikörper hinzufügen

      Problem: Fleckiger oder fleckiger Hintergrund

      • Verwenden Sie bei allen Inkubationsschritten einen Shaker
      • Stellen Sie sicher, dass die Membran zu Beginn des Verfahrens gründlich benetzt ist
      • Wiederholen Sie den Vorgang und achten Sie darauf, dass der Blot bei keinem Schritt austrocknet, indem Sie ausreichende Volumina verwenden und durchgehend rühren. Stellen Sie sicher, dass der Blot immer untergetaucht ist
      • Membran nicht mit bloßen Händen anfassen. Tragen Sie immer saubere Handschuhe und behandeln Sie Blots nach Möglichkeit mit einer sauberen Pinzette
      • Stellen Sie sicher, dass Elektrophoresegeräte, Blotting-Geräte und Inkubationstabletts sauber und frei von Verunreinigungen sind
      • Vermeiden Sie es, den Fleck auf Oberflächen zu berühren
      • Waschpuffervolumen erhöhen
      • Verwenden Sie während aller Inkubations- und Waschschritte einen Schüttler
      • Vermeiden Sie das Stapeln von Blots in einem einzigen Inkubationsbehälter
        • Stellen Sie beim Stapeln von Blots in einem einzigen Inkubationsbehälter sicher, dass zwischen den Blots ein ausreichender Pufferfluss vorhanden ist. Die Blots sollten sich während der Inkubations- und Waschschritte unter Bewegung frei aneinander vorbei bewegen

        Problem: Ungleichmäßige Flecken auf Flecken oder gesprenkeltem Hintergrund

        • Sekundärantikörper und/oder Filter zentrifugieren, um Aggregate zu entfernen
        • Stellen Sie sicher, dass das Blockierungsreagenz vor der Verwendung vollständig im Puffer gelöst ist
        • Stellen Sie frische Puffer her, wenn Sie Blockierungspuffer aus trockenen Reagenzien herstellen
        • Vorgefertigte Blockierungspuffer vor Gebrauch auf Ausfällungen prüfen
        • 0,05&ndash0,1% Tween 20 zum Blockierungspuffer hinzufügen
        • Filtern Sie den Blockierungspuffer vor der Verwendung durch einen 0,2-Mikrometer-Filter
        • Blot mit Waschpuffer vor der Inkubation mit Antikörpern waschen
        • Probieren Sie ein anderes Blockierungsreagenz aus, z. B. Albumin, Gelatine, BSA, Casein oder fettfreie Trockenmilch (siehe Bio-Rad-Detergenzien und Blockierungsreagenzien und weitere Blockierungsreagenzien).
        • Entfernen Sie nach dem Transfer alle restlichen Acrylamidgelspuren von der Oberfläche der Membran, bevor Sie mit den nachfolgenden Schritten fortfahren
        • Überprüfen Sie, ob die Scan- und Kassettenoberflächen sauber sind
        • Verwenden Sie frische Puffer. Stellen Sie eine neue Puffercharge her und wiederholen Sie den Blot
        • Filterpuffer zum Blockieren und Waschen durch 0,2 & Mikrometer Filter
        • Das Einwickeln von Blots in Plastikfolie oder heißversiegelte Beutel ist ein guter Schutz gegen Partikelkontamination und Blot-Austrocknung bei der Bildaufnahme.

        Problem: Schatten der Gelkassette auf Blot übertragen (Tank Blotter)

        • Schaumstoffpolster reinigen oder ersetzen
          • Schaumstoffpads für Bio-Rad Nasstank-Blotting-Systeme:
            • Mini Trans-Blot ®-System (1703933)
            • Kriterium&Trade Blotter (1704086)
            • Trans-Blot-System (1703914)
            • Trans-Blot Plus-System (1703995)
            • Reduzieren Sie die Proteinmenge auf dem Gel
            • Probenbeladung optimieren siehe Bestimmung der geeigneten Probenbeladung für das Western Blots-Protokoll
            • Reduzieren Sie die Menge an SDS im Transferpuffer
            • Fügen Sie eine zweite Membranfolie hinzu, um überschüssiges Protein zu binden
            • Bereiten Sie frischen Transferpuffer vor. Stellen Sie eine neue Puffercharge her und wiederholen Sie den Blot
            • Filterpuffer zum Blockieren und Waschen durch 0,2 & Mikrometer Filter

            28.02.23 09:30 AE,AI,AL,AM,AR,AT,AU,AZ,BA,BD,BE,BF,BG,BH,BN,BO,BR,BW,CA,CH,CL ,CM,CN,CO,CR,CY,CZ,DE,DK,DO,DZ,EC,EE,EG,EH,ER,ES,ET,FI,FM,FO,FR,GA,GE,GF,GH ,GP,GR,GT,GU,HK,HN,HR,HT,HU,ID,IE,IL,IN,IS,IT,JM,JO,JP,KE,KH,KR,KW,KZ,LB,LI ,LK,LT,LU,LV,MA,MD,MG,MK,ML,MO,MQ,MS,MT,MU,MX,MY,NG,NI,NL,NO,NP,NZ,OM,PA,PE ,PF,PG,PH,PK,PL,PR,PS,PT,PW,PY,QA,RO,RS,RU,SA,SB,SE,SG,SI,SK,SN,ST,SV,TG,TH ,TN,TO,TR,TT,TW,TZ,UA,UG,UK,US,UY,UZ,VA,VE,VU,XK,YE,ZA,VN und LSR /LSR/Technologies/Western_Blotting N 0


            Hoher Hintergrund in Western Blots

            Der Westerns-Blot-Assay ist eine leistungsfähige Technik zur Analyse der Proteinexpression. Mit diesem einzigen Assay können einzelne Proteine ​​auf Molekulargewicht, posttranslationale Modifikationen und Häufigkeit untersucht werden. Western Blots sind relativ einfach durchzuführen und erfordern keine teuren Geräte oder Reagenzien, was sie zur Hauptstütze für viele Labore macht.

            Der Schlüssel zu einem erfolgreichen Western Blot ist die Verwendung eines Antikörpers, der spezifisch mit einem einzelnen Protein reagiert und eine geringe Kreuzreaktivität mit anderen Proteinen aufweist. Ein erfolgreicher Blot hängt auch davon ab, ein Signal:Rausch-Verhältnis zu erhalten, das den Nachweis des Proteins mit minimalem Hintergrund ermöglicht. Ein hoher einheitlicher Hintergrund und ein fleckiger, ungleichmäßiger Hintergrund sind häufige Probleme bei Western Blots. Dieser Wiki-Eintrag beschreibt häufige Ursachen und Lösungen für einen hohen Hintergrund in Western Blots.

            Gleichmäßig hoher Hintergrund

            Ein einheitlich hoher Hintergrund ist ein Hintergrund, der den gesamten Fleck verdunkelt, wodurch es schwierig wird, bestimmte Banden zu sehen. Ein einheitlicher Hintergrund kann aus verschiedenen Gründen resultieren.

            Hohe Konzentration von Antikörpern

            Wenn zu hohe Antikörperkonzentrationen verwendet werden, können sie die Membran sättigen und beschichten und unspezifisch binden. Dies führt zu einem gleichmäßig hohen Hintergrund über den gesamten Blot. Bei Verwendung von Enhanced Chemiluminescence (ECL) leuchtet der Blot manchmal sogar im Dunkeln.

            Antikörper titrieren

            Um einen hohen Hintergrund aufgrund einer hohen Antikörperkonzentration zu reduzieren, titrieren Sie die Antikörper. Ein Dot-Blot kann verwendet werden, um sowohl primäre als auch sekundäre Antikörper in einem schachbrettartigen Muster zu titrieren.

            Unzureichende Blockierung

            Das Blockieren der Membran ist ein entscheidender Schritt, der eine unspezifische Bindung von Antikörpern an die Membran verhindert. Eine ausreichende Blockierung wird durch Inkubation des Blots in einem geeigneten Blockierungspuffer erreicht. Art des Blockierungsmittels, Länge und Temperatur der Inkubation können die Wirksamkeit der Blockierung beeinflussen.

            Blockierungsreagenzien

            Die Wahl des Blockierungsreagenzes hängt von der jeweiligen Antigen:Antikörper-Wechselwirkung ab und wird am besten empirisch bestimmt.

            Fettfreie Trockenmilch wird häufig als erste Wahl verwendet. Es wird oft empfohlen, 5% Milch zum Blockieren zu verwenden, jedoch kann diese Milchkonzentration manchmal das nachgewiesene Protein maskieren, insbesondere wenn es nicht reichlich vorhanden ist. Wir empfehlen, mit 1% Milch zu beginnen.

            Milk can be incompatible with certain antibodies and detection systems (see Interference from incompatible blocking agents), and in this case, 3% bovine serum albumin (BSA) is a second protein-based blocking agent that can be used.

            Several companies market protein-free blocking agents such as AdvanBlock-PFby Advansta. Protein-free agents prevent interference, but also can be used in combination with protein-based agents to increase blocking capacity.

            Length and temperature of incubation

            Blocking for 1 hour at room temperature with agitation is usually sufficient to block the membrane. However, blocking can also be performed overnight at 4°C with agitation.

            Interference from incompatible blocking agents

            Uniform high background can be observed when blocking agents interact with antibodies causing interference. For example, antibodies can bind to proteins in protein-based blocking agents and result in high uniform background. In particular, animal serum containing unpurified primary antibodies can bind to animal proteins in blocking reagents. In addition, non-fat dry milk can specifically react with certain antibodies or detection reagents. Milk contains casein, a phosphoprotein that can react with phospho-specific antibodies. Milk also contains variable amounts of avidin that can interfere with avidin-biotin detection systems. Both of these interactions will result in high uniform background.

            Test different blocking reagents

            The appropriate blocking agent should be determined for each antigen:antibody combination. As discussed above, the two most common blocking agents are non-fat dry milk and bovine serum albumin. If neither of these agents is adequate, then protein-free or non-animal protein blocking reagents, such as AdvanBlock can be used. Alternatively, normal serum that is from the same species as the animal that the primary antibody was produced in can be used as a blocking reagent.

            Insufficient washing

            It is important to wash the blot sufficiently after incubation with primary and secondary antibodies to remove excess antibodies. Poor washing can contribute to high uniform background.

            Change volume, length and number of washes

            Perform washes in a large volume, change the wash solution often and agitate the membrane during the washing steps. A recommended protocol is to wash the membrane 3 times after each incubation, washing for 5 minutes per wash. The number of washes and length of wash time can be increased to improve washing efficiency however overwashing can decrease signal strength.

            Increase stringency of washing with detergent

            The stringency of the washing step can be increased by including detergent in the wash solution to disrupt non-specific interactions. Tween-20 (0.05%) is commonly used in wash buffers. A slightly stronger detergent, such as 0.05% NP-40 can be used to increase stringency of the wash. Note: Only highly purified detergents should be used as impurities in detergents can interfere with horse radish peroxidase detection systems. Detergent should be freshly added to wash solutions as detergents can promote the growth of bacteria and cause high background (see Bacterial Contamination).

            Different membrane types (nitrocellulose versus PVDF) and vendor and/or lot sources of membranes can affect the level of background. The age of the membrane and how membranes are handled can also impact the degree of background obtained.

            Membrane types

            The choice of membrane should be determined empirically for each antigen:antibody combination. Nitrocellulose membranes tend to give the lowest background, however they are brittle, cannot be stripped and reprobed and many not bind smaller proteins. Polyvinylidene difluoride (PVDF) membranes have a high binding capacity, but may give higher background.

            Membrane handling

            PVDF membranes require activation in methanol and equilabration in water prior to use. High uniform background will be seen if these steps are omitted or not performed appropriately. Refer to the manufacturer’s instructions for a protocol.

            Membranes should never be allowed to dry out as this will also result in high uniform background.

            The use of precut membanes, such as the precut PVDF or nitrocellulose membranes sold by Advansta can minimize handling and contact with dirty scissors.

            Source of membrane

            Background levels can also vary depending upon the vendor source of membranes. If high background is seen, a different source can be tried to lower background.

            Age of membrane

            Older membranes can give high uniform background, therefore pay attention to expiration dates and use newer membranes to decrease background.

            Bakterielle Kontamination

            Bacterial contamination of buffers can lead to high background.

            Buffers containing detergent and milk, which can promote bacterial growth, should be made fresh.

            Overexposure of membrane

            Long exposure times will enhance overall background, without increasing sensitivity.

            Several options can be tried to decrease exposure times. If possible, load more protein to increase abundance of the target antigen. Make sure the primary antibody is titrated well. Try different primary antibodies if available. Alternatively, use a detection reagent designed for low abundance proteins such as Advansta’s WesternBright Quantum HRP substrate.

            Blotchy, Uneven or Speckled Background

            In addition to having high uniform background, Western blot background can include uneven splotchy background, random black smudges, white spots or cleared areas, uneven bands, and random speckles. There are several reasons for this type of background.

            Chemiluminescent reagents are attracted to dust and dirt that may fall onto the blot during washes or be transferred to the blot from dirty equipment. Background from dust and dirt is usually seen as random speckles on the blot.

            Start dirt-free

            To prevent dust and dirt contamination, wash all equipment that comes in contact with the membrane, this includes the transfer apparatus and trays used for incubations. Filter all buffers and solutions to remove particles. Keep covers on dishes to prevent dust from falling into solutions during incubations.

            Air Bubbles

            If air bubbles are on the membrane during transfer, they will prevent proteins from adhering to the membrane. If bubbles attach to the membrane at a later time, they can prevent the blocking solution or antibodies from accessing the membrane. Air bubbles can cause splotchy blots, white circles or cleared areas, and incomplete bands.

            Air bubbles during transfer set-up

            To prevent air bubbles when setting up the transfer, gently roll a pipette over each portion in the “sandwich” stack (membrane, filter paper, transfer sponge) after it has been put in place.

            Air bubbles during transfer and incubations

            Air is created in the transfer buffer due to the mixing of methanol with aqueous buffer. When possible, prepare transfer buffer 1-2 days in advance. If fresh buffer has to be used, degas the buffer by filtration, vacuum or sonication. In addition, transfer at a lower voltage to prevent bubbles.

            Avoid agitating the blot too vigorously during incubations and creating bubbles.

            Poor Handling of Membrane

            Splotches, lines and dark spots often arise due to poor handling of membrane.

            Membrane manipulation

            Always handle membranes with gloved hands and use forceps for manipulations. Oils on the hand will cause dark splotches. Be careful not to fold the membrane making a crease, this will cause dark lines. Do not scratch the membrane when adding solutions or using forceps. Make sure the membrane is saturated with solutions during incubations to prevent areas from drying out.

            Activation and equilibration of PVDF

            When using PVDF, it is important to activate the membrane and then equilibrate the membrane in an aqueous solution, as described above. When methanol reacts with aqueous solutions, air bubbles are created that may stick to the membrane and prevent equilibration and diffusion, giving a splotchy background. Make sure the membrane is equilibrated following the manufacturer’s instructions. If there is a temperature difference between the solutions (i.e. water is cold and methanol is at room temperature), then the methanol might not be displaced adequately therefore try to maintain even temperature when preparing the membrane.

            Insufficient Mixing of Buffer Components

            Buffer components, such as detergents and blocking agents can stick to the membrane and cause dark spots if they are not completely solubilized. This is particularly common with non-fat dry milk.

            Completely mix buffer components

            Make sure all solutions are mixed thoroughly before use blocking solutions can be vortexed. Solutions can also be filtered before use.

            Antibody not Evenly Distributed During Incubation

            Uneven splotchy background or incomplete bands can occur if the antibody is not evenly distributed over the membrane during incubations.

            Keep membrane covered with solutions

            Use enough antibody solution to completely cover the membrane. Agitate the blot on a shaker during incubations.

            Excessive Detection Reagents on Blot

            If detection reagents pool unevenly on the membrane the can cause a splotchy background.

            Remove excess detection reagents

            To remove excess detection reagents carefully blot the protein side of the membrane with a Kim-wipe or drop the membrane onto filter paper quickly to wick off liquid. Wrap the membrane in plastic wrap prior to exposure to prevent further drying.

            See Multiple Bands for troubleshooting Western blots with multiple discrete bands. Also, see our blog for a quick Western blot protocol.


            Western Blotting

            The western blot (or immunoblot) technique has been a fundamental in protein analysis since the 1970s, the decade when it was first discovered that biomolecules could be spotted directly onto membranes (spot ELISA or DNA dot blots), or transferred from gels (southern blots, northern blots, western blots). Despite the now routine application of western blotting, successful results can depend on several factors including optimal membrane selection for the desired detection method and protocol.

            Western blotting is an analytical technique in molecular biology often used to investigate and characterize a protein’s post-translational modifications, for protein identification, and in protein production validation. Simple, yet effective, the western blot has applications in many settings including basic science research, biopharmaceutical production, forensics, and diagnostics.

            Achieve Reliable and Reproducible Western Blot Results

            The key to reliable and reproducible western blot results is a clean, low-background image. Problems can arise from:

            • low tensile strength membranes
            • high background signal
            • high membrane burn-through
            • limited compatibility with detection methods

            What is Your Western Blot Detection Method of Choice?

            While the steps in western blotting protocols remain the same, detection methods vary.

            • The first step in a western blot is the separation of proteins via gel electrophoresis from a sample containing a mixture of proteins. Pall’s Nanosep ® centrifugal devices with low protein-binding Omega™ membranes are ideal to concentrate samples for gel electrophoresis.
            • Once separated on the gel, the proteins are transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane or a nitrocellulose membrane. This step immobilizes the proteins for further analysis.
            • The membrane is then incubated with labelled antibodies specific to the protein of interest.
            • After incubation, the membrane is washed to remove any unbound antibodies and further analysed by various immunodetection techniques.

            The most commonly used detection methods involve radiolabels, fluorophores, chromogenic and chemiluminescent enzymatic reactions. Each approach has its own benefits and considerations:


            Western blot (immunoblot)

            In today’s procedure, you will probe your blots with antibody to the GFP ‘tag’ on your fusion proteins this will ultimately reveal a protein band whose molecular weight (MW) is a combination of the GFP protein’s MW (

            26 kDa) plus that of the protein product of your gene. This value can be determined by counting the nucleotides in the ‘grey’ plus ‘green’ regions of your color-coded gene diagram. Begin “word count” with the first grey-shaded nucleotide, and count the entire area through and including the red “stop” TAA codon at the end of the ‘green’ GFP region. Divide this number by three to obtain the number of codons (which is the number of amino acids coded for) multiply this by 110* to obtain the approximate MW (in daltons) of your fusion protein. For ex., 1500 nucleotides means 500 codons and therefore 500 amino acids 500 x 110 = 55,000 daltons (or 55 kilodaltons, kDa).

            * The average molecular weight of an amino acid is 110 daltons

            Overview of a typical immunoblot procedure:

            A specific, single protein on a gel can be visualized through immunoblot analysis with an antibody that recognizes the protein of interest. To perform an immunoblot, the separated proteins within the gel are first transferred onto a membrane (usually nitrocellulose or PVDF) that can be treated with antibody solutions. After preliminary incubation of the membrane in excess ‘inert’ protein (eg, milk) to block non-specific protein binding reactions, the membrane is then incubated with a primary antibody, which is an antibody that was generated to specifically recognize the ‘protein of interest’. For our purposes this target protein is GFP, the common “C-terminal tag” of all the fusion proteins. The excess primary antibody is removed after a brief incubation period, then the blot is “washed” with buffer to remove non-specifically or weakly bound antibodies.

            After this, a secondary antibody that recognizes the first (primary) antibody is incubated on the blot. This secondary antibody, which is raised against antibodies of a specific species, (e.g. anti-mouse antibodies or anti-rabbit antibodies) is covalently linked to an enzyme (typically horseradish peroxidase, HRP) that catalyzes a localized light-generating reaction in the presence of substrate. This is called chemiluminescent detection (using chemical reactions to generate light) and the emitted photons are captured using the CCD camera of the BioChemi imaging unit. The chemiluminescent substrate mixture for HRP consists of peroxide buffers and a proprietary variation of luminol designed to generate light from very small quantities of protein.

            Ultimately, this produces an image of your blot with ‘white’ glowing bands on a black background. The image can be ‘reversed’ for clarity, and these images typically are, prior to presentation in a report or publication.

            Antibodies as tools for detection of proteins :

            Among all the proteins extracted from the transfected tumor cells and resolved in the electrophoresis step, the western blot allows the detection of a single protein, or more specifically, a single protein domain or epitope, on the blot. For the detection of your GFP fusion proteins, we are using an antibody that binds specifically to GFP, and should therefore detect each fusion protein regardless of what the ‘fusion partner’ is.

            In a western immunoblot, the primary antibody could be ‘monoclonal’ or ‘polyclonal’, and the choice made by the user is typically based on the most effective antibody available for the given protein and/or the specific information needed. A monoclonal antibody is derived from a single clone of the antibody- producing “B” cells of an immunized mouse or rat2. All of the antibody (Ab) molecules in these preparations have identical specificity in that they recognize the same epitope3 on the target protein. In contrast, a polyclonal antibody preparation is a combination of the antibody products of multiple “B” cell clones these are typically derived from the sera of immunized rabbits, goats, or sheep, and they collectively recognize multiple epitopes (regions) on the target protein. Whether you use a monoclonal or polyclonal antibody as your primary antibody in a western blot depends on a number of things -availability, effectiveness, cost- but most importantly on whether you need the precise specificity that a monoclonal Ab provides (in binding to only a very specific region of the protein) or whether it would be sufficient for a ‘larger’ region to be recognized, in which case a polyclonal Ab would work just fine. Our antibody against GFP (anti-tGFP) happens to be a mouse monoclonal antibody, purchased through Origene.

            The secondary antibody (an “anti-antibody”) in a western blot protocol is, by definition, isolated from a species other than the species that produced your primary Ab. This antibody (typically polyclonal) will bind to multiple common determinants (i.e., epitopes) on antibodies from the species that generated the primary antibody. The secondary antibody may be referred to as a “rabbit anti- mouse” antibody (derived from rabbit antibody to mouse antibodies), a “goat anti-rabbit” antibody (derived from goat antibody to rabbit antibodies), “sheep anti-rabbit antibody” (derived from sheep antibody to rabbit antibodies), etc. Our secondary antibody for use in GFP detection is an HRP-linked goat anti-mouse antibody, or “GAM-HRP”, purchased from Pierce.

            Immunoblot Protocol- adding primary antibody:

            Two hours prior to lab, you will come to lab very briefly to add primary antibody to your blocked blots. Remember to keep track of which team is on which ‘half’ of blot.

            1. First, pour off (in sink) the blocking solution from the PVDF blot.
            2. To each tray, add

            *The primary antibody solution consists of: a mouse monoclonal antibody (mAb) that recognizes tGFP , diluted 1:2000 4 in 1X TBST with 0.5% milk. (Clone 2H8, cat# TA 150041, from OriGene Technologies Inc.)

              Close the tray and place on the rocker at the back of 406. The blots will incubate in primary antibody solution at room temperature for

            Washing, secondary antibody incubation, and development :

            300 ml of 1X TBST (no milk), prepared from the 2X concentrate, for washing purposes if more is needed, it can be made up quickly leftover 1X can be saved.

            At the end of the 10 antibody incubation period,

            1. Pour off and discard primary antibody, taking care to support PVDF membrane with gloved finger(s).
            2. Rinse the blot two times for a few seconds each, with enough 1X TBST to cover blot, pouring each rinse down the sink.
            3. Perform three subsequent washes of the blot, each with sufficient 1X TBST to cover the blots (more than 10 ml, but not so much as to spill out of the tray). Wash by rocking the submerged blot in its closed tray, on the rocking platform as follows:

            • 10 minutes5 (then discard the wash down the sink)

            • 5 minutes (discard wash solution as above)

            • 5 minutes (do not discard immediately see step #4 below)

            1. During the final wash (or before), 10 ml of secondary antibody solution needs to be prepared for each blot ( G oat A nti- M ouse, HRP-conjugated). The GAM-HRP will have been diluted (by instructor) by 1:10,000 (a ‘substock’) in the same buffer as the primary antibody (1X TBST/0.5% milk) you need to further dilute this substock by 1:5 , for a final dilution of 1:50,000 . To do this, simply add 2 ml of the GAM-HRP substock to 8 ml of 1X TBST/0.5% milk (provided) in a 15 ml tube. Mix by inverting a few times.
            2. Discard the final wash solution from step 3 add the entire 10 ml of the prepared GAM-HRP solution from step 4. (Do NOT let the blot dry out!)
            3. Incubate on the rocking platform in 406 for

            Protein size can be estimated by comparison to known molecular weight standards that are run beside the experimental samples. We have used BioRad’s “Kaleidoscope” as our molecular weight standards (see pdf in Bb for labeled image) these are recombinant pre-stained proteins designed to provide a highly accurate ladder of convenient sizes. [A standard curve generated by plotting the log of their molecular weights vs. migration distance (Rf) in a SDS- PAGE gel reveals a straight line with r2 = 0.996.]


            Signal, Background, and Noise in Western Blot Imaging

            Optimization of the upstream steps of western blotting for maximum sensitivity is largely about maximizing signal while minimizing background. Selection of an imaging system is no different and the most sensitive systems can detect low signal while introducing low levels of background noise that may obscure detection of that signal.

            Two important and related measures of an imaging system&rsquos performance are: its ability to generate images with a high signal-to-background, and high signal-to-noise ratios. Understanding both will allow you to better evaluate an imaging system and any images taken with that system.

            Signal-to-Background

            The goal for researchers performing western blots is to maximize the band from the protein of interest while minimizing the background seen on the membrane. This background is often a result of incomplete blocking, insufficient washing of excess antibody, or an improperly hydrated PVDF membrane (when using fluorescence detection).

            Signal to Noise

            Noise is the statistical uncertainty when measuring the intensity at a pixel. For example, a pixel may have a value of 1,000 during one instance, but a value of 1,100 the second time it is measured. This variation relates to the amount of noise that is accumulating within that signal. While a uniform background is relatively easy to subtract, noisy background may obscure a weak signal and is difficult to subtract from the analysis.

            Signal to Background Measurement

            High signal with uniform background. One common signal to background measurement is the intensity of the pixel divided by the mean intensity of the background pixels.

            Average background intensity

            If background is uniform, subtraction is straight forward, and the signal can be easily distinguished.

            Signal-to-Noise Measurement

            High signal with noisy background. A signal to noise measurement would be the intensity of the pixel divided by the standard deviation in the intensities of the background pixels.

            Standard deviation of background intensity

            Signal among high noise can make background subtraction difficult.

            Signal Collection

            The entire system matters. Detection of low-expressing proteins requires that all parts of an imaging system work together to most efficiently gather the light from the blot.

            Assay

            A good image starts with a good blot. Whether the blot is chemiluminescent or fluorescent, proper upstream processing is critical for sensitive and quantitative detection of your protein.

            Light that is generated from the blot must be collected efficiently for maximum sensitivity. The light-gathering ability of a lens is given by the focal ratio, or f number and is the ratio of the focal length to the diameter of the aperture. A lens with a large aperture will admit more light and is given a lower f number. Western blot imaging systems with lenses with lower f numbers will be more sensitive.

            Diameter of open aperture, D

            The most sensitive systems can use lenses with f numbers as low as 0.94.

            Sensor

            Light that is collected by the lens must then be efficiently captured and converted to an electronic signal by the image sensor. Two primary factors are the physical size of the pixels and their quantum efficiency.

            The physical size of a pixel, called pixel pitch, is presented to incoming photons for a given pixel. Larger pixels act as larger buckets and can capture more photons. For a given sensor size, there is a tradeoff with resolution since the same area divided amongst a greater number of pixels means each pixel is physically smaller.

            Quantum efficiency is similar in concept to the quantum yield measurement for fluorophores. It is the percentage of incident photons that are then converted to an electrical signal as electrons by the sensor. Note that for any given sensor, quantum yields vary across the spectrum.

            Optical Filters

            For fluorescent western blots, proper optical filtering to only allow the right wavelength to pass the excitation and emission filters is critical to acquire images with high signal and low background.

            Sources of Noise

            Selection of the best reagents and proper upstream processing is not only critical to minimizing background, but also for sensitive western blots. To get the most out of your western blot, it is important to understand and select an imaging system that minimizes the introduction of noise or background into the blot image.

            The major electronic sources of noise and background in a western blot image are read noise and dark noise produced within the camera, and the shot noise, which is from the statistical behavior of photons striking the sensor.

            Read Noise

            When an image sensor is read out, the accumulated charge in each pixel must be converted from an analog quantity to a digital signal. This action of reading each pixel introduces noise by the electronics within the camera. High read noise contributes to overall noise in an image and may obscure faint signals that are just at the noise floor.

            With CCD cameras, the charges of all pixels are converted to voltage through a common pipeline off of the chip so they are subject to the same source of noise. However, with CMOS sensors, each pixel has its own associated amplifier so each pixel has its own amount of associated read noise that may vary slightly between pixels.

            Whether based on mature CCD sensors or newer CMOS chips, Bio-Rad engineers have designed cameras with circuitry and components to minimize read noise during image acquisition in order to maximize sensitivity.

            Dark Current

            Dark current is the electric current that is generated through a CCD or CMOS chip even when no photons are striking the sensor. It is generated by the thermal energy in the silicon and is dependent on the temperature of the sensor. Higher temperatures cause greater dark current. Excessive dark current is controlled by cooling the sensor. Note that the largest reduction occurs with just a few degrees of cooling and a point of diminishing returns is typically achieved between &ndash5°C and &ndash 10°C

            The thermal energy from the dark current also carries a statistical fluctuation that is called dark noise. Since the noise generated by dark current follows Poisson statistics, the dark noise scales with the square root of the dark current. For western blotting imagers, active sensor cooling reduces dark noise so much so that it is usually small relative to read noise, until exposure times become lengthy, around 5 minutes.

            Bio-Rad imagers designed for chemiluminescent detection actively cool the chip and maintain a constant temperature to minimize dark current to enable long exposures with minimal background noise.

            Shot Noise

            Shot noise, or photon noise, is the statistical noise associated with the discrete arrival of individual photons to a pixel on a sensor. Since photons act as discrete packets, their measurement obeys Poisson statistics.

            An important characteristic of Poisson statistics is that the standard deviation of a measurement is equal to the square root of the average. For example, if 10,000 photons are collected on average, the standard deviation would be about 100. But if on average 100 photons are collected, the deviation from the average will be 10. This means that as the light intensity increases, the shot noise also increases, but at a slower rate. Since signal increases linearly, but shot noise increases at the square root of the intensity, the signal-to-noise ratio actually improves with increasing intensity. Thus, shot noise is more apparent at low illumination than at high illumination.

            Cosmic Rays

            For chemiluminescent blots, detection of low abundance proteins often require exposure times of several minutes. During this time, high-energy cosmic rays may strike the sensor, causing an increase in charge in a pixel, which is indistinguishable from the normal arrival of photons. Depending on the angle that the ray strikes the chip, it can leave an artifact in the shape of a bright dot (when the ray hits the sensor straight on) or as a streak (when the ray strikes the sensor at a low angle).

            Exposure times of a few minutes can collect several such cosmic ray events. Since the bands on western blots are fairly large, and the artifacts caused by cosmic rays are small dots or a streak of only a single pixel wide, software algorithms such as those in Bio-Rad imaging systems, can be used to remove these artifacts from the image.

            How Noise Scales with Exposure Time

            The different sources of noise from the imaging system scale respond differently to increasing exposure times:

            • Signal from the blot increases
            • Read noise is constant
            • Dark noise increases
            • Cosmic rays increase
            • Shot noise increases (but at a slower rate than signal)

            Most western blot imagers allow the acquisition of several short exposures to be combined into a single image. This is useful for getting a general idea for a target exposure time. Since read noise is constant for each exposure, the noise is additive when combined into the final image, these stacked images have higher noise than if a single long exposure were taken. For this reason, Bio-Rad imaging systems use sophisticated auto-exposure algorithms to arrive at the appropriate exposure time to eliminate the need for adding several images together.


            Verweise

            de Kok JB, Roelofs RW, Giesendorf BA, Pennings JL, Waas ET, Feuth T, Swinkels DW, Span PN. Normalization of gene expression measurements in tumor tissues: comparison of 13 endogenous control genes. Lab Invest. 200585:154–9.

            Gilda JE, Gomes AV. Western blotting using in-gel protein labeling as a normalization control: stain-free technology. Methoden Mol Biol. 20151295:381–91.

            Taylor SC, Berkelman T, Yadav G, Hammond M. A defined methodology for reliable quantification of Western blot data. Mol Biotechnol. 201355(3):217–26.


            Negative Controls

            Negative controls will help you rule out any non-specific binding of antibodies to components in your sample. A negative control helps validate that the signal you see is from the binding of the antibody to the target antigen epitope only, and not from background interaction.

            An example of an appropriate negative control could be loading buffer without sample or lysate that is known to not contain your target of interest 2,3 .

            Presence of signal in the lane loaded with a negative control indicates that antibodies may be interacting with non-specific targets or components within sample/loading buffers.

            Incorporate suitable control samples in your study design to validate the results of the experiment. Positive and negative controls provide helpful checkpoints to confirm specificity of the antibody to target.

            Learn more how the Data Integrity&trade Bundle can help you get the best possible quantitative Western blotting results.

            Verweise

            Know the difference between fixed and gradient gel types.

            The type and composition of gel you use influences protein separation and detection. Find out what's best for your study.


            Schau das Video: Transfer proteins to the membrane for Western blot analysis (Januar 2022).