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Wie ist der Stand der automatisierten quantitativen Analyse?


Die quantitative Analyse von Mikroskopbildern ist für viele Studientypen unerlässlich, aber die am häufigsten verwendeten Techniken sind sehr arbeitsintensiv. Ich habe einige Literatur über die Verwendung von Computern zur Durchführung der Analyse finden können, aber ich habe kein gutes Bild vom Stand der Technik.

  • Gibt es eine gute Literaturübersicht zu dem Thema?

  • Gibt es in der Praxis viel Nutzen, den ich noch nicht gesehen habe?


Nature Methods scheint eine ganze Reihe von Methoden zu veröffentlichen, die diese Art der Analyse erleichtern. Z.B. http://www.nature.com/nmeth/journal/v8/n3/full/nmeth.1558.html

Und ein Editorial von ihnen: http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n7/full/nmeth.2102.html Als Teil einer Sonderausgabe über BioImage Informatics mit einigen schönen Beispielen. http://www.nature.com/nmeth/journal/v9/n7/index.html


Das gesuchte Wort ist „Bildsegmentierung“. Aber auch hier kommt es sehr darauf an, was man betrachtet. Die Segmentierung und Quantifizierung einfacher Fluoreszenzbilder ist relativ einfach und weit verbreitet. Es kann sehr komplex werden, je nachdem, wie komplex die Struktur ist, die Sie betrachten. Es gibt Ansätze des maschinellen Lernens, die in der Lage sind, komplizierte Strukturen wie unterschiedliche Mitosezustände voneinander zu unterscheiden.

Die Segmentierung von Hämatoxylin-Eosin (HE)-gefärbten Proben ist Gegenstand intensiver bioinformatischer Forschung. Ein Ziel ist es, Pathologen bei der Einstufung von Gewebeläsionen, beispielsweise bei Prostatakrebs, zu unterstützen, aber dies wird meines Wissens noch nicht klinisch eingesetzt. Ganz-Slide-Scans von histologischen Präparaten werden klinisch immer häufiger verwendet. Diese Bilder sind sehr groß (1 GB pro Präparat), daher liegt ein Forschungsschwerpunkt auch in der groß angelegten Analyse dieser Ganzdia-Scans.

Werfen Sie auch einen Blick auf CellProfiler (http://www.cellprofiler.org), diese kostenlose Open-Source-Software hat mein Promotionsprojekt gerettet.

Literatur die ich gefunden habe:

Tabesh, A., M. Teverovskiy, et al. (2007). "Multifunktions-Prostatakrebsdiagnose und Gleason-Grading von histologischen Bildern." IEEE Trans Med Imaging 26(10): 1366-1378.

Petushi, S., F. U. Garcia, et al. (2006). "Groß angelegte Berechnungen von Histologiebildern zeigen graddifferenzierende Parameter für Brustkrebs." BMC Med Imaging 6: 14. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC1634843/

Eine aktuelle Bewertung kann ich Ihnen jedoch nicht vorlegen…


Ein automatisiertes System zur quantitativen Analyse der Fortbewegung von Drosophila-Larven

Drosophila Larven wurden als Modell verwendet, um genetische und zelluläre Schaltkreise zu untersuchen, die das Verhalten modulieren. Eine der Herausforderungen in der Verhaltensforschung ist die Quantifizierung komplexer Phänotypen wie des Bewegungsverhaltens. Die experimentellen Möglichkeiten können durch einen automatischen Einzeltier-Tracker, der ein Tier über einen längeren Zeitraum mit hoher Auflösung aufzeichnet und mehrere Verhaltensparameter analysiert, erheblich verbessert werden.

Ergebnisse

Hier präsentieren wir MaggotTracker, ein Einzeltier-Tracking-System für Drosophila larvale lokomotionsanalyse. Dieses System steuert den motorisierten Mikroskoptisch während der Videoaufnahme, sodass das Tier im Beobachtungszentrum bleibt. Es reduziert dann das Tier auf 13 gleichmäßig verteilte Punkte entlang der Mittellinie und berechnet über 20 Parameter, die Form, Peristaltikbewegung, Ausdauer und Spur des Tieres bewerten.

Um seinen Nutzen zu demonstrieren, haben wir MaggotTracker angewendet, um sowohl Wildtyp- als auch mutierte Tiere zu analysieren, um Faktoren zu identifizieren, die das Bewegungsverhalten beeinflussen. Jedes Tier wurde vier Minuten lang verfolgt. Unsere Analyse an Canton-S-Larven im dritten Larvenstadium ergab, dass die zurückgelegte Distanz eines Tieres mit seiner Schrittgeschwindigkeit korrelierte und nicht mit dem Prozentsatz der Zeit, die das Tier mit dem Laufen verbrachte, und dass die Schrittgeschwindigkeit sowohl mit der Distanz als auch mit der Dauer von einem korrelierte schreiten. Sexueller Dimorphismus wurde bei der Körperlänge beobachtet, jedoch nicht bei den Bewegungsparametern wie der Geschwindigkeit. Die Lokomotivparameter wurden durch das Entwicklungsstadium des Tieres und die Krabbeloberfläche beeinflusst. Bei Mutanten zirkadianer Gene wie wurden keine signifikanten Veränderungen der Bewegungsgeschwindigkeit festgestellt Zeitraum (pro), Auszeit, und zeitlos (tim). Die MaggotTracker-Analyse hat das gezeigt Äther ein Go-Go (eag), Shaker (NS), Langweiler (langsam), und Dunce (dnc). Darüber hinaus sind die phänotypischen Muster der K + -Kanal-Gene eag, NS und langsam sind sehr ähnlich.

Schlussfolgerungen

Diese Ergebnisse zeigten, dass MaggotTracker ein effizientes Werkzeug für die automatische Phänotypisierung ist. Die Software MaggotTracker sowie die hier präsentierten Daten können von unserer frei zugänglichen Seite www.WormLoco.org/Mag heruntergeladen werden.


Ein Korrelationsalgorithmus für die automatisierte quantitative Analyse von Schrotflinten-Proteomikdaten

Quantitative Schrotflinten-Proteomanalysen werden durch chemische Markierungen wie ICAT und metabolische Markierungsstrategien mit stabilen Isotopen erleichtert. Die schnelle Hochdurchsatzproduktion quantitativer "Shotgun"-Proteomdaten erfordert die Entwicklung von Software, um automatisch massenspektrometrisch abgeleitete Daten von Peptiden in relative Proteinhäufigkeiten umzuwandeln. Wir beschreiben ein Computerprogramm namens RelEx, das eine Regression der kleinsten Quadrate zur Berechnung der Peptidionenstromverhältnisse aus den massenspektrometrisch abgeleiteten Ionenchromatogrammen verwendet. RelEx ist tolerant gegenüber schlechten Signal-Rausch-Daten und kann nicht verwendbare Chromatogramme und Ausreißerverhältnisse automatisch verwerfen. Wir wenden eine einfache Korrektur für systematische Fehler an, die die Genauigkeit der quantitativen Messung um 32 +/- 4% verbessert. Unser automatisierter Ansatz wurde mit markierten Mischungen aus bekannten Molverhältnissen validiert und in einer realen Probe durch Messung der Wirkung von osmotischem Stress auf die Proteinexpression in Saccharomyces cerevisiae demonstriert.


Abstrakt

Quantitative Schrotflinten-Proteomanalysen werden durch chemische Markierungen wie ICAT und metabolische Markierungsstrategien mit stabilen Isotopen erleichtert. Die schnelle Hochdurchsatzproduktion quantitativer „Shotgun“-Proteomdaten erfordert die Entwicklung von Software, um automatisch massenspektrometrisch abgeleitete Daten von Peptiden in relative Proteinhäufigkeiten umzuwandeln. Wir beschreiben ein Computerprogramm namens RelEx, das eine Regression der kleinsten Quadrate zur Berechnung der Peptidionenstromverhältnisse aus den massenspektrometrisch abgeleiteten Ionenchromatogrammen verwendet. RelEx ist tolerant gegenüber schlechten Signal-Rausch-Daten und kann nicht verwendbare Chromatogramme und Ausreißerverhältnisse automatisch verwerfen. Wir wenden eine einfache Korrektur für systematische Fehler an, die die Genauigkeit der quantitativen Messung um 32 ± 4% verbessert. Unser automatisierter Ansatz wurde mit markierten Mischungen aus bekannten Molverhältnissen validiert und in einer realen Probe demonstriert, indem die Wirkung von osmotischem Stress auf die Proteinexpression gemessen wurde Saccharomyces cerevisiae.

Diese Autoren haben gleichermaßen zu dieser Arbeit beigetragen.

An wen soll die Korrespondenz gerichtet werden. E-Mail: [E-Mail protected] Telefon: 858-784-8862. Fax: 858-784-8883.


DISKUSSION

Die quantitative Analyse der molekularen und zellulären Dynamik ist entscheidend, um die zugrunde liegenden Mechanismen zu verstehen. Kymographen sind eine sehr leistungsfähige Möglichkeit, die Zeitabhängigkeit dieser Prozesse darzustellen und können prinzipiell verwendet werden, um quantitative Einblicke in ihre Dynamik zu erhalten. Die Automatisierung der Kymographenanalyse war jedoch insbesondere bei komplexen Daten mit niedrigem SNR schwierig. Als Konsequenz wird die Analyse in vielen Fällen durch menschliche Sichtprüfung durchgeführt. Hier haben wir ein neues, zuverlässiges Set an Softwaretools für die Generierung (KymographLöschen) und Analyse (KymographDirect) von Kymographen.

Zum Nachweis der Zuverlässigkeit der automatisierten Kymographenanalyse durch KymographDirect, haben wir dieses Werkzeug ausgiebig mit simulierten Kymographen getestet, die ein breites Spektrum dynamischer Prozesse und Bildgebungsbedingungen darstellen, wie sie in der Literatur zu finden sind. Trajektorien werden typischerweise mit Subpixel-Genauigkeit extrahiert, selbst bei einem SNR nahe 1 (Abbildungen 2B, 3, B und D, 5B, 7B und 8C). Selbst für Kymographen mit niedrigem SNR ist die Anwendung in der Lage, die meisten Trajektorien zu extrahieren. Bei SNR > 2 werden mindestens 80 % und meistens 90 % der Trajektorien zuverlässig aufgedeckt (Abbildungen 3, C und E, 5, C und E, 7, D und E sowie 8, D und E). Die Fähigkeit des Algorithmus, Geschwindigkeiten präzise zu bestimmen, hängt in den meisten Fällen von der Stochastik des untersuchten Prozesses ab, die auftretende Unsicherheit beträgt höchstens einige Prozent (Abbildungen 2C und 7, C und E).

Wir haben die Anwendbarkeit von KymographDirect zu einer Vielzahl von experimentellen Kymographen. KymographDirect wurde verwendet, um Trajektorien einzelner Proteine ​​zu extrahieren, die in vitro auf DNA diffundieren und translozieren (Abbildung 4), Trajektorien des Rands wachsender Mikrotubuli in vitro (Abbildung 6) und Trajektorien von Gruppen molekularer Motoren in Zilien und Axonen in lebenden Zellen (Abbildungen 9 und 10). Diese Beispiele stellen eine Vielzahl von experimentellen Bedingungen dar, die die Anwendbarkeit unserer Werkzeuge zur quantitativen Bewertung einer Vielzahl biologischer Prozesse in vivo und in vitro unterstreichen. Das zeigen sie auch KymographDirect kann komplexe Trajektorien auf automatisierte Weise zuverlässig extrahieren und Motilitätsparameter wie Momentangeschwindigkeit, ortsabhängige Intensität und Geschwindigkeit sowie Diffusionskonstanten liefern. Im Vergleich zu verfügbaren Einzelpartikel-Tracking-Routinen, KymographDirect bei den getesteten Datensätzen ähnlich oder besser abgeschnitten. Der Vergleich mit den automatisierten Analysetools von Kymograph ist schwieriger, da trotz der Menge der veröffentlichten Algorithmen im Vergleich zu diesem Tool nur ein halbautomatisches Tool öffentlich verfügbar ist. KymographDirect bietet einen höheren Grad an Automatisierung und Präzision des getesteten Datensatzes. Alle hier analysierten Anwendungen nutzten die Fluoreszenzmikroskopie, aber im Prinzip KymographDirect und KymographLöschen kann auch auf Daten angewendet werden, die mit Hellfeldmikroskopie, einschließlich Phasenkontrast- und Differentialinterferenzkontrastmikroskopie, gewonnen wurden.

Kymographen werden häufig von der Zellbiologie und Biophysik verwendet, um Bewegung zu visualisieren. Es fehlten automatisierte quantitative Analysetools für Kymographen, was die Forscher daran hinderte, Motilitätsparameter manuell zu extrahieren. Hier haben wir ein neuartiges Toolset für die Generierung und automatisierte Analyse von Kymographen vorgestellt, das auch unter stark überfüllten und niedrigen SNR-Bedingungen zuverlässig ist. Wir gehen davon aus, dass das Toolset es Mikroskopikern ermöglichen wird, ihre Bilder mit hoher Genauigkeit, Zuverlässigkeit und Durchsatz zu analysieren, wodurch Entdeckungen in der molekularen und zellulären Dynamik beschleunigt werden.


Ergebnisse

Die Qualität binarisierter Bilder

Tomographische Schnitte des Lungengewebes von zwei post mortem (intakte) Tiere, die sowohl mit dem 2.9 μm-Pixel-Größe und die 1,1 μOptiken mit m-Pixel-Größe sind in Abb. 7 aufgetragen. Die Schnitte sind beide beschnitten, um eine Fläche von 0,8 × 0,8 mm 2 abzudecken. In den Rohbildern mit niedrigerer Auflösung in Abb. 7a sind die dünnen Wände zwischen den Alveolen (Septen) sichtbar, gehen aber im Segmentierungsschritt verloren [wie durch die grünen Pfeile in Abb. 7b angezeigt]. Mit der hochauflösenden Optik können die Septen im binären segmentierten Bild [wie in Fig. 7d gezeigt] durch Anwendung unserer Segmentierungstechnik wiederhergestellt werden. Bei der Durchführung des „Rigged-Image“-Schritts im Segmentierungsverfahren (Schritt C in Abb. 3) treten jedoch kleine Artefakte auf, die im segmentierten Bild durch die roten Pfeile gekennzeichnet sind [siehe Abb. 7d]. Da sowohl die hoch- als auch die niedrigauflösende Optik unter schwach belichteten Bedingungen Bildsegmentierungsartefakte erzeugt, müssen wir deren Implikationen im Hinblick auf die anschließende quantitative Analyse kurz diskutieren.

Vergleich zwischen niedrigauflösender und hochauflösender Optik für ein 0,8 × 0,8 mm 2 Sehfeld auf zwei zufällig ausgewählten Regionen: (ein) zeigt den tomographischen Schnitt des 2.9 μOptik mit m-Pixel-Größe (B) das entsprechende binäre segmentierte Bild (C) zeigt den tomographischen Schnitt des 1.1 μm-Pixel-Optik und (D) zeigt das entsprechende segmentierte Bild. Die Pfeile zeigen Artefakte an, die durch die Segmentierung eingeführt wurden.

Bei den niedriger aufgelösten Bildern [Abb. 7a und 7b] führt das fast vollständige Verschwinden der Septumoberflächen während des Segmentierungsschritts dazu, dass für eine topologische Analyse der Gasaustauschfläche (der Alveolen) entscheidende Daten fehlen. Somit erscheinen die Daten mit niedriger Auflösung für eine quantitative Krümmungsanalyse ungeeignet. Für die Analyse der Luftvolumendickenkarte gehen wir jedoch davon aus, dass die Artefakte nur eine marginale Rolle spielen werden, da erwartet wird, dass sie nur Einzelpixel-Änderungen in den lokalisierten Luftraumvolumina erzeugen. Es bleibt also nur noch übrig, ein „ausreichend“ gut segmentiertes Volumen zu finden, bevor die Daten für die weitere Analyse eingegeben werden. Die Unterscheidung zwischen einer „guten“ und „schlechten“ Segmentierung kann manchmal mehrdeutig sein, da die Unterscheidung nach unterschiedlichen Kriterien (biologische Merkmale, SNR etc.) erfolgen kann. Um dieses Problem zu lösen, erstellten wir zunächst einen automatisierten binarisierten 3D-Datensatz [38] und führten unabhängig voneinander eine morphologische „Öffnen“- und „Schließen“-Operation durch, die mit insgesamt drei Datensätzen pro inspiratorischem Spitzendruck endete. Auf diese Weise werden die folgenden quantitativen Ergebnisse unabhängig vom Segmentierungsschritt, da wir nur eine Reihe unterschiedlicher segmentierter Volumina definieren müssen, die wir im Hinblick auf den Erhalt der wichtigsten biologischen Merkmale als wertvoll erachten. Wie wir im nächsten Abschnitt beschreiben, besitzen die Ergebnisse der quantitativen Analyse dann quantifizierbare Unsicherheiten aufgrund möglicher Segmentierungsfehler.

Die Bilder mit höherer Auflösung, wie sie bei der visuellen Inspektion aus den Abbildungen 7c und 7d zu sehen sind, erscheinen sowohl für die Luftvolumendickenkarte als auch für die Krümmungsanalyse geeignet. Auch hier wird erwartet, dass die sichtbaren Artefakte nur eine marginale Rolle bei der Analyse der Luftvolumendickenkarte spielen, während sie topologisch „scharfe“ Oberflächen (mit kleinen Radien) darstellen, die bei topologischer (Krümmung) Auswertung leicht gefiltert werden können. Um den Einfluss verschiedener binärer Bildsegmentierungen zu untersuchen, wurden die Parameter, die eine Benutzerinteraktion in unserer Segmentierungsmethode erfordern (dh diejenigen, die die Erkennung lokaler Maxima im linienförmigen Profilalgorithmus spezifizieren – Schritt „C“ in Abb. 3), manuell variiert um 9 Datensätze für jeden inspiratorischen Spitzendruck zu erzeugen, was zu Datensätzen mit unterschiedlichem Grad an sichtbaren Artefakten führt. Dies waren insbesondere die minimale/maximale Breite zur Unterscheidung von Alveolarsepten im jeweiligen Linienprofil sowie die minimale Grauwertschwelle, die Alveolarsepten gegenüber dem Hintergrund definiert. Anschließend wurden alle Datensätze in die quantitativen Analysealgorithmen eingegeben.

Ergebnisse der Luftvolumendickenkarte

Wie bereits erwähnt, wurden für beide Optiken mehrere binarisierte 3D-Datensätze pro inspiratorischem Spitzendruck (3 unterschiedliche Segmentierungen für die niedrigauflösende Optik und 9 unterschiedliche Segmentierungen für die hochauflösende) erstellt, um den Einfluss des Segmentierungsschritts auf die die quantitativen Ergebnisse. Dies spiegelt sich in Abb. 8 und Tabelle 1 wider, während die Visualisierungen der Luftvolumendickenkarte (sowohl 2D als auch 3D) nur bei einer ausgewählten Segmentierung pro Aufblasdruck durchgeführt wurden. Ein solches Beispiel ist in Abb. 9 für kleine interessierende Bereiche gezeigt, wo die Luftvolumendickenkarten für jeden einzelnen Spitzeninspirationsdruck den Originaldaten überlagert sind. Die Farben sind in Bezug auf die Strukturdurchmesser abgebildet. Wie zu sehen ist, nimmt mit steigendem Druck eine Zunahme der orange- bis gelben Strukturen zu, die Strukturdurchmessern von ca. 70 entsprechen μm und eine Abnahme der roten Strukturen, entsprechend Strukturdurchmessern von ca. 40 μm.

Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen (PDF) der lokalen Luftvolumendicken für die beiden unterschiedlichen Optiken: (ein) zeigt das Luftvolumendicken-Karten-PDF für das 2.9 μOptik mit m-Pixel-Größe (B) zeigt den für die 1.1 μOptik mit m-Pixel-Größe. Die Unsicherheitsintervalle ergeben sich aus den unterschiedlichen Segmentierungen.

Die Ergebnisse erhält man durch Integration der PDF-s aus Abb. 8 entsprechend den entsprechenden Bereichen.

Strukturdurchmesser, die durch Berechnung der Luftvolumendickenkarte mit dem 1.1 μOptik mit m-Pixel-Größe für drei verschiedene Spitzen-Inspirationsdrücke: (ein) 5 cmH2Ö (B) 10 cmH2Ö (C) 25 cmH2Ö.

In Abb. 8 sind die Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen (PDF) der Luftvolumendickenkarten in Abhängigkeit von den Strukturdurchmessern für die beiden unterschiedlichen Optiken aufgetragen. Die Plots wurden auf strukturelle Luftvolumendicken von bis zu 170 . begrenzt μm aufgrund der einfachen Tatsache, dass große Volumina die Ergebnisse verändern können, wenn sich die Lungen aufblasen, während sie sich in den interessierenden Bereich hinein/aus ihm heraus bewegen. Die farbigen Bereiche hinter jeder Funktion zeigen die Standardabweichungen der quantitativen Ergebnisse in Bezug auf die verschiedenen Segmentierungsparameter, die für die Berechnungen verwendet wurden. Aus den Kurven beobachten wir eine Verschiebung von kleinen Durchmessern (ca. 40 μm) bei einem inspiratorischen Spitzendruck von 10 cmH2O zu größeren Durchmessern (ca. 70 μm) mit steigendem Druck. Dieses Ergebnis ist mit beiden Optiken beobachtbar, und es scheint keine signifikante Änderung der berechneten lokalen Luftvolumendickenverteilungen zwischen den beiden Optiken zu geben. Die Daten, die mit der stärker vergrößernden Optik gewonnen wurden [siehe Abb. 8b], liefern jedoch deutlich genauere (mit geringeren Standardabweichungen) Ergebnisse als die niedriger vergrößernde (wie in Abb. 8a zu sehen). Darüber hinaus erhöht sich der interpulmonale Druck ab 10 cmH20 bis 20 cmH2O führt zu einer deutlichen Vergrößerung des parenchymalen Luftraums, aber der weitere Anstieg ab 20 cmH20 bis 30 cmH2O zeigt nur eine minimale Vergrößerung. Letzteres könnte darauf hindeuten, dass die gesamte Lungenkapazität bei einem interpulmonalen Druck von etwa 20 cmH . erreicht wird2Ö.

In Tabelle 1 sind die volumetrischen Verteilungen in vier verschiedenen Bereichen (20 – 50 μm, 50 − 80 μm, 80 − 110 μm und 110–Ruhe μm) zusammengefasst. Sie werden durch Integration der jeweiligen Verteilungen über die angegebenen Intervalle erhalten und zeigen quantitativ die gleichen Trends: Mit steigendem Inspirationsspitzendruck erfolgt die volumetrische Zunahme bei Reichweite 2 bei gleichzeitiger Abnahme bei Bereich 1.

Wie sowohl aus Abb. 8 als auch aus Tabelle 1 ersichtlich ist, zeigen die Ergebnisse beider Optiken übereinstimmende Trends für die beiden kleineren Bereiche Bereich 1 und Reichweite 2. Die Strukturdurchmesser über 80 μm hingegen erzeugen Wahrscheinlichkeitsdichten, die mit steigendem Inspirationsspitzendruck keinem eindeutigen Trend folgen. Wir erklären diesen Effekt später ausführlicher, beachten jedoch an dieser Stelle, dass dies auf die kleinen interessierenden volumetrischen Bereiche zurückzuführen ist, die zusätzliche Verzerrungen einführen. Strukturdurchmesser von weniger als 20 μm werden bei der Auswertung nicht berücksichtigt, da sie viel kleiner sind als die kleinsten zu erwartenden Durchmesser der Alveolen.

Schließlich zeigen wir in Abb. 10 3D-Darstellungen der Luftvolumendickenkarten für die drei verschiedenen Drücke und die beiden Optiken. In der niedrigauflösenden Optik (größeres Sichtfeld) wurden die großen Atemwege durch Transparenz (sichtbar an den Löchern) ausgeschlossen. Die Linie, die ungefähr von der unteren linken zur oberen rechten Ecke des Blocks verläuft, stellt die Grenze zwischen dem rechten mittleren und rechten Schwanzlappen dar, und es scheint, dass der Mittellappen gemäß der Farbdarstellung stärker an Volumen zunimmt als der kaudale. Dies macht sich dadurch bemerkbar, dass der Mittellappen bei stärkerer Inflation eine „rötlichere“ Farbe annimmt. Daher wurde eine heterogene Inflation sowohl inter- als auch intralobulär beobachtet.

Visualisierung der Luftvolumendickenkarten in 3D: (ein),(C) und (e) zeigen die 10, 20 und 30 cmH2O-Drücke für die 2.9 μOptik mit m-Pixel-Größe (B),(D) und (F) zeigen die für die 1.1 μOptik mit m-Pixel-Größe. RML: rechter Mittellappen RCaL: rechter Schwanzlappen die roten Kreise kennzeichnen Bereiche, die bei gleichem Luftdruck eine geringere Ausdehnung der einzelnen Lufträume aufweisen. Bei höheren Drücken sind mehr orange bis rot gefärbte Volumina sichtbar, d.h. e. Luftmengen mit Strukturdicken von 50 − 80 μm.

Krümmungsergebnisse

Die Interface-Shape-Verteilungen (ISD) für die drei verschiedenen Drücke sind in Abb. 11 dargestellt. Da für jeden inspiratorischen Spitzendruck mehrere ISD-s in Bezug auf die verschiedenen binarisierten Datensätze berechnet werden, die unter Verwendung von neun verschiedenen Parametersätzen für die Segmentierung erhalten wurden, hier die mittleren ISD-s sind aufgetragen. Die höchste Dichte liegt erwartungsgemäß in „Region 1“, verglichen mit dem ISD-Definitionsplot in Abb. 6 und weist auf eine weitgehend ellipsoide Form (dh zum Lungengewebe hin konvex) der Lunge hin, ähnlich der idealen Form der Alveolen [58] . Weiterhin ist erkennbar, dass mit steigenden Drücken eine Umwandlung von einer vielfältigen zu einer gleichmäßigeren Verteilung der Krümmungen auf der Luft-Gewebe-Oberfläche stattfindet. Dies wird durch das Auftreten des hellen (roten) Peaks nach der Erhöhung des interpulmonalen Drucks von 10 auf 20 cmH . sichtbar2O. Der letzte Schritt (ab 20cmH2O bis 30cmH2O) wird in „Region 1“ noch stärker lokalisiert. Der Anstieg von 10cmH2O bis 20cmH2O erzeugt einen viel größeren Unterschied als der Anstieg von 20cmH2O bis 30cmH2O. Dies liegt wiederum daran, dass die gesamte Lungenkapazität bei etwa 20 cmH . erreicht wird2O. Gleichzeitig verschiebt sich der blaue Schweif (Dichte ∼ 90) von „Region 2“ und „Region 3“ (Abb. 11) leicht in Richtung des zentralen Peaks (Richtung rechts). Insgesamt bewegt sich jedoch der Peak mit der höchsten Dichte zu kleineren Hauptkrümmungen (wie durch den Pfeil in Fig. 11 angezeigt) bzw. größeren Radien. Dies ist leicht sichtbar durch die Bewegung des oberen „blauvioletten Schweifs“ (Dichte ∼ 70) zur Mitte hin.

Grenzflächenformverteilungen (ISD) für die freien unterschiedlichen Drücke: (ein) 10 cmH2Ö (B) 20 cmH2Ö (C) 30 cmH2O. Die Pfeile zeigen die Verschiebung hin zu kleineren Hauptkrümmungen (größere Radien).

Zur besseren Verdeutlichung dieser Ergebnisse sind in Abb. 12 zusätzlich sowohl die Gauß- als auch die mittlere Krümmung für die verschiedenen Drücke aufgetragen. Wie zuvor zeigen die farbigen Bereiche hinter jeder Funktion die Standardabweichungen der quantitativen Ergebnisse in Bezug auf die verschiedenen Segmentierungsparameter. Wie aus Fig. 12 ersichtlich ist, sind die Fehlergrenzen sehr klein, was darauf hindeutet, dass die verschiedenen Segmentierungsparameter nur sehr geringen Einfluss auf die Gesamtkrümmungsergebnisse haben.

Wahrscheinlichkeitsdichtefunktionen (PDF) der Gaußschen (ein) und gemein (B) Krümmungen. Die Unsicherheitsintervalle ergeben sich nach wie vor aus den unterschiedlichen Segmentierungsparametern.

Die Gaußsche Krümmung wird am besten durch eine flache Oberfläche wie eine sich ausdehnende Scheibe dargestellt, die isotrop wächst [48]: Wenn die Ausdehnung gleichförmig ist (dh die Gesamtform bleibt gleich), hat sie keine Gaußsche Krümmung, wenn die Randbereiche langsamer wachsen als die mittleren, die Scheibe weist eine parabolische Form auf und die Gaußsche Krümmung ist positiv, und wenn der mittlere Bereich langsamer als die Randbereiche wächst, knickt die Scheibe ein und bildet eine Form mit einer gewellten Kante (z. B. einer Sattelfläche), was zu a negative Gaußsche Krümmung. In unserem Fall beobachten wir einen Anstieg um Null, was darauf hindeutet, dass die vorhandenen Oberflächen in der Lunge nur flacher werden, wie in Abb. 12a zu sehen ist. Andererseits ist bei positiven Gaußschen Krümmungen eine etwas höhere Dichte sichtbar, was wiederum auf das Vorhandensein ellipsoider (konvex zum Lungengewebe hin) Oberflächen hinweist.

Die mittlere Krümmung, wie in Abb. 12b gezeigt, zeigt den oben erwähnten Trend (mit zunehmendem Spitzeninspirationsdruck) zu kleineren Hauptkrümmungen in „Region 1“, was bedeutet, dass positive mittlere Krümmungen in den äußeren rechten Regionen flacher werden. Die Tatsache, dass der Peak in Abb. 12b einen invertierten Trend von 20cmH2O bis 30cmH2O kann auf den gleichen Effekt zurückgeführt werden, der bereits bei der Analyse der Luftvolumendickenkarte beobachtet wurde. Da nämlich nur kleine Teilvolumina intakter Lungen betrachtet werden, können große Atemwege bei höheren Spitzeninspirationsdrücken aus dem volumetrischen Sichtfeld herauswandern, weshalb die Ergebnisse für niedrige mittlere Krümmungen (dh flache Oberflächen, große Atemwege) ) sind mit Vorsicht zu genießen.


Wie ist der Stand der automatisierten quantitativen Analyse? - Biologie

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Automatische Erkennung und quantitative Analyse von Zellen im primären motorischen Kortex der Maus

Yunlong Meng, 1 Yong He, 1 Jingpeng Wu, 1 Shangbin Chen, 1 Anan Li, 1 Hui Gong 1

1 Huazhong-Univ. für Wissenschaft und Technologie (China)

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Neuronale Zellen spielen eine sehr wichtige Rolle bei der Regulierung des Stoffwechsels und der Steuerung von Mechanismen, daher ist die Zellzahl eine grundlegende Determinante der Gehirnfunktion. Durch die Kombination geeigneter Zellmarkierungsansätze mit kürzlich vorgeschlagenen dreidimensionalen optischen Bildgebungsverfahren können koronale Schnitte des gesamten Maushirns mit einer Voxelauflösung von 1 μm aufgenommen werden. Wir haben eine vollständig automatische Pipeline zur Erkennung von Zellschwerpunkten entwickelt und dreidimensionale quantitative Informationen über Zellen im primären motorischen Kortex der C57BL/6-Maus bereitgestellt. Es umfasst vier Hauptschritte: i) Vorverarbeitung ii) Bildbinarisierung iii) Zellschwerpunktextraktion und Kontursegmentierung iv) Laminardichteschätzung. Untersuchungen zur vorgestellten Methode zeigen mit einer durchschnittlichen Recall-Rate von 92,1 % und einer durchschnittlichen Präzisionsrate von 86,2 % eine vielversprechende Detektionsgenauigkeit in Bezug auf Recall und Präzision. Wir analysieren auch die laminare Dichteverteilung von Zellen von der Pialoberfläche bis zum Corpus Callosum aus den Ausgabevektorisierungen der detektierten Zellschwerpunkte im primären motorischen Kortex der Maus und finden signifikante Variationen der Zelldichteverteilung in verschiedenen Schichten. Dieser Ansatz zur automatischen Erkennung von Zellschwerpunkten ist für eine schnelle Zellzählung und eine genaue Dichteschätzung von Vorteil, da eine zeitaufwändige und fehleranfällige manuelle Identifizierung vermieden wird.

© (2014) COPYRIGHT Society of Photo-Optical Instrumentation Engineers (SPIE). Das Herunterladen des Abstracts ist nur für den persönlichen Gebrauch gestattet.


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Einführung

Die Quantifizierung wird unerlässlich sein, da Biologen immer komplexere Facetten der Organismenentwicklung untersuchen [1]. Leider bleibt die qualitative Analyse weit verbreitet, da es oft schwierig ist, zelluläre Prozesse in ihrem nativen Kontext zu messen. Moderne Fluoreszenzsonden und Mikroskopietechniken machen solche Messungen möglich [2–4], aber die anschließende Bildanalyse erfordert spezielle Fähigkeiten, die die Erfahrung der meisten Experimentalisten übersteigen. Automatisierte Analysestrategien haben ähnliche Herausforderungen in der Zytometrie [5–7], Genomik und Transkriptomik [8–11] und anderen Teildisziplinen der Biologie [12, 13] angegangen. Die Bildanalyse hat sich als besonders automatisierbar erwiesen, wobei sich mehrere Computer-Vision-Tools unter Biologen durchgesetzt haben [14-17]. Diese Plattformen sind beliebt, weil sie die Produktivität steigern, die Konsistenz und Sensitivität von Messungen verbessern und den Bedarf an speziellen Rechenkenntnissen überflüssig machen [18–20]. Die Entwicklung ähnlicher Werkzeuge, um Biologen zu helfen, Entwicklungsprozesse in vivo zu untersuchen und zu messen, wird Studien der Embryogenese und Entwicklung weiter in quantitative Bemühungen umwandeln.

Entwicklungsbiologen untersuchen, wie die Expression und Funktion einzelner Gene die Entstehung adulter Phänotypen koordiniert. Sie fragen oft, wie Zellen reagieren, wenn ein bestimmtes Gen, eine RNA oder ein Protein während eines bestimmten Entwicklungsstadiums gestört wird. Die Zellantwort kann durch Veränderungen in der Morphologie oder durch Veränderungen in der Expression anderer Gene gekennzeichnet sein ( 1A ). Experimentelle Bemühungen, diese Frage zu beantworten, wurden historisch durch die Schwierigkeit erstickt, Störungen auf einen einzigen Entwicklungskontext zu isolieren, da die interessantesten Störungsziele oft eine pleiotrope Funktion über mehrere Entwicklungsstadien hinweg übertragen und eine frühe embryonale Letalität auslösen können [21–23].

Experimenteller Rahmen mit mitotischen Klonen, um zu testen, ob regulatorische Interaktionen zwischen einem Störungsziel und einem interessierenden Reporter auftreten oder nicht. Blaue und grüne Marker repräsentieren die jeweiligen Gene, die für das Störungsziel und den Reporter kodieren. (A) Eine störungsinduzierte Abnahme der Reporterspiegel würde bestätigen, dass eine Regulierung stattfindet. (B) Die mitotische Rekombination erzeugt klonale Subpopulationen, die null, eine oder zwei Kopien des Gens tragen, das für ein Störungsziel kodiert. Schwarze Linien zeigen einen genetischen Locus. Nur Gene stromabwärts der Rekombinationsstelle unterliegen der Rekombination. Rote Marker stellen ein Gen dar, das für einen klonalen Marker kodiert, der verwendet wird, um die resultierenden Klone zu identifizieren. Die rote Schattierung des großen Ovals spiegelt das relative Fluoreszenzniveau der klonalen Marker wider.

Die Mosaikanalyse hat sich dieser Herausforderung gestellt in Drosophila durch Begrenzung der Störungen auf eine Untergruppe von Zellen innerhalb der Imaginalscheiben der Larve [24, 25]. Die Technik ergibt ein heterogenes Gewebe, das aus genetisch unterschiedlichen Flecken von Zellen besteht, die klonal verwandt sind. Abgesehen von seltenen De-novo-Mutationen sind die Zellen innerhalb jedes Klons genetisch identisch. Die Klonbildung kann auf bestimmte sich entwickelnde Organe beschränkt werden, indem scheibenspezifische Genpromotoren verwendet werden, um transchromosomale Rekombinationsereignisse in den entsprechenden Imaginalscheiben zu steuern [26, 27]. Der Zeitpunkt dieser Ereignisse bestimmt die Anzahl und Größe der resultierenden Klone [28]. Perturbations are applied by engineering the dosage of a target gene to differ across clones (Fig 1B), resulting in clones whose cells are either homozygous mutant (−/−), heterozygous wildtype (+/−), or homozygous wildtype (+/+) for the particular gene. Labeling these clones with the presence or absence of fluorescent markers enables direct comparison of cells subject to control or perturbation conditions, while maintaining otherwise equivalent developmental and physiological histories between the two cell populations (Fig 2A). Additional reporters may be used to monitor differences in RNA or protein expression, morphology, or cell fate choice across clones (Fig 2B). Variants of this strategy led to seminal discoveries in both neural patterning [29–31] and morphogenesis [32, 33], and remain popular today [34–36].

(A,B) Conventional analysis of a mosaic eye imaginal disc. (A) Clones are identified by visual comparison of clonal marker fluorescence among nuclei. (B) Regions labeled homozygous mutant (−/−) or homozygous wildtype (+/+) for the clonal marker are compared with those labeled heterozygous wildtype (+/−) to assess whether reporter expression differs across clones. Fluorescence bleed-through is arbitrarily diagnosed. (C-H) Quantitative mosaic analysis. Panels depict a magnified view of the region enclosed by red rectangles in panels A and B. (C) Raw confocal image of the nuclear stain, clonal marker, and reporter of interest. (D) Segmentation identifies distinct nuclei. (E) Reporter expression is quantified by averaging the pixel intensities within each segment. Numbers reflect measured values. (F) Measurements may be corrected to mitigate fluorescence bleedthrough. (G) Individual nuclei are labeled homozygous mutant, heterozygous, or homozygous wildtype for the clonal marker. White arrows mark nuclei with ambiguous fluorescence levels. (H) Reporter levels are compared across clones to determine whether the perturbation affects reporter expression. Yellow region marks excluded clone borders. Comparison may exclude clone borders (yellow regions) and focus on a particular region of the image field (black arrows). In the eye imaginal disc, comparison is often limited to a narrow window near the MF (orange arrow).

Quantitative microscopy techniques are well suited to measuring differences in cell behavior across clones. One reporter (a clonal marker) labels the clones, while others quantitatively report properties of their constituent cells, such as the expression level of a gene product of interest (Fig 2C). The former then defines the stratification under which the latter are compared. We call this strategy Quantitative Mosaic Analysis (QMA) because it replaces subjective visual comparison with a rigorous statistical alternative. Although a few recent studies have deployed this approach [37–40], qualitative visual comparison remains pervasive in the literature.

We suspect the adoption of QMA has been hindered by demand for specialized computational skills or, in their stead, extensive manual labor. Researchers must first draw or detect boundaries around individual nuclei in a procedure known as segmentation (Fig 2D). Averaging the pixel intensities within each boundary then yields a fluorescence intensity measurement for each reporter in each identified nucleus (Fig 2E). The measurements should then be corrected to account for any fluorescence bleedthrough between reporter channels (Fig 2F). Correction often requires single-reporter calibration experiments to quantify any potential crosstalk between different fluorophores, followed by complex calculations to remedy the data [41, 42]. Researchers must then label, or annotate, each identified nucleus as mutant, heterozygous, or homozygous for the clonal marker. Annotation is typically achieved through visual inspection (Fig 2G). Cells carrying zero, one, or two copies of the clonal marker should exhibit low, medium, or high average levels of fluorescence, respectively. However, both measurement and biological noise introduce the possibility that some cells’ measured fluorescence levels may not reliably reflect their genetic identity. Annotation must therefore also consider the spatial context surrounding each nucleus. For instance, a nucleus whose neighbors express high levels of the clonal marker is likely to be homozygous for the clonal marker, even if its individual fluorescence level is comparable to that of heterozygous cells (Fig 2G, white arrows). Spatial context is particularly informative in developing tissues where cell migration is minimal, such as the fly imaginal discs. With many biological replicates containing thousands of cells each, annotation can quickly become insurmountably tedious. The corrected and labeled measurements are then curated for statistical comparison by excluding those on the border of each clone, and limiting their scope to particular regions of the image field (Fig 2H). Combined, all of these tasks ultimately burden researchers and raise the barrier for adoption of QMA.

Automation promises to alleviate this bottleneck, yet the literature bears surprisingly few computational resources designed to support QMA. The ClonalTools plugin for ImageJ deploys an image-based approach to measure macroscopic features of clone morphology, but is limited to binary classification of mutant versus non-mutant tissue and offers no functionality for comparing reporter expression across clones [43]. Alternatively, the MosaicSuite plugin for ImageJ deploys an array of image processing, segmentation, and analysis capabilities to automatically detect spatial interactions between objects found in separate fluorescence channels [44, 45]. While useful in many other settings, neither of these tools support automated labeling of individual cells or explicit comparison of clones with single-cell resolution. Most modern studies employing a quantitative mosaic analysis instead report using some form of ad hoc semi-automated pipeline built upon ImageJ [37, 39, 40]. We are therefore unaware of any platforms that offer comprehensive support for an automated QMA workflow.

Here, we introduce Fly-QMA, a computational framework for automated QMA of Drosophila imaginäre Scheiben. Fly-QMA supports segmentation, bleedthrough correction, and annotation of confocal microscopy data (Fig 2D–2H). We demonstrate each of these functions by applying them to real confocal images of clones in the eye imaginal disc, and find that our automated approach yields results consistent with manual analysis by a human expert. We then generate and use synthetic data to survey the performance of our framework across a broad range of biologically plausible conditions. Fly-QMA is freely available online (see Data and software availability), along with an interactive coding tutorial designed to acquaint users with the core software features by applying them to example data.


Danksagung

We thank Thomas R. Clandinin, Jürgen Knoblich, Kristin Scott and and Bruno Lemaitre for sharing fly stocks. We thank Célia Baltazar, Ana Paula Elias and Ana Sofia Valente for technical assistance in running experiments, Matthieu Pasquet and Ricardo Ribeiro for assistance in hardware and acquisition software development and the Instituto Gulbenkian de Ciência for providing us access to experimental setups. Thomas R. Clandinin, Rui Costa, Samuel Walker and all the members of the Behavior and Metabolism Laboratory for helpful discussions and comments on the manuscript. This project was supported by a Human Frontiers Program Project Grant RGP0022/2012 to M.H.D. and C.R., an Allen Distinguished Investigator award to M.H.D. and the BIAL Foundation grant #167/10 and the Portuguese Foundation for Science and Technology (FCT) grant PTDC/BIA-BCM/118684/2010 to CR. P.M.I. is supported by the postdoctoral fellowship SFRH/BPD/79325/2011 from the Foundation for Science and Technology, E.V. by the fellowship 193-2012 from the BIAL Foundation and G.L. by the PhD Studentship SFRH/BD/51714/2011 from the Foundation for Science and Technology. The Champalimaud Neuroscience Programme is supported by the Champalimaud Foundation.