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Werden microRNAs vom gleichen DNA-Strang wie ihre Eltern-Messenger-RNAs transkribiert?


Ich bin neu bei Mikro-RNAs. Ich habe versucht, die Antwort auf die Frage zu finden, ob microRNAs vom gleichen DNA-Strang wie die vom umgebenden Gen kodierten Messenger-RNAs transkribiert werden?

Aus den wissenschaftlichen Artikeln, die ich bisher gelesen habe, schließe ich, dass es sich um denselben Strang handelt. Wenn ja, findet die Transkription von microRNA und mRNA gleichzeitig statt?

Hat schließlich der Strang, von dem die microRNA transkribiert wird, irgendwelche Auswirkungen auf seine Interaktion mit seinem mRNA-Ziel?


Zur Frage nach dem Verhältnis der Transkription von microRNAs zu der der prä-mRNAs proteinkodierender Gene:

  • Einige microRNAs (als „intergen“ bezeichnet) befinden sich nicht in einem proteinkodierenden Gen (z. B. Drosophila mir-31a). Hier stellt sich die Frage nicht.

  • Viele (wenn auch nicht alle) von denen, die sich in einem proteinkodierenden Gen befinden, finden sich ausschließlich in Introns (als "Intronik" bezeichnet) - z.B. mir-11 und mir-998 im Drosophila-Gen E2f1.

  • Bei den microRNAs, die sich in einem Elterngen befinden, ist die Transkriptionsrichtung im Allgemeinen, aber nicht ausschließlich, dieselbe wie die des Transkripts (ca. 70%, laut dieser Übersicht).

  • Es stellt sich die Frage, ob die intronischen microRNAs aus den gespleißten Introns von Transkripten ihrer Elterngene generiert werden. Eine von vielen Veröffentlichungen, die dies berücksichtigen, stammt von Ramalingam et al. (2014). Es scheint, dass dies in einigen Fällen so sein mag, in anderen Fällen scheint dies jedoch durch eine Ungleichheit zwischen den Expressionsprofilen von Elterngenen und microRNAs sowie zwischen verschiedenen microRNAs, die im selben Intron kodiert sind, ausgeschlossen zu sein.

  • Die Kodirektionalität der Transkription von "Eltern"-mRNA und microRNA hat Nein Auswirkungen auf die Interaktion von microRNAs mit ihren oft zahlreichen „Ziel“-mRNAs. Dies liegt daran, dass (1) keine genetische Beziehung zwischen Eltern-mRNA und Ziel-mRNAs besteht - der Eltern-mRNA fehlt das Intron, aus dem die microRNA hervorgegangen ist nicht das Ziel; (2) die Haarnadelschleife des microRNA-Vorläufers (so unvollkommen sie auch sein mag) stellt in Wirklichkeit beide Stränge dar, von denen abhängig von der microRNA entweder der 5'-Anteil, der 3'-Anteil oder beides erzeugt werden kann. Die miRBase-Site enthält Informationen zur relativen Häufigkeit von 5ʹ- oder 3ʹ-Fragmenten für einzelne microRNAs, und die Ressource microrna.org listet potenzielle Ziel-mRNAs auf.


MikroRNAs

3 Genetische Organisation, Variation in MicroRNAs und gewebespezifische Expression von MicroRNAs

MicroRNAs (miRNAs) durchlaufen mehrere Prozessierungsereignisse, um ihre funktionelle 21-23-Ribonukleotid-RNA-Sequenz zu erreichen. Kanonische miRNAs werden aus proteinkodierenden Transkriptionseinheiten erzeugt, während andere miRNAs (dh nichtkanonische miRNAs) aus nichtproteinkodierenden Transkriptionseinheiten erzeugt werden. In beiden Fällen können sich die miRNAs entweder innerhalb von intronischen oder exonischen Regionen befinden. Ein bemerkenswerter mechanistischer Unterschied zwischen kanonischen und nicht-kanonischen miRNAs besteht darin, dass kanonische intronische miRNAs Drosha-abhängig sind und daher cotranskriptional mit proteinkodierenden Transkripten im Zellkern prozessiert werden. Die premiRNA tritt dann in den miRNA-Weg ein, während der Rest des Transkripts einem PremRNA-Spleißen unterzogen wird, um reife mRNA zu produzieren, die dann die Proteinsynthese steuert. Nichtkanonische intronische kleine RNAs (auch Mirtrons genannt) können von kleinen Introns abgeleitet werden, die premiRNAs ähneln und den Drosha-Prozessierungsschritt umgehen [11] . miRNAs neigen dazu, in einem verwandten Cluster organisiert zu sein und neigen auch dazu, auf mehrere mRNA-Transkripte innerhalb gemeinsamer zellulärer Reaktionswege (z. B. Proliferation, Apoptose) abzuzielen. Dieses Organisationsthema bietet miR-Clustern die Möglichkeit, die Regulierung mehrerer Schritte innerhalb eines Pfads zu koordinieren, was eine Möglichkeit für eine komplexe und adaptive regulatorische Kontrolle ganzer Pfade bietet. Eine interessante Klasse von miRNAs sind myomiRs – so genannt, weil sie in den Myosin-Schwerketten-(MYH)-Genen kodiert sind. myomiRs werden in derselben Vorläufer-mRNA wie das parentale MYH-Gen transkribiert [4] . Besonders hervorzuheben ist die myomiR-499, die trotz des Fehlens einer Eltern-mRNA eine der am stärksten exprimierten miRNAs im Herzgewebe ist. In einem anscheinend neuartigen evolutionären Phänomen entkoppelt alternatives Spleißen im Herzen die Produktion von reifem miR-499 von der Expression der MYH7b-mRNA der Eltern, was bedeutet, dass sich die mRNA möglicherweise zu einer nicht funktionsfähigen Wirts-mRNA für ihre intronische miR (dh miR-499) entwickelt hat.

Vergleichende Studien zur Bewertung der Organisationsstruktur des Säugetiergenoms haben eine Fülle von chromosomalen Insertionsdeletionen, Kopienzahlvarianten und Einzelnukleotidpolymorphismen (SNPs) identifiziert, die je nach Umweltkontext zur genetischen Variation beitragen, die der phänotypischen Vielfalt zugrunde liegen kann. Diese Vielfalt zeigt sich in fast jedem untersuchten Aspekt der menschlichen Gesundheit und Krankheit. Es überrascht vielleicht nicht, dass inzwischen zunehmend erkannt wird, dass auch Variationen in miRNAs und ihren Zielgenen zu dieser phänotypischen Variabilität beitragen. Mehrere solide und hämatologische Malignome können mit miRNAs verknüpft werden, die sich in amplifizierten, deletierten oder translozierten chromosomalen Regionen im Säugetiergenom befinden [12] . Variationen in der Genexpression und -regulation werden wahrscheinlich durch genetische Varianten in beeinflusst cis- und trans-wirkende SNPs (auch bekannt als Expressions-Quantitative-Trait-Loci) [13] . Eine interessante Beobachtung der miRNA-Bindung ist ihre Fähigkeit, Bindungsstellenpolymorphismus (miRSNPs) in transkribierten funktionellen Genen zu erkennen. Zum Beispiel scheint miR-24 in humanen kolorektalen Tumoren durch einen Zielstellen-Polymorphismus im Dihydrofolat-Reduktase-Gen dereguliert zu sein. In einem anderen Beispiel erzeugt ein Polymorphismus innerhalb des Myostatin-Gens eine Zielstelle für miR-1 und miR-206, die im Skelettmuskel stark exprimiert werden. Die Bindung dieser miRs an den Polymorphismus in Myostatin bewirkt eine translationale Hemmung von Myostatin-Transkripten und kann die beobachtete Muskelhypertrophie, die bei genetischen Knockouts des Myostatin-Gens beobachtet wird, phänokopieren [14] . Angesichts der signifikanten Unterschiede in der Genexpression und genetischen Variation zwischen menschlichen Populationen wird die Analyse der Rolle von miRNAs beim Beitrag zu Populationsunterschieden in der Genexpression wahrscheinlich wesentliche Einblicke in bevölkerungsbezogene gesundheitliche Disparitäten und physische Funktionen liefern [13] . Tatsächlich weisen vergleichende Genomstudien darauf hin, dass die Ziel-mRNA-Sequenzen für miRNAs: untranslatierte Regionen (UTRs) auf mRNAs häufig Sequenzdiversität aufweisen. Dies könnte auf eine adaptive Evolution von coexprimierten miRNAs und verwandten mRNAs mit diesen UTR-Varianten hinweisen. Je nachdem, ob die Dämpfung der Proteinproduktion vorteilhaft, belanglos oder schädlich ist, können die UTR-Stellen während der miRNA:mRNA-Koevolution selektiv konserviert, neutralisiert oder vermieden werden [1] .

Studien zur Bewertung der gewebespezifischen Expression von miRNAs veranschaulichen ein „Kreuzregulations“-Merkmal von miRNAs, das zur Spezifizierung des Zellschicksals beiträgt, indem es alternative Zellschicksale unterdrückt, um die Bindung an ein Zellschicksal zu erleichtern und die Stabilität eines differenzierten Phänotyps aufrechtzuerhalten [15] . Zum Beispiel sind die MyomiRs miR-1, miR-133, miR-206, miR-208, miR-486 und miR-499 in der Skelettmuskulatur angereichert und spielen eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung, dem Wachstum und der Erhaltung der Skelettmuskulatur [16 ] . Insbesondere verhindert miR-133 die osteogene Zellliniendifferenzierung, indem es Runx2, einen für die Knochenbildung essentiellen Faktor, unterdrückt [15] . MiR-7, miR-24, miR-128, miR-134, miR-219 und andere werden im Gehirn von Säugetieren stark exprimiert und regulieren das Neuritenwachstum, die neuronale Differenzierung und die Größe der dendritischen Wirbelsäule [17]. Regional angereicherte miRNAs in bestimmten Geweben können spezielle Funktionen ausüben. Zum Beispiel werden miR-7 und miR-24 stark im Hypothalamus exprimiert und die Expression von Fos und Oxytocin fein abgestimmt, die eine wichtige Rolle bei der Kontrolle von Wasser, Laktation und Geburt spielen [18] .


Wenn RNA regiert

Was haben neu entdeckte Moleküle namens microRNAs und das Internet gemeinsam? Beide haben in den letzten zehn Jahren ganze Felder umgestaltet, sagt Whitehead-Postdoktorand Andrew Grimson.

„Das ist eine ziemlich grandiose Behauptung für microRNAs“, bestätigt Grimson, der sie untersucht. „Aber die Entdeckung der weit verbreiteten Rolle dieser Moleküle hat die Landschaft der Biologie sehr schnell verändert.“

„Labors auf der ganzen Welt, die an einer Vielzahl biologischer Fragen arbeiten, integrieren jetzt microRNAs in ihre Forschung“, sagt David Bartel, Whitehead-Mitglied und Ermittler des Howard Hughes Medical Institute.

Bartel und seine Kollegen haben dazu beigetragen, die Raserei anzuheizen, indem sie Hunderte der kleinen RNA-Moleküle identifizierten und überzeugende Beweise dafür lieferten, dass sie die Produktion von Tausenden von Proteinen in Pflanzen und Tieren regulieren.

Bis Anfang der 1990er Jahre hatte niemand eine Ahnung von microRNAs, die aufgrund ihrer geringen Größe unter dem Radar flogen. Jedes enthält nur 21 bis 24 Nukleotide oder Buchstaben des genetischen Alphabets, sodass Wissenschaftler sie einfach übersehen haben. Die Gruppe von Victor Ambros fand 1993 die erste microRNA – lin-4 – an der Harvard Medical School, als sie eine Mutation im Wurm untersuchte Caenorhabditis elegans.

Ein anderer Harvard-Forscher entdeckte im Jahr 2000 eine zweite microRNA. Ein Jahr später öffneten sich die Schleusen mit der Entdeckung von fast hundert in Würmern, Insekten und Menschen. An diesem Punkt begannen Forscher, diese winzigen regulatorischen Moleküle „microRNAs“ zu nennen.

Die Entdeckungen veränderten die Vorstellung von RNA. Wissenschaftler wissen seit Jahrzehnten, dass RNA-Moleküle als Boten und Übersetzer dienen und Proteine ​​aus DNA-Sequenzen aufbauen. Aber microRNAs bestimmen, welche DNA-Sequenzen in einer bestimmten Zelle translatiert werden, eine Aufgabe, die einst als Aufgabe von Proteinen galt, die als Transkriptionsfaktoren bekannt waren. MicroRNAs choreografieren im Wesentlichen biologische Ballette und helfen dabei, zu bestimmen, wo und wann Proteine ​​auftreten können. Somit kann die RNA den in ihrem Lebenslauf aufgeführten Rollen einen „Regulator“ hinzufügen.

MicroRNAs binden an Boten-RNAs, die für Proteine ​​kodieren, die an Aktivitäten von der Entwicklung bis hin zu Krebs beteiligt sind, und unterbrechen die Produktion dieser Proteine. Beim Menschen regulieren microRNAs etwa ein Drittel der proteinkodierenden Gene, und das ist eine konservative Schätzung.

Das Genom durchgehen

„Dies ist die erste Entdeckung eines breiten biologischen Mechanismus seit der Genomik“, sagt Nobelpreisträger Phillip Sharp, der am MIT, wo er Institutsprofessor ist, untersucht, wie microRNAs funktionieren.

Wissenschaftler bestimmten den Umfang der microRNA-Aktivität innerhalb weniger Jahre, indem sie kürzlich veröffentlichte DNA-Sequenzen auswerteten. Bartel, ein RNA-Biochemiker, und der Computerbiologe Christopher Burge vom MIT spielten eine führende Rolle. Sie arbeiteten zusammen, um Computerprogramme zu entwickeln, die Genome scannten, um microRNAs und ihre Boten-RNA-Ziele zu identifizieren. Ihre Arbeit trug dazu bei, das Interesse an microRNAs zu wecken, als Biologen in Laboren auf der ganzen Welt erkannten, dass die winzigen Moleküle einen großen Teil der proteinkodierenden Gene in Pflanzen- und Tierzellen regulieren.

„Computerarbeit hat ein sehr großes Bild davon ergeben, was microRNAs in sehr kurzer Zeit wahrscheinlich tun werden“, sagt Sharp. „Es fühlt sich an, als würde sich das Feld mit Warp-Geschwindigkeit bewegen“, stimmt Burge, ein Whitehead Career Development Associate Professor für Biologie, zu. „Genomische Ansätze haben eine Reihe wichtiger Erkenntnisse geliefert und es gab schöne Synergien mit molekularen und biochemischen Studien.“

Die ersten microRNAs finden

Rosalind Lee und Rhonda Feinbaum, Forscher im Ambros-Labor, führten sorgfältige Experimente an C. elegans als sie auf die erste microRNA stießen.

Sie wussten, dass die frühe Entwicklung von Wurmlarven angemessene Mengen des neuartigen Proteins lin-14 erfordert. Sie wussten auch, dass etwas diese Werte reguliert und nahmen an, dass es sich um ein anderes Protein handelte, also machten sie sich daran, das Gen für dieses Protein zu isolieren. Das Ergebnis hat sie verblüfft.

Das Gen fiel auf einen DNA-Abschnitt, den einige einst als „Junk“ bezeichneten, einen Abschnitt außerhalb der proteinkodierenden Region des Chromosoms. Es schien für ein kleines RNA-Molekül – Lin-4 – zu kodieren, das irgendwie den Lin-14-Spiegel regulierte.

Die Forscher fragten sich, ob Lin-4 ein esoterisches Molekül oder ein Vorbote einer neuen Klasse von RNAs sei. „Wir hatten keine Grundlage dafür, zu sagen, dass lin-4 Teil von etwas viel Breiterem war“, sagt Ambros, der jetzt an der Dartmouth Medical School arbeitet.

Sein Labor hatte in den nächsten Jahren kein Glück bei der Suche nach zusätzlichen RNAs. Er war begeistert, als Forscher im Labor von Gary Ruvkun von der Harvard Medical School ein weiteres Gen entdeckten C. elegans die im Jahr 2000 für eine kleine RNA namens let-7 kodierte. Neben dem Klonen von let-7 untersuchte Ruvkuns Gruppe das Genom einer Reihe anderer Tiere und fand in den meisten von ihnen das Gen für let-7. Die Studie deutete die Rolle der Genomik in der späteren Forschung an.

2001 fanden Thomas Tuschl, außerordentlicher Professor der Rockefeller University (ehemals Postdoc im Bartel-Labor), Ambros und Bartel unabhängig voneinander Dutzende weiterer kleiner RNA-Gene in Würmern, Fliegen und Menschen und beschlossen, sie microRNAs zu nennen.

Genomik nutzen

Bartel erkannte, dass er über den Werkzeugkasten der klassischen Biologie hinausschauen musste. 2001 wandte er sich an Burge – der zuvor Algorithmen zur Identifizierung proteinkodierender Gene im menschlichen Genom entwickelt hatte – und an Lee Lim, der gerade seine Doktorandenausbildung bei Burge abgeschlossen hatte. Die Forscher nutzten die Chance, eine neue Klasse von Genen zu erforschen. Lim arbeitete gemeinsam mit den beiden Labors daran, ein Computerprogramm zu schreiben, das DNA-Sequenzen scannen und microRNA-Gene vorhersagen konnte.

Er begann mit der Untersuchung bekannter microRNAs. Jede microRNA wird aus einem Stück RNA erzeugt, das sich in sich selbst zurückfaltet, um eine Struktur zu bilden, die einer Haarnadel ähnelt. Lim hat das Genom von gescannt C. elegans für DNA-Sequenzen, die nach der Transkription in RNA zu Haarnadeln führen würden. Anschließend suchte er nach Möglichkeiten, die Suche weiter zu verfeinern.

Die doppelsträngige RNA einer Haarnadel wird zerhackt und von Proteinen namens Drosha und Dicer zu einer einzelsträngigen microRNA verarbeitet. Aber anscheinend erkennen diese Proteine ​​nicht jede Haarnadel. Lim reduzierte die Liste potenzieller microRNAs, indem er DNA-Vorlagen für Haarnadeln eliminierte, denen die Dicer-freundlichen Eigenschaften fehlten.

Lim durchmusterte dann die verbleibenden microRNA-Kandidaten, indem er die genomische Sequenz von C. elegans mit dem des zugehörigen Wurms C. briggsae. Er argumentierte, dass die meisten der echten microRNAs, die kritische biologische Funktionen erfüllen, artenübergreifend konserviert werden würden.

Schließlich zeigte das Team, dass das menschliche Genom mehr als 200 microRNA-Gene enthält. „Wir waren begeistert, neue microRNAs zu finden“, sagt Burge. „Aber dann war die große Frage – was machen sie?“

Diese Frage war in Pflanzen weitgehend beantwortet. Matthew Jones-Rhoades, ein Doktorand im Bartel-Labor, hatte entdeckt, dass pflanzliche microRNAs eine umfangreiche und hochkonservierte Paarung mit pflanzlichen Boten-RNAs aufweisen, sodass er viele Ziele der pflanzlichen microRNAs leicht identifizieren konnte.

„Zu einer Zeit, als wir etwa 50 pflanzliche Targets hatten, tappten wir noch im Dunkeln, auf welche Gene bei Tieren gezielt wurde“, sagt Bartel.

Benjamin Lewis, ein Doktorand sowohl im Bartel- als auch im Burge-Labor, entwickelte ein zweites Computerprogramm, um diese Lücke zu schließen. Er nahm die Sequenzen bekannter Mikro-RNAs, scannte Tiergenome nach entsprechenden Boten-RNA-Zielen und nutzte wie Lim artenübergreifende Konservierung, um die Ergebnisse zu überprüfen. Ziel war es, viel mehr konservierte microRNA-mRNA-Paarungen zu finden, als zufällig entstehen würden. Aber das ursprüngliche Programm konnte nicht geliefert werden.

Die Forscher versuchten dann eine andere Wendung. Frühere Arbeiten zeigten, dass einige microRNAs nur teilweise mit ihren mRNA-Zielen paaren, sodass das Team die Hypothese aufstellte, dass ein Teil jeder microRNA-Sequenz besonders wichtig sein könnte. Sie hatten Recht. Lewis knackte den Jackpot, als er eine perfekte Paarung in der Nähe eines Endes der microRNAs benötigte. Er fand winzige Sequenzen, die zu kurzen Abschnitten von microRNAs passten, die in den mRNAs von Mäusen, Ratten und Menschen viel häufiger konserviert waren, als es der Zufall erfordern würde.

Lewis nannte den kritischen Abschnitt, der zu den Ziel-mRNAs passt, den „Samen“ der microRNA. Die Entdeckung des Samens gab Wissenschaftlern, die an der biochemischen Interaktion zwischen microRNAs und mRNAs arbeiteten, einen großen Schub. Es ermöglichte auch Bartel, Burge und Lewis, die Vorhersage von Zielen voranzutreiben.

Sie zeigten, dass viele tierische microRNAs Hunderte von konservierten Targets haben, die an einer Vielzahl von Prozessen beteiligt sind, und im Januar 2005 schätzten sie vorsichtig, dass microRNAs ein Drittel der proteinkodierenden Gene beim Menschen regulieren. Dies war ein Schock, da jede Pflanzen-microRNA nur wenige Ziele zu haben scheint, die mit der Entwicklung verbunden sind.

Ende 2005 zeigte Kyle Kai-How Farh, ein weiterer Doktorand in Bartels Labor, zusammen mit Andrew Grimson, dass auch ein großes Potenzial für speziesspezifisches Targeting besteht und dass in vielen Fällen proteinkodierende Gene entwickelt werden, um dies zu vermeiden Paarung mit microRNAs. Somit beeinflussen Mikro-RNAs die Mehrheit der menschlichen Protein-kodierenden Gene, entweder auf funktioneller oder evolutionärer Ebene.

Sprungbrett für ein neues Studium

Während das menschliche Genom eindeutig voller potenzieller microRNA-Ziele ist, haben Wissenschaftler im Labor nur eine Handvoll Interaktionen zwischen Säugetier-microRNAs und mRNAs in lebenden Zellen bestätigt. Die Ermittler fangen gerade erst an, klassische Werkzeuge zu verwenden, um die Funktionen der Wechselwirkungen zu untersuchen, die von Bartel und Burge rechnerisch identifiziert wurden, die ihre Computerprogramme verfeinern und Experimente entwerfen, um frühere Vorhersagen zu testen.

„Wir verbessern die Vorhersageprogramme, um sie integrativer und genauer zu machen, und wir sequenzieren Millionen kleiner RNAs in Pflanzen und Tieren, um ein klareres Bild davon zu bekommen, was wirklich in der Zellumgebung vorkommt“, sagt Bartel.

Der Doktorand Graham Ruby zum Beispiel überarbeitet Lims microRNA-Vorhersageprogramm. Der ursprünglichen Anwendung fehlten viele echte microRNAs, und Ruby hofft, einige der Moleküle zu fangen, die durch die Ritzen gefallen sind. Lim grenzte die Liste der microRNA-Vorläufer ein, indem er jede Haarnadel nach ihren microRNA-ähnlichen Eigenschaften bewertete. Ruby fügt eine neue Wendung hinzu. Sein Programm umfasst mehr als eine Wertungsrunde, wie die amerikanisches Idol zeigen. Nach jeder Runde eliminiert er die Haarnadelkurven mit der niedrigsten Punktzahl aus dem Kandidatenpool.Er untersucht die Ausschussteile und verwendet ihre Eigenschaften, um die Bewertungskriterien für die nächste Runde zu verfeinern, die Vorhersagen genauer machen sollen.

Andere Forscher in Bartels Labor arbeiten daran, den Mechanismus zu bestimmen, durch den microRNAs den Proteinspiegel senken, da vieles davon ein Rätsel bleibt. Bei Pflanzen ist das Bild klarer, wo microRNAs vollständig mit Boten-RNAs paaren und deren Spaltung steuern.

Aber die meisten neuen Studien zu microRNAs befassen sich mit ihren spezifischen Funktionen. Krebsforscher interessieren sich besonders für die winzigen RNAs, da viele von ihnen anscheinend die Zellproliferation regulieren. Mehrere Papiere im letzten Jahr bestätigten diesen Zusammenhang. Gregory Hannon von Cold Spring Harbor und Scott Hammond von der University of North Carolina zeigten beispielsweise, dass ein Überangebot einer bestimmten Gruppe von Mikro-RNAs wahrscheinlich zu menschlichen B-Zell-Lymphomen beiträgt.

„Studien beginnen, die Bedeutung von Mikro-RNAs für menschliche Krankheiten zu zeigen“, sagt der Postdoktorand Michael Lam, der in Bartels Labor mit Mäusen arbeitet, um einige der anderen Mikro-RNAs zu untersuchen, die mit Krebs in Verbindung stehen.

„Es ist spannend, die parallelen Strömungen in der microRNA-Forschung zu beobachten“, sagt Ambros. „Als klassischer Genetiker finde ich es interessant zu wissen, wie bestimmte Mikro-RNAs in bestimmten Situationen funktionieren. Aber ich bin auch fasziniert von der Arbeit von Leuten wie Dave Bartel, die eine genomischere Sichtweise verfolgen und allgemeine Muster der microRNA-Funktion und -Evolution erkennen.“

„Das wird Tausende von Menschen über Jahre beschäftigen“, sagt Sharp. „Es wird Jahrzehnte dauern, die Besonderheiten vieler verschiedener mikroRNA-regulierter Prozesse herauszuarbeiten und diese in die Biologie des gesamten Organismus zu integrieren.“

Laufstörungen

Die RNA-Interferenz (RNAi) hat die Genomforschung einige Jahre vorangetrieben, bevor die Fülle an microRNAs erkannt wurde. Wissenschaftler fanden heraus, dass sie die Produktion von Genen durch die Einführung von doppelsträngiger RNA in ein Tier drosseln können. Sie fanden bald heraus, dass diese doppelsträngige RNA zu kurzen RNA-Strängen verarbeitet wurde und dass diese kleinen interferierenden RNAs (siRNAs) sich mit Boten-RNA-Molekülen, die die Proteinproduktion steuern, paaren und deren Spaltung steuern.

Es stellt sich heraus, dass microRNAs und siRNAs ähnliche zelluläre Maschinen verwenden, um ihre Ziele zu erreichen. Beide verlassen sich zur Verarbeitung auf ein Protein namens Dicer, und ein „Silencing-Komplex“ erleichtert ihre Interaktion mit mRNAs. Innerhalb dieses Silencing-Komplexes können die beiden Arten von RNA-Molekülen beide die Spaltung der Boten-RNA steuern, wenn sie eine umfangreiche Paarung mit den Boten haben, oder die Proteinproduktion auf andere Weise dämpfen, wenn die Paarung nicht so eng ist.

Eine microRNA stammt jedoch aus einem einzelnen im Genom kodierten RNA-Strang, der sich zu einer haarnadelähnlichen Struktur zusammenfaltet, während eine siRNA aus einem langen Stück doppelsträngiger RNA stammt.

Geschrieben von Alyssa Kneller.

Dieser Artikel erschien erstmals in der Frühjahrsausgabe 2006 des Paradigm-Magazins.


Virus-kodierte miRNAs

Welche Arten von Viren kodieren miRNAs?

RNAi entstand wahrscheinlich als primäre Verteidigung gegen schädliche genetische Elemente wie Viren, doch in einer interessanten evolutionären Wendung haben divergente Viren die miRNA-Expression für provirale Zwecke kooptiert. DNA-Viren machen die Mehrheit der bekannten Virus-kodierten miRNAs aus, wobei die Herpesvirus-Familie die meisten bekannten viralen miRNAs kodiert. Herpesviren dominieren sowohl hinsichtlich der absoluten Anzahl bekannter Virus-codierter miRNAs als auch hinsichtlich der durchschnittlichen Anzahl von pro Virus codierten miRNAs (typischerweise >10/Genom). Herpesviren umfassen eine erweiterte Familie von DNA-Viren mit großem Genom, deren charakteristisches Merkmal die Fähigkeit ist, langfristige und oft lebenslange latente Infektionen zu erleiden. Latenz ist eine spezialisierte Form einer persistierenden Infektion, bei der nur wenige virale Genprodukte exprimiert werden, was eine effiziente Umgehung der Immunantwort ermöglicht. Die Latenz ist vollständig reversibel, und mit geeigneten Hinweisen initiiert das Virus den lytischen Infektionsmodus, der die vollständige virale Genexpression umfasst und in der Produktion des infektiösen Virus und der Lyse der Wirtszelle gipfelt [32]. In dieser Hinsicht kann man sich die dualen Infektionsmodi von Herpesviren (latent versus lytisch) als ein sehr einfaches zweistufiges Modell vorstellen – ähnlich der Zelltypdifferenzierung, die in eukaryontischen Organismen während der Entwicklung stattfindet. Beide Prozesse integrieren extrazelluläre Ereignisse und die anschließende Signalübertragung. Beide hängen letztendlich von manchmal subtilen Unterschieden in der Genexpression ab, die durch transkriptionelle und/oder posttranskriptionelle Mechanismen reguliert werden (Abbildung 2).

(A) Einige Wirtsentwicklungswege können in einer Zwei-Zustands-Weise modelliert werden. Wirts-miRNAs können helfen, Übergänge von einem Entwicklungszustand in einen anderen zu erzwingen oder zu schärfen, wobei die Zielspiegel von miRNA und mRNA in diesen Zuständen invertiert sind [94]. (B) Modell für einige miRNAs während der viralen Latenz. Während der viralen Latenz werden lytische mRNAs nicht oder in typischerweise nicht nachweisbaren Mengen exprimiert. Virale miRNAs werden während der Latenz auf relativ hohem Niveau exprimiert und können „undichte“ lytische Transkripte unterdrücken. Die Optimierung des Wechsels von einer latenten zu einer lytischen Infektion ist wahrscheinlich eine wichtige Funktion bei der Aufrechterhaltung der Homöostase einer latenten Infektion. Während der lytischen Replikation „überrennen“ große Veränderungen in der Transkriptionsaktivität lytischer Gene die auferlegte Hemmung durch miRNAs. Beachten Sie, dass das virale Genom als zirkuläres Episom dargestellt wird, obwohl bei einigen Viren die lytische Replikation zu mehreren Kopien des linearisierten Genoms führen kann.

Mehrere Aspekte des Lebenszyklus von Herpesviren sind aufschlussreich, um die anderen Virusfamilien zu verstehen, die miRNAs kodieren. miRNAs sind für die adaptive Immunantwort wahrscheinlich unsichtbar – ein wertvolles Merkmal für Viren, die eine anhaltende Infektion durchlaufen [7]. Angesichts der oft subtilen Natur der miRNA-vermittelten Regulation ist es wahrscheinlich, dass die meisten viruskodierten miRNAs während einer lytischen Infektion eine verminderte Rolle spielen, wo robuste Veränderungen der Wirts- und viralen Genexpression dominieren, obwohl virale miRNAs zu diesen Zeiten typischerweise nachweisbar sind. Zum größten Teil haben natürliche Viren, die miRNAs kodieren, eine DNA-Komponente für ihren Replikationszyklus, replizieren sich im Zellkern, wo sie vollen Zugriff auf die initiierende miRNA-Biogenesemaschinerie des Wirts haben, und durchlaufen lang anhaltende Infektionen. Diese umfassen Viren mit DNA-Genomen (Herpesvirus-, Polyomavirus-, Ascovirus-, Baculovirus-, Iridovirus- und Adenovirus-Familien) und mindestens ein Mitglied der Retrovirus-Familie, das Rinderleukämievirus (BLV) (Tabelle 1).

Natürlich vorkommende positive oder negative RNA- oder dsRNA-Genomviren, die miRNAs exprimieren, werden nicht allgemein akzeptiert. Tatsächlich wurde bis vor kurzem spekuliert, dass Viren mit RNA-Genomen aufgrund negativer Auswirkungen auf die Fitness, die mit cis Spaltung des Genoms, Antigenoms oder der mRNAs, die durch die miRNA-Verarbeitungsmaschinerie vermittelt wird [33] [34]. Retroviren verpacken ein RNA-Genom in das Kapsid, enthalten aber auch ein DNA-Stadium in ihrem Infektionszyklus, in dem das revers transkribierte Provirus-Genom in die Wirts-DNA integriert wird. Es wurde berichtet, dass HIV miRNAs kodieren kann, aber dies wird aufgrund der geringen Häufigkeit, der fehlenden evolutionären Konservierung unter den Stämmen, der unbekannten biologischen Relevanz und der Diskrepanz der Ergebnisse zwischen verschiedenen Labors nicht allgemein akzeptiert [35]–[38]. BLV kodiert jedoch eindeutig zahlreiche miRNAs [39]. Interessanterweise vermeidet BLV die Drosha-vermittelte Spaltung seines Genoms und seiner mRNAs, die den miRNA-Cluster-Teil des Genoms überlappen. Dies geschieht, weil BLV-miRNAs im Gegensatz zu den meisten bekannten miRNAs als kürzere RNA-Polymerase III (pol III) transkribierte Haarnadeln kodiert werden, die direkt als Dicer-Substrate dienen können. Infolgedessen werden BLV-Transkripte von Drosha nicht gespalten und nur subgenomische kleine RNAs werden zu miRNAs verarbeitet. Somit kodiert mindestens ein Retrovirus miRNAs. In Kombination mit den jüngsten Berichten über im Labor hergestellte RNA-Viren, die erfolgreich miRNA-ähnliche RNAs exprimieren [40]–[43], ist es wahrscheinlich, dass weitere RNA-Virus-kodierte miRNAs entdeckt werden müssen.

Wie oben erwähnt, haben die Viren, die am ehesten miRNAs codieren, nukleare und DNA-Komponenten in ihrem Lebenszyklus und haben die Fähigkeit, anhaltende Infektionen zu etablieren. Es ist jedoch klar, dass nicht alle Viren, die diese Kriterien erfüllen, miRNAs kodieren. Da mindestens ein Typ des humanen Papillomavirus (HPV, kleine dsDNA-Genomviren, von denen einige mit der humanen Tumorgenese assoziiert sind) keine miRNAs kodiert [44]. Wir stellen fest, dass diese Ergebnisse die Möglichkeit nicht ausschließen, dass andere PVs miRNAs kodieren. Tatsächlich behauptet eine Studie, dass HPV-18 eine miRNA kodiert, aber es fehlen solide Beweise für die Beteiligung der miRNA-Biogenese oder der Effektormaschinerie [45]. Das Überwiegen der Beweise deutet darauf hin, dass zumindest einige PVs und vielleicht viele, wenn nicht alle anderen, keine miRNAs kodieren. Obwohl die meisten eingehend untersuchten Herpesviren miRNAs kodieren, scheint das Varicella-Zoster-Virus (VZV), der Erreger von Windpocken und Gürtelrose, dies nicht zu tun [46]. Dieser Befund ist besonders interessant, da andere humane neurotrope Herpesviren (HSV1 & 2) und darüber hinaus andere tierische Varicelloviren wie Bovines Herpesvirus 1 und Suid Herpesvirus 1 miRNAs kodieren [47] [48]. Dies wirft die Frage auf, was sich zwischen dem Lebenszyklus von VZV und anderen Herpesviren unterscheidet, der die miRNA-Nutzung bestimmt. Da immer mehr kleine RNA-Sequenzierungsstudien durchgeführt werden, wird das Verständnis, welche Viren miRNAs kodieren und welche nicht, aufschlussreich für das übergeordnete Ziel des Verständnisses der Virus-miRNA-Funktion sein.

Virus-kodierte miRNA-Funktionen

Virus-kodierte miRNAs können in zwei Klassen eingeteilt werden: solche, die Analoga der Wirts-miRNAs sind, und solche, die viral spezifisch sind. Ähnlich wie bei einigen Virus-kodierten regulatorischen Proteinen hat sich eine Untergruppe viraler miRNAs entwickelt, um Wirtseffektoren nachzuahmen. Virale miRNAs, die Wirtseffektoren nachahmen, werden als „Analoga“ bezeichnet. Das 5′-Ende einer miRNA (∼Nukleotide 2–8), die sogenannte „Seed“-Region, spielt eine besonders wichtige Rolle bei der Steuerung von RISC zu mRNA-Zielen. Es wird geschätzt, dass ∼60% der Regulation durch eine bestimmte miRNA auf die Bindung mit perfektem Seed zurückzuführen ist, der komplementär zum Zieltranskript ist [49]. Ein Teil der viruskodierten miRNAs teilt Samen mit Wirts-miRNAs und mindestens drei Viren: Kaposi-Sarkom-assoziiertes Herpesvirus (KSHV), Marek-Krankheit-Virus 1 (MDV1) und BLV regulieren nachweislich Transkripte über dieselben Ziel-Andockstellen als ihr Gegenstück Wirts-miRNAs [28], [39]. Durch die Nachahmung einer Wirts-miRNA kann eine virale miRNA potenziell Hunderte von Transkripten regulieren, die Zielstellen für eine bestimmte Wirts-miRNA entwickelt haben. Vermutlich entwickeln sich solche regulatorischen Netzwerke, um spezifische Funktionen zu bewirken, beispielsweise die Apoptose zu hemmen. Unsere Schätzungen deuten darauf hin, dass 26% der derzeit annotierten humanen Virus-kodierten miRNAs Wirts-miRNAs nachahmen könnten, indem sie identische Samensequenzen besitzen (Abbildung 3A). Dies stellt jedoch wahrscheinlich eine grobe Überschätzung dar, da sie Sternstränge sowohl für Wirts- als auch für virale miRNAs umfasst. Darüber hinaus basiert diese Schätzung auf hexameren Seeds, während heptamere Seeds bessere Prädiktoren für gemeinsame Ziele sind [50]. Die Durchführung derselben Analyse unter Verwendung von heptameren Samen reduziert die Überlappung von Wirts- und viralen miRNA-Samen weiter auf 15%. Ähnliche Ergebnisse werden in anderen Systemen erhalten, einschließlich Viren mit Nagetier- und Vogelwirten (Abbildung 3A). Darüber hinaus ist aufgrund geringer Häufigkeit, ungetesteter Biogenese und unbekannter funktioneller Relevanz unklar, ob alle derzeit annotierten viralen oder Wirts-miRNAs Bona-fide-miRNAs sind, was unterstreicht, dass einige Seed-Übereinstimmungen zwischen Wirts- und viralen miRNAs zufällig entstehen [28]. Daher scheint es wahrscheinlich, dass nur eine Minderheit der Virus-kodierten miRNAs wirklich Wirts-miRNAs nachahmen.

(A) Einige virale miRNAs teilen die Samenidentität mit Wirts-miRNAs, die als „Analoga“ bezeichnet werden, während die Mehrheit der viralen miRNAs dies nicht tut. Für jedes System (Mensch, Maus, Huhn) wurden die mit miRBase Version 18 annotierten reifen viralen miRNA-Sequenzen mit den jeweiligen Wirts-miRNAs auf Identität in den Nukleotiden 2–7 (Hexamer) oder 2–8 (Heptamer) verglichen. Innere Kreise stellen die Anzahl der viralen miRNAs mit einem Wirts-Seed-Match aus den gesamten viralen miRNAs dar. Der Prozentsatz zur nächsten ganzen Zahl wird unter jedem Diagramm angezeigt. (B) Modelle der viralen miRNA-Funktion. Im Wirtsnetzwerkmodell auf der linken Seite fungieren einige virale miRNAs durch Ähnlichkeit der Samensequenzen als Analoga von Wirts-miRNAs, wodurch Transkripte über die gleichen Andockstellen wie die nachgeahmten Wirts-miRNAs angesteuert werden. Diese Andockstellen für die Wirts-miRNA können ein konserviertes Netzwerk darstellen und der viralen miRNA den Zugang zu zahlreichen Zielen ermöglichen, die zusammenarbeiten, um dieselbe Funktion zu bewirken. Im Gegensatz dazu deutet das primäre Zielmodell auf der rechten Seite darauf hin, dass sich einige virale miRNAs entwickeln, um nur ein oder wenige Transkripte durch neue Stellen zu zielen, die nicht für Wirts-miRNA-Funktionen konserviert sind. In diesem Modell kann das Virus zahlreiche neutrale oder nachteilige „Bystander“-Interaktionen tolerieren, solange die Gesamtsumme der Regulation, die durch die nichtanaloge virale miRNA bereitgestellt wird, für den viralen Lebenszyklus vorteilhaft ist. Darüber hinaus können Wirts- und virale miRNAs dasselbe Transkript durch verschiedene Andockstellen ansteuern, wie im konvergenten Zielmodell vorgeschlagen (unten in der Abbildung).

Obwohl mehr als 250 viruskodierte miRNAs bekannt sind [51], fehlt den meisten ein tiefgreifendes funktionelles Verständnis. Das liegt zum Teil daran, dass diese miRNAs erst vor relativ kurzer Zeit entdeckt wurden. Darüber hinaus fehlt es an leicht zugänglichen Tiermodellen für einige Viren, die miRNAs kodieren, und die meisten viralen miRNAs, die von menschlichen Viren kodiert werden, werden in Tiervirusmodellen, die keine Primaten sind, nicht konserviert. Basierend auf dem, was derzeit über viruskodierte miRNAs bekannt ist (ausführlich in [28] beschrieben), schlagen wir die Hypothese vor, dass die meisten, obwohl sie oft während einer lytischen Infektion nachweisbar sind, persistente/latente Infektionen fördern. Dementsprechend können die meisten Funktionen, die Virus-kodierten miRNAs zugeschrieben werden, in die folgenden Kategorien eingeteilt werden: (1) Verlängerung der Lebensdauer infizierter Zellen, (2) Vermeidung der Immunantwort und (3) Regulierung von Wirts- oder Virusgenen, um den lytischen Zyklus zu begrenzen.

Verlängerung der Lebensdauer infizierter Zellen

Die Verhinderung des Zelltods scheint ein offensichtlicher Vorteil für Viren zu sein, die persistente oder latente Infektionen in langlebigen Zellen aufnehmen. Wirts-miRNAs spielen eine wichtige Rolle bei der Aufrechterhaltung der zellulären Homöostase, und es überrascht nicht, dass zahlreiche Wirts-miRNAs an der Regulation des Zelltods beteiligt sind (Übersicht in [52]). Mehrere verschiedene Viren, darunter KSHV, Epstein-Barr-Virus (EBV) und MDV1 kodieren miRNAs, die eine subtile Rolle bei der Verhinderung der Apoptose spielen können, indem sie auf pro-apoptotische Wirtsgene abzielen. EBV ist ein Gamma-Herpesvirus, das mit zellulären hyperproliferativen Erkrankungen wie der infektiösen Mononukleose sowie B-Zell- und Festzelltumoren assoziiert ist (Übersicht in [53]). Die EBV-kodierte miRNA miR-BART5 zielt auf das Transkript des pro-apoptotischen Wirtsgens PUMA [54] und Mitglieder des EBV-BART-miRNA-Clusters zielen auch auf Transkripte des pro-apoptotischen Gens Bim ab [55]. Darüber hinaus wurden die EBV-BHRF1-miRNAs mit der Verhinderung der Apoptose während der Infektion von kultivierten primären B-Zellen in Verbindung gebracht [56]. MDV1-kodierte miRNA miR-M3 zielt auf das Transkript des Wirtsgens Smad2 ab und reduziert nachweislich die arzneimittelinduzierte Apoptose in Zellkulturen [57]. Interessanterweise können bei einigen Viren wie KSHV verschiedene virale miRNAs auf unabhängige Wirtstranskripte abzielen, um früh initiierende apoptotische Ereignisse wie den Zytokin-Signalrezeptor TWEAKR sowie späte apoptotische Effektoren wie Caspase 3 zu verhindern [58] [59]. Es ist auch bemerkenswert, dass von mindestens drei verschiedenen humanen Herpesviren (humanes Cytomegalovirus [HCMV], EBV und KSHV) gezeigt wurde, dass sie miRNAs kodieren, die auf das pro-apoptotische Gen BclAF1 des Wirts abzielen. Diese viralen miRNAs verwenden unterschiedliche miRNA-Zielorte, was darauf hindeuten könnte, dass BclAF1 ein wichtiger Effektor im Lebenszyklus verschiedener Herpesviren ist und virale miRNAs auf ähnliche Ziele konvergieren können, ohne sich auf konservierte Zielorte zu verlassen [60]–[62]. Alternativ bleibt es möglich, dass, da BclAF1 eine atypisch lange 3'-UTR (>4 Kb) aufweist, es zu einer Klasse von hypothetischen Transkripten gehört, die aufgrund der Häufigkeit oder Zusammensetzung von UTRs hyperanfällig für miRNA-vermittelte Regulation sind. Obwohl die in-vivo-Relevanz noch zu bestimmen ist, dienen einige virale miRNAs wahrscheinlich dazu, dem Zelltod zu entgehen.

Mehrere Viren, von denen bekannt ist, dass sie miRNAs kodieren, darunter die Herpesviren KSHV, EBV, MDV1 und das Polyomavirus Merkel Cell Carcinoma Polyomavirus (MCPyV), sind mit der Tumorentstehung assoziiert. Das Induzieren von Tumoren ist wahrscheinlich kein primärer Vorteil für diese Viren, sondern eher eine zufällige Folge der Notwendigkeit, den Zellzyklus zu verändern, den Zelltod zu verhindern und die Immunantwort zu vermeiden [63]. EBV, das ätiologische Agens verschiedener menschlicher Tumoren, kodiert miRNAs, die an Zellkulturmodellen der Transformation beteiligt sind [64]–[66]. Darüber hinaus haben zwei wichtige in-vivo-Studien eine Rolle von MDV1- und KSHV-miRNAs bei der Tumorentstehung gezeigt [67] [68]. Sowohl MDV1, ein Alpha-Herpesvirus von Hühnern, als auch KSHV, ein lymphotropes Gamma-Herpesvirus des Menschen, sind mit Tumoren assoziiert. MDV1 verursacht T-Zell-Lymphome und KSHV ist mit einer Untergruppe von primären Ergusslymphomen und Kaposi-Sarkom (KS) assoziiert. Erstaunlicherweise kodieren beide Viren miRNAs, die als Analoga der Wirts-miRNA miR-155 fungieren. Die Fehlexpression von miR-155 verändert die Lymphopoese und spielt eine Rolle bei der Tumorentstehung (Übersicht in [69]–[71]). Die Infektion von Hühnern mit einer mutierten Version von MDV1, die das virale Analogon von miR-155 nicht exprimiert, führt bei den meisten Patienten zu einem Verlust der Onkogenität [67]. Mehrere Studien haben sich zusammengetan, um zu zeigen, dass das KSHV-Analogon von miR-155 (miR-K12-11) überlappende Ziele mit der Wirts-miRNA teilt [72]–[74]. Kürzlich wurde in einem orthotopen humanisierten Mausmodell gezeigt, dass die exogene Expression von KSHV mir-K12-11 ausreichend ist, um die Hyperproliferation von B-Zellen voranzutreiben [68].

Wir haben gezeigt, dass eine der BLV-miRNAs als Analogon der Wirts-miRNA miR-29 fungiert. Es wurde gezeigt, dass miR-29 je nach Kontext entweder als Onkogen oder als Tumorsuppressor fungiert [75]. miR-29 wird bei humanen chronisch lymphatischen Leukämien (CLLs) überexprimiert, die eine auffallende phänotypische Ähnlichkeit mit BLV-assoziierten Tumoren bei Rindern aufweisen [76]. Wenn miR-29 experimentell in B-Zellen überexprimiert wird, entwickeln Mäuse B-Zell-Tumoren, die CLL stark ähneln [77]. Wie genau BLV Tumore verursacht, ist rätselhaft geblieben, da die meisten BLV-Tumorzellen keine reichlichen viralen Pol-II-Transkripte oder -Proteine ​​exprimieren.Die Identifizierung eines von BLV pol III abgeleiteten potenziellen oncomiR unterstützt ein Modell für miRNAs in der BLV-vermittelten Tumorentstehung, aber diese Spekulation wartet auf eine Bestätigung in vivo. Bemerkenswert ist auch, dass mindestens drei andere lymphotrope Viren, EBV (miR-BART1-3p), RLCV (Rhesus Lymphocryptovirus, miR-rL1-6-3p) und MDV2 (Marek-Krankheit-Virus 2, miR-M21), ebenfalls kodieren miRNAs mit miR-29-Samen. Somit zeichnet sich ein Bild ab, wonach miRNAs, die von Tumorviren kodiert werden, zu einem erhöhten Zellüberleben und einer erhöhten Tumorentstehung beitragen können.

Ausweichen der Immunantwort

Ähnlich wie nichtstrukturelle virale Proteine, die oft dazu dienen, die Immunantwort zu umgehen, scheint es wahrscheinlich, dass einige virale miRNAs eine ähnliche Rolle spielen. Theoretisch können miRNAs indirekt zur Immunevasion beitragen, indem sie die viralen Proteinspiegel und die daraus resultierende Antigenität senken oder direkt durch die Unterdrückung von Komponenten der Immunantwort des Wirts [78]. Simian Vacuolating Virus 40 (SV40), ein prototypisches Polyomavirus mit einem zirkulären Genom, das gegensätzliche Transkriptionseinheiten für die frühen und späten Gene besitzt, kodiert eine miRNA, die perfekt zu den frühen viralen Transkripten komplementär ist. Die SV40 miRNA steuert die Spaltung der frühen viralen Transkripte und führt zu einer reduzierten frühen viralen Genexpression zu späten Zeitpunkten der lytischen Infektion [79]. Wenn SV40-infizierte Zellen zusammen mit zytotoxischen T-Zellen (CTLs) kultiviert werden, wird eine stärkere CTL-vermittelte Lyse in Zellen beobachtet, die mit einem mutierten miRNA-Virus infiziert sind. Dies deutet auf eine mögliche Rolle der SV40 miRNA bei der Umgehung der adaptiven Immunantwort in vivo hin. Murines Polyomavirus (muPyV) kodiert auch eine miRNA, die die frühe Genexpression ähnlich wie SV40 negativ reguliert [80]. Die Infektion von Mäusen mit einem mutierten muPyV-miRNA-Virus unterstützt jedoch keine robuste Rolle der miRNA bei der Umgehung der adaptiven Immunantwort, da nur ein geringer Unterschied in der CTL-Antwort beobachtet wird [80]. Obwohl es sich bei SV40 und muPyV um unterschiedliche Viren handelt, weisen sie zahlreiche Ähnlichkeiten in den Infektionszyklen und der autoregulatorischen Aktivität ihrer jeweiligen miRNAs auf. Diese Ergebnisse legen nahe, dass der zugrunde liegende Zweck der miRNA-vermittelten Autoregulation von Polyomaviridae noch nicht geklärt werden muss und dass bei der Interpretation der In-vivo-Relevanz von Zellkulturexperimenten Vorsicht geboten ist. miRNAs aus mehreren verschiedenen humanen Herpesviren und dem Star-Strang-Derivat des humanen Polyomavirus JC (JCV) wurden in Co-Kultur-Experimenten mit der Umgehung der angeborenen Immunantwort von Natural Killer (NK)-Zellen in Verbindung gebracht [81]–[83]. Während diese Ergebnisse in vivo auf eine Bestätigung warten, legen sie eine mögliche gemeinsame Funktion bei der Umgehung von NK-Zellen über miRNAs nahe, die von sehr unterschiedlichen Virenarten kodiert werden. Bis heute stammen die einzigen in vivo-Beweise, die einen Zusammenhang zwischen miRNAs und Immunevasion zeigen, aus Studien, die mit dem murinen Cytomegalovirus (MCMV) durchgeführt wurden. Die Deletion von zwei MCMV-miRNAs führt zu reduzierten Titern in den Speicheldrüsen mit spezifischem genetischen Hintergrund von Mäusen [84]. Der Phänotyp, der darauf hindeutet, dass diese miRNAs eine anhaltende Infektion fördern, wurde bei Mäusen, die sowohl im adaptiven als auch im angeborenen Arm der Immunantwort defekt waren, durch die Depletion von NK-Zellen und CD4 + T-Zellen umgekehrt. Zusammengenommen stützen diese Beobachtungen die Hypothese, dass einige viruskodierte miRNAs eine subtile Rolle bei der Umgehung der Immunantwort spielen.

Regulierung von Wirts- oder Virusgenen, um den lytischen Zyklus zu begrenzen

Die eingeschränkte Genexpression der Latenz und einige andere Formen der persistenten Infektion stellen eine erfolgreiche Strategie der Immunevasion dar. Zusätzlich zur Kodierung direkter Modulatoren der Immunantwort entgehen latent infizierte Zellen der Immunantwort, indem sie eine begrenzte Anzahl von Proteinen exprimieren, was für eine verringerte Antigenität sorgt. Mehrere verschiedene Herpesviren kodieren miRNAs, die an der Aufrechterhaltung einer latenten Infektion und der Veränderung des Gleichgewichts zwischen latenter/lytischer Infektion beteiligt sind [85]. HSV1, KSHV und HCMV kodieren alle miRNAs, von denen berichtet wurde, dass sie entweder virale und/oder Wirtsgene subtil regulieren, die eine latente/persistente Infektion begünstigen könnten (ausführlicher Überblick [28], unten kurz diskutiert). Eine aktuelle Studie zeigt, dass die miRNA-vermittelte Latenzförderung nicht auf Herpesviren beschränkt ist, da Heliothis zea nudivirus-1 (HzNV-1), ein Insektenvirus mit großem DNA-Genom, miRNAs kodiert, die einen Latenz-ähnlichen Zustand fördern, indem sie die virale Genexpression direkt hemmen [86].

Studien zum KSHV-Latenzsystem liefern einige der am besten dokumentierten Beispiele für virale miRNAs, die den latenten/lytischen Schalter regulieren (ausführlich in [28]). Es sollte jedoch beachtet werden, dass die Auswirkungen einzelner KSHV-miRNAs in diesem Prozess ausnahmslos subtil sind. Die KSHV-kodierten miRNAs miR-K12-9-5p und miR-K12-7-5p regulieren nachweislich direkt das Transkript des Master-Lytic-Switch-Proteins (RTA) [87] [88]. Mehrere KSHV-kodierte miRNAs zielen auch auf Wirtstranskripte ab, die zu einer erhöhten Latenz führen [89]–[91]. Zum Beispiel zielt die KSHV-kodierte miRNA, miR-K12-1-5p, direkt auf das Transkript des Wirtsgens IκBα ab, das den NF-κB-Signalweg moduliert und die lytische Aktivierung reduziert [89]. Darüber hinaus zielt miR-K12-3-5p direkt auf das Transkript des Wirts-Transkriptionsfaktors NFIB, von dem gezeigt wurde, dass es ein Aktivator des RTA-Promotors ist [91]. Wichtig ist, dass eine KSHV-Deletionsmutante, die die meisten viralen miRNAs entfernt oder die KSHV-miRNA-Funktion zerstört, zu einer erhöhten lytischen Aktivität führt [89] [91]. Wie oben erwähnt, obwohl nicht so gut untersucht wie KSHV, ist es wahrscheinlich, dass Virus-kodierte miRNAs von einigen anderen Herpesviren auch den Eintritt in oder den Grad der lytischen Infektion regulieren.

Groß angelegte Bemühungen, Transkripte zu identifizieren, die direkt von Herpesvirus-miRNAs angegriffen werden, haben impliziert, dass zumindest einige mutmaßliche virale lytische Replikation induzierende Ziele in Verbindung mit RISC nicht nachweisbar sind [62] [92] [93]. Dies könnte darauf hindeuten, dass diese mutmaßlichen Ziele biologisch nicht relevant sind. Auf der anderen Seite hätte die mangelnde Sensitivität dieser Zielidentifizierungsmethoden wahrscheinlich „undichte“ Transkripte mit sehr geringer Häufigkeit übersehen. Da lytisch fördernde Transkripte mit geringer Häufigkeit ausreichen können, um Feed-Forward lytisch induzierende Schleifen zu initiieren, kann eine Rolle viraler miRNAs bei der Förderung der Latenz aus diesen negativen Target-Profiling-Studien nicht ausgeschlossen werden. Tatsächlich zeigen Wirts-miRNAs im Allgemeinen ein inverses Zelltyp-Expressionsprofil mit ihren Zielen, was darauf hindeutet, dass eine Hauptrolle von miRNAs darin besteht, die Homöostase zu erzwingen, wenn unangemessene „undichte“ Transkripte auf niedrigem Niveau exprimiert werden [94] [95]. Analog dazu könnte die Durchsetzung der Latenz gegen Low-Level-Genexpressionsrauschen sehr gut auch für viruskodierte miRNAs und den einfachen Entwicklungszustand der Latenz gelten (Abbildung 2).

Was ist mit diesen Viren ohne genau definierte Latenz? Polyomaviren nehmen im Allgemeinen lebenslang anhaltende Infektionen in ihren Wirten auf, aber die Mechanismen, die dies ermöglichen, sind nicht gut verstanden. Wir haben gezeigt, dass mehrere Polyom- und polyoma-ähnliche virale miRNAs die frühe Genexpression während der späten Zeit der lytischen Infektion regulieren oder die Fähigkeit besitzen, diese zu regulieren [79] [96]–[99]. Obwohl die Regulation während einer lytischen Infektion die Hauptfunktion dieser miRNAs sein könnte, ist es auch möglich, dass polyomavirale miRNAs ähnlich wie die Herpesviren und HzNV-1 eine Rolle dabei spielen, das Gleichgewicht zwischen persistierender und lytischer Infektion zu kippen. In ähnlicher Weise wurden HCMV-miRNAs nicht in einem latenten Kontext untersucht, aber basierend auf bekannten viralen Zielen von HCMV [100] und dem begrenzten Verständnis der MCMV-miRNA-Funktion in vivo [84] konnte vorhergesagt werden, dass einige HCMV-miRNAs eine Rolle bei Aufrechterhaltung oder Etablierung von Latenz/Persistenz. Das DNA-Insektenvirus Heliothis virescens Ascovirus (HvAV) kodiert eine miRNA, die auf seine eigene virale Polymerase abzielt [101]. Obwohl eine HvAV-Infektion bei einigen Insektenwirten zum Tode führt, wurde kürzlich gezeigt, dass andere Insektenwirte eine abgeschwächte Infektion durchlaufen und somit als mögliches Reservoir für eine anhaltende Infektion dienen können [102]. Daher ist es möglich, dass die HvAV-miRNA in einigen Zusammenhängen eine persistierende Infektion fördern könnte. Um die Rolle der polyomaviralen, HCMV- und ascoviralen miRNAs bei der Förderung der Persistenz zu testen, müssen wahrscheinlich empfindliche In-vivo-Assays entwickelt werden.

Nichtkanonische miRNA-Funktionen

Schließlich müssen für viruskodierte miRNAs, insbesondere solche, die keine Analoga von Wirts-miRNAs sind, alle möglichen Funktionen berücksichtigt werden. Mehrere virale miRNAs werden in genomischen Regionen in der Nähe von Replikationsursprüngen oder Antisense zu ncRNAs geclustert gefunden. Es ist möglich, dass für virale und Wirts-miRNAs völlig neue Funktionen bei der Genomreplikation oder Regulation von ncRNAs auf ihre Entdeckung warten. Zusätzlich zu kanonischen repressiven miRNA-Aktivitäten auf trans Targets kann die Biogenese einiger miRNAs vermitteln cis Verordnung [103]. Mehrere Viren kodieren prä-miRNAs eingebettet in cis innerhalb viraler mRNA-Transkripte (Fig. 4A). Es wurde gezeigt, dass Prä-miRNAs von KSHV und EBV als negativ funktionieren cis Regulatoren der viralen Proteinexpression, wenn auch über unterschiedliche Mechanismen. In KSHV werden zwei im Kaposin B (KapB) 3′UTR eingebettete prä-miRNAs durch den Mikroprozessorkomplex gespalten, was zu einer verminderten KapB-Proteinexpression in der Latenzzeit führt [104]. Interessanterweise wird diese Repression während der lytischen Replikation teilweise gemildert, was einen posttranskriptionellen Mechanismus für die unterschiedliche Kontrolle der viralen Genexpression bei latenter versus lytischer Infektion impliziert. Das EBV BHRF1-Transkript wird auch reguliert durch cis prä-miRNA-Elemente, aber in dieser Situation wird angenommen, dass das Andocken des Mikroprozessorkomplexes in Kombination mit einer alternativen Transkriptionsinitiationsstelle ein verändertes Spleißmuster dieser mRNA zu einer Form fördert, die einer reduzierten Translationseffizienz unterliegt [105]. Somit ist das Nettoergebnis, obwohl über andere Mechanismen, ähnlich wie bei KapB, wobei weniger BHRF1-Protein spezifisch während der Latenz produziert wird. Da Viren oft als Wünschelrute dienen, die auf neue Wirtsaktivitäten hinweisen, gelten solche scheinbar atypischen Aktivitäten viraler miRNAs wahrscheinlich auch für einige Wirtstranskripte.

(A) Die Verwendung der miRNA-Biogenesemaschinerie des Wirts zur Modulation von mRNA in cis wurde bei zwei verschiedenen Herpesviren berichtet. Auf der linken Seite fungiert das KSHV-Gen Kaposin B (KapB) sowohl als mRNA, die ein Protein kodiert, als auch als pri-miRNA für zwei KSHV-kodierte miRNAs. Jedes KapB-Transkript kann entweder als mRNA oder pri-miRNA fungieren, aber nicht beides, da die prä-miRNA-Biogenese im Zellkern stattfindet und die mRNA zerstört. Die Spiegel der Wirts-Mikroprozessorkomponente Drosha werden während der lytischen Replikation verringert und ermöglichen so eine Verschiebung auf den Weg, der die KapB-Proteinproduktion begünstigt [104]. Auf der rechten Seite fungiert das EBV-Gen BHRF1 sowohl als mRNA, die ein Protein kodiert, als auch als pri-miRNA für mehrere EBV-kodierte miRNAs. Während der Latenz III bindet der Mikroprozessor das Transkript und das 5'-translationshemmende Intron wird in BHRF1-Transkripten beibehalten. Eine veränderte Auswahl der Transkriptionsstartstelle während des lytischen Zyklus führt zu einem veränderten Spleißen und einer veränderten Expression des BHRF1-Proteins [105]. Das Nettoergebnis ist, dass eine geringe BHRF1-Proteinexpression in der Latenzzeit mit erhöhter Expression während einer lytischen Infektion auftritt. (B) Antisense-miRNA/mRNA-Wechselwirkungen wurden sowohl bei Polyomaviren als auch bei Herpesviren berichtet. Virale miRNAs werden antisense zu viralen mRNAs kodiert und die viralen miRNAs steuern die siRNA-ähnliche Spaltung der in Sense-Orientierung transkribierten mRNAs. Diese Antisense-Anordnung kann nicht nur die mRNA-Spiegel verringern, sondern auch als posttranskriptioneller Isolator in cis und trans um die Akkumulation von langen Antisense-RNAs zu verhindern.


Es gibt leichte Unterschiede zwischen den beiden

Der Prozess der RNA-Interferenz (RNAi) kann entweder durch siRNA oder miRNA moderiert werden, und es gibt feine Unterschiede zwischen den beiden. Beide werden, wie erwähnt, innerhalb der Zelle vom Enzym Dicer verarbeitet und in den Komplex RISC eingebaut.

siRNA gilt als exogene doppelsträngige RNA, die von Zellen aufgenommen wird. Mit anderen Worten, es dringt durch Vektoren wie Viren ein. Vektoren entstehen, wenn Genetiker DNA-Stücke verwenden, um ein Gen zu klonen, um einen genetisch veränderten Organismus (GVO) herzustellen. Die dabei verwendete DNA wird als Vektor bezeichnet.

Obwohl angenommen wird, dass siRNA exogene doppelsträngige RNA ist, ist miRNA einzelsträngig. Es stammt aus endogener nicht-kodierender RNA, was bedeutet, dass es innerhalb der Zelle hergestellt wird. Diese RNA befindet sich in den Introns größerer RNA-Moleküle.


Hintergrund

MicroRNAs (miRNAs) sind eine umfangreiche Klasse einzelsträngiger nicht-kodierender RNA mit einer Länge von 19–24 Nukleotiden, die die Genexpression auf posttranskriptioneller Ebene negativ regulieren. Initiiert durch die Entdeckung von lin-4 in Caenorhabditis elegans (C. elegans) [1,2,3] wurden Tausende von miRNAs in Pflanzen, Tieren und anderen Eukaryoten identifiziert [4]. Bisher wurden über 38.589 miRNA-Genloci verteilt auf 271 Arten in der neuesten miRBase gespeichert (Release 22. März 2018, http://www.mirbase.org/). Durch komplementäre Basenpaarung können miRNAs effektiv die Translation hemmen oder den Abbau von Ziel-mRNAs (Messenger-RNAs) vermitteln. Sowohl pleiotrop als auch ubiquitär ist eine einzelne miRNA oft in der Lage, Hunderte von verschiedenen mRNA-Transkripten zu erkennen. Ebenso hat ein mRNA-Molekül normalerweise mehrere miRNA-Bindungsstellen und miRNAs, die an eine einzelne mRNA binden, wirken oft synergistisch [5]. MiRNAs spielen eine entscheidende Rolle in einer Vielzahl biologischer Prozesse, einschließlich Entwicklungstiming [6,7,8], Zelldifferenzierung [9,10,11], Proliferation [12, 13], Apoptose [14,15,16,17] und Stoffwechsel [18], die als solche an einer Vielzahl von menschlichen Krankheiten beteiligt sind [19,20,21]. Es wird geschätzt, dass 60 % aller Protein-kodierenden Gene von Säugetieren durch mindestens eine miRNA reguliert werden [22, 23].

Unsere tägliche Ernährung liefert nicht nur essentielle Nährstoffe, die für Überleben und Wachstum erforderlich sind, sondern auch bioaktive Verbindungen zur Gesundheitsförderung und Krankheitsprävention [24]. Epidemiologische Studien haben durchweg gezeigt, dass der regelmäßige Verzehr von pflanzlichen Lebensmitteln wie Obst, Gemüse und Vollkornprodukten bei Stoffwechselerkrankungen, Krebs und altersbedingtem Funktionsverlust förderlich ist [25, 26]. Das mechanistische Verständnis der nachgewiesenen Auswirkungen einer pflanzenreichen Ernährung muss jedoch noch geklärt werden. Es wird allgemein angenommen, dass die von Pflanzen aufgenommenen bioaktiven Komponenten wie Flavonoide, Phenolsäuren und Carotinoide zu einem geringeren Risiko für schwere chronische Krankheiten beitragen [27]. Dennoch gibt es ein faszinierendes Phänomen, dass synthetische Ergänzungen von sekundären Pflanzenstoffen oft nicht so effizient sind wie komplexe Pflanzenmaterialien wie Vitamine, was möglicherweise auf die Vielfalt bioaktiver Substanzen in Pflanzen und die Existenz bestimmter nicht identifizierter bioaktiver Komponenten hindeutet.

Im Jahr 2012 haben Zhang et al. [28] berichteten, dass aus Nahrung/Pflanzen stammende miRNAs im Serum von Menschen oder Pflanzen, die sich ernähren, nachgewiesen werden können und somit die Genexpression von Empfängern sequenzspezifisch weiter regulieren. Später zeigte Zhou [29], dass die von Geißblatt kodierte miRNA, miR2911, aufgenommen werden kann über Magen-Darm-Trakt (GI) von Influenza-A-Virus (IAV)-infizierten Mäusen und wirken viralen Infektionen entgegen. Diese Ergebnisse sind die ersten Hinweise darauf, dass miRNAs als neue bioaktive Bestandteile von Pflanzen wirken und das Potenzial haben, von Pflanzen zu Tieren zu gelangen über Magen-Darm-Trakt, um auf ihre zellulären Ziele zuzugreifen und die physio-pathologischen Zustände ihrer Empfänger zu beeinflussen. Wenn die oben beschriebene Übertragung von miRNAs von Pflanzen auf den Menschen (die sogenannte Cross-Kingdom-Übertragung) validiert wird, könnte sie unser derzeitiges Wissen über die Eigenschaften, Wirksamkeit und biologischen Wirkungen bioaktiver Verbindungen in der Ernährung revolutionieren [30, 31].

Dieser Review zielt darauf ab, die wichtigsten unterstützenden und widersprüchlichen Beweise für die königsübergreifende Regulation von miRNAs zusammenzufassen und zu analysieren, um ihr Potenzial als neuer wirksamer Bestandteil in pflanzlicher Ernährung und Medikamenten besser zu verstehen. Zu Beginn werden die Ähnlichkeiten und Imparitäten von miRNAs zwischen Pflanzen und Tieren vorgestellt. Für beide Reiche werden insbesondere die Biogenese von miRNAs, die Erkennung ihrer Ziele und ihre Wirkungsweise zusammengefasst und verglichen. Anschließend werden aktuelle Erkenntnisse über die länderübergreifende Regulierung von pflanzlichen miRNAs skizziert und die mutmaßlichen Wirkmechanismen vorgeschlagen, die für einen effizienten Transfer von pflanzlichen Quellen auf menschliche Zellen verantwortlich sind. Darüber hinaus sind die hormonähnliche Wirkung von miRNAs und das komplizierte Zusammenspiel zwischen miRNAs und Hormonen impliziert. Abschließend wird kurz auf die möglichen Auswirkungen dieser Erkenntnisse auf den Fortschritt des Studiums der Ernährung und Medizin eingegangen.

Biogenese von miRNAs

Sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beginnt die Biogenese von miRNAs innerhalb des Zellkerns. Die meisten miRNAs werden von der Polymerase (Pol) II transkribiert [32, 33], während eine Untergruppe der tierischen miRNAs Produkte der RNA Pol III sind [34] (Abb. 1). Das anfängliche miRNA-Transkript wird als primäre miRNA (pri-miRNA) bezeichnet und enthält eine stabile Stamm-Schleife-Struktur. Die pri-miRNA besteht aus Tausenden von Nukleotiden [35] und beginnt sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren mit einer 7-Methylguanosin (m 7 G)-Kappe und endet mit einem 3′-Poly(A)-Schwanz. Unterschiede bestehen jedoch im nachfolgenden Erzeugungsprozess von funktionell ausgereiften miRNAs.

Vergleich von miRNA-Biogenese und Aktivitätswegen in Pflanzen und Tieren. Sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren beginnt die Biogenese von miRNAs im Zellkern. In Pflanzen werden miRNA/miRNA*-Duplexe von pri-miRNAs durch die Wirkung der DCL1-Endonuklease in zwei Schritten gespalten. DCL1 schneidet zunächst die unvollkommen gefalteten Enden von pri-miRNAs ab, um prä-miRNAs mit Stamm-Schleifen-Haarnadel-Sekundärstrukturen zu erzeugen. Die resultierenden prä-miRNAs werden weiter von DCL1 zu reifen miRNA/miRNA*-Duplexen ausgeschnitten. Dann wird der 3′-Terminus der Duplexe durch HEN1 methyliert. Im Gegensatz dazu werden bei Tieren prä-miRNAs im Zellkern durch die Wirkung des Drosha-Enzyms zusammen mit seinem DGCR8-Protein (bei Säugetieren) oder Pasha-Protein (bei Fliegen) produziert. Duplexe von miRNA/miRNA* werden nach dem Export vom Kern in das Zytoplasma weiterverarbeitet, wo Prä-miRNAs von Dicer und TRBP (bei Säugetieren) oder Loqs (bei Fliegen) gespalten werden. Bei Pflanzen ist HASTY für den Transport von miRNA/miRNA*-Duplexen vom Zellkern zum Zytoplasma verantwortlich, während bei Tieren prä-miRNAs erkannt und dann von Exportin-5 Ran-GTP-abhängig exportiert werden. Während der RISC-Beladung wird ein Strang der kleinen RNA-Duplexe als Leitstrang ausgewählt (grün bei Pflanzen oder rot bei Tieren) und in Ago eingebaut, um ein funktionelles RISC zu bilden, während der andere Strang entfernt und abgebaut wird.In Pflanzen weisen miRNAs eine nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Ziel-mRNAs auf. Im Gegensatz dazu haben tierische miRNAs oft Ziele mit unvollkommener Komplementarität und die wichtigste Determinante für die Bindung tierischer miRNAs an ihre Ziel-mRNAs ist eine 6–8 Nukleotiddomäne am 5′-Ende oder der Samensequenz. Pfeile geben die Richtung der nachfolgenden Aktivitätswege an. Sowohl pflanzliche als auch tierische miRNAs können die Genexpression durch mRNA-Zerfall und translationale Hemmung regulieren

Bei Tieren wird eine lange pri-miRNA zuerst von einer Ribonuklease (RNase) III, genannt Drosha, zusammen mit ihrem doppelsträngigen RNA (dsRNA)-bindenden Proteinpartner DGCR8 (DiGeorge-Syndrom Critical Region Gen 8, in Säugetieren) oder Pasha . gespalten (in Fliegen) [36,37,38,39], wodurch eine ∼ 70-nt-Haarnadelvorläufer-miRNA (pre-miRNA) innerhalb des Zellkerns freigesetzt wird. Anschließend kann die prä-miRNA, erkannt von einem anderen RNase-III-Exportin-5, Ran (ras-related Nuclear Protein)-GTP (Guanosintriphosphat)-abhängig ins Zytoplasma transportiert werden [40, 41]. Anschließend setzt ein anderes RNase-III-Enzym, Dicer, zusammen mit seinem dsRNA-Bindungspartner-Transaktivierungs-Antwort-RNA-Bindungsprotein (TRBP, bei Säugetieren) oder Loquacious (Loqs, bei Fliegen) eine Prä-miRNA-Stammschleife frei, um eine miRNA/miRNA* zu erzeugen. Duplex [42,43,44,45,46]. Im Zytoplasma wird der miRNA/miRNA*-Duplex getrennt, der miRNA-Strang wird in RISC (RNA-induzierter Silencing-Komplex) eingebaut, während der miRNA*-Strang typischerweise durch einen unbekannten Mechanismus abgebaut wird. Damit das Slicing erfolgen kann, muss Argonaute (Ago), eine Kernkomponente des RISC, enthalten sein. Von den vier Säugetier-Ago-Proteinen besitzt nur Ago2 „Slicer“-Fähigkeiten [47]. In Fällen, in denen eine Spaltung nicht möglich ist, rekrutieren Ago-Proteine ​​zusätzliche Proteinpartner, um das Silencing zu vermitteln [48].

Während in Pflanzen aufgrund des Fehlens von Drosha-Genen die Spaltung von pri-miRNAs durch das pflanzliche RNase-III-ähnliche Protein erfolgt. Unter den vier Dicer-ähnlichen Enzymen in Pflanzen ist Dicer-like (DCL)1 für den Großteil der Biogenese von miRNAs verantwortlich [49]. DCL1 verarbeitet die pri-miRNA hauptsächlich in zwei Schritten. Es schneidet zunächst das unvollkommen gefaltete Ende der pri-miRNA ab, um die prä-miRNA mit einer Stamm-Schleifen-Haarnadel-Sekundärstruktur zu erzeugen. Die resultierende Prä-miRNA wird von DCL1 weiter ausgeschnitten, um einen miRNA/miRNA*-Duplex zu produzieren [50]. Im Gegensatz zu Tieren wird die Biogenese von miRNA/miRNA* in Pflanzen innerhalb des Zellkerns [51] in einem nuklearen Verarbeitungszentrum, das als Dicing Bodies (D-Bodies) bezeichnet wird, abgeschlossen [52, 53]. Ein weiterer bemerkenswerter Unterschied besteht darin, dass pflanzliche miRNAs universell an ihren 3′-Enden methyliert sind, während die meisten Produkte tierischer miRNA-Gene dies nicht sind. Nach der Freisetzung der anfänglichen miRNA/miRNA*-Duplexe werden sie dann 3′-terminal 2′-O-methyliert durch eine kleine RNA-Methyltransferase, genannt Hua Enhancer (HEN)1. Diese Modifikation verhindert ihre Uridylierung und den anschließenden Abbau [54]. Methylierte miRNA/miRNA*-Duplexe werden dann aus dem Zellkern in das Zytoplasma exportiert, um sie in zytoplasmatische Ago-Proteine ​​zu laden über ein Weg, der von Hasty (HST), einem Pflanzenhomologen von Exportin-5, kontrolliert wird [51]. Im Vergleich zu tierischen miRNAs kommen in Pflanzen zehn Mitglieder der Ago-Familie vor, unter denen der vorherrschende Effektor für miRNA-vermittelte Silencing-Reaktionen Ago1 ist [55, 56] und die meisten anderen pflanzlichen Ago-Proteine ​​wahrscheinlich auch RNA-Spaltungsaktivitäten besitzen [57 ].

Zielerkennung von miRNAs

Die Identifizierung von miRNA-Targets ist der Schlüssel zum Verständnis der miRNA-Funktion. Die unvollkommene Komplementarität der Basenpaarung zwischen miRNAs und ihren mRNA-Zielen bei Tieren macht es schwierig, mRNA-Ziele systematisch zu identifizieren [22]. Es ist bekannt, dass die funktionelle Erkennung des miRNA-Targets prinzipiell der Seed-Regel entspricht, die definiert, dass eine zusammenhängende Basenpaarung zum 5'-Ende von miRNAs, insbesondere den Nukleotiden 2–7, für das Targeting entscheidend ist [58]. Solche Saatstellen stammten ursprünglich von der ersten entdeckten miRNA lin-4, die eine gewisse Sequenzkomplementarität zu mehreren konservierten Stellen innerhalb des aufwies lin-14 RNA [1]. Danach wurde die Seed Rule durch groß angelegte Studien weiter bestätigt, die die Reaktionen des gesamten Transkriptoms und des Proteoms auf miRNAs überwachten [59,60,61,62,63]. In der Praxis ist die Seed-Regel, wenn sie in Kombination mit evolutionärer Konservierung [58], Sekundärstruktur [64] oder benachbarter Kontextinformation [60] von mRNA angewendet wird, informativ wertvoll bei der Vorhersage und Analyse kanonischer Seed-Sites. Es bleibt jedoch eine bestimmte Anzahl von Zielorten, die aufgrund der perfekten Samenkomplementarität nicht identifiziert werden konnten [65,66,67,68]. Tatsächlich haben mehrere biologische Studien bestätigt, dass perfekt aufeinander abgestimmte miRNA-Seeds weder notwendig noch ausreichend sind, um alle funktionellen miRNA-Target-Interaktionen nachzuweisen [69, 70]. Jüngste Fortschritte bei einer transkriptomweiten Methode zur präzisen Kartierung von miRNA-Bindungsstellen (Ago HITS-CLIP (High-throughput sequencing together with UV-crosslinking and immunoprecipitation) method) haben unerwartet gezeigt, dass ein großer Prozentsatz der miRNA-mRNA-Wechselwirkungen nicht nur durch Seed-Sites, aber die Vermittlung durch nicht-kanonische Sites erforderte eine Überlegung [71, 72]. Zu den Add-On-Modi der Zielerkennung gehören bei weitem Pivot-Seed-Paarung oder Nukleationswulst [73], zentrierende Paarung von miRNA-Bindungsstellen [74] und samenähnliche Motive [75,76,77].

Im Gegensatz zu tierischen miRNAs wurde die Zielerkennung von pflanzlichen miRNAs in erster Linie als einfach und unkompliziert angesehen, da die meisten pflanzlichen miRNAs eine perfekte oder nahezu perfekte Komplementarität zu ihren Ziel-mRNAs aufwiesen. Brodersen et al. zeigten, dass die translationale Repression ein weit verbreiteter Mechanismus ist, der von pflanzlichen miRNAs erfüllt wird [78], was die enorme Vielfalt und Komplexität der Genregulation in Pflanzensystemen unterstreicht. Neuere Studien haben eher einen Konsens über die „Regeln“ der Basenpaarung für eine funktionelle Pflanzen-miRNA-Target-Interaktion erzielt: geringe Toleranz gegenüber Fehlpaarungen an den Positionen 2–13, insbesondere an den Positionen 9–11, und mehr Toleranz gegenüber Fehlpaarungen an 1 und 14–21 [79]. Obwohl eine hohe Komplementarität zwischen pflanzlicher miRNA und ihrem Ziel eine Voraussetzung für die Silencing-Wirksamkeit war, wurden auch Abweichungen von dieser Regel beobachtet. Ein Beispiel war Arabidopsis miR398a, das sein Zielgen Kupfer/Zink-Superoxid-Dismutase (CSD)2 posttranskriptionell regulierte, trotz des Vorhandenseins einer Ausbuchtung und eines GU-Wobbles in der entscheidenden Region 2–13 [80]. Ebenso ein anderer Arabidopsis miR398-blau-kupferbindende Protein-Interaktion hatte eine 6-nt-Ausbuchtung zwischen den Positionen 6 und 7 der miRNA [81]. Solche Studien deuteten darauf hin, dass die Komplementarität möglicherweise nicht die einzige Determinante für die effiziente Stummschaltung zusätzlicher Merkmale wie der Zugänglichkeit oder Sekundärstruktur der Ziel-mRNA [82], der RNA-bindenden Proteine ​​[83] und des stöchiometrischen Verhältnisses zwischen miRNA und Ziel-mRNA-Häufigkeit ist [ 84] berücksichtigt werden.

In Bezug auf die Positionen der Zielstellen in mRNAs dachte man früher, dass tierische miRNAs Ziel-mRNAs hauptsächlich an der 3'-untranslatierten Region (UTR) binden, während pflanzliche mRNAs, die durch miRNAs reguliert werden, überwiegend in den kodierenden Sequenzen (CDS) lokalisiert sind. Aufschlussreichere Studien haben gezeigt, dass sowohl tierische als auch pflanzliche miRNAs auf 5’ UTR, 3’ UTR und CDS abzielen können [85, 86], was auf die Vielfalt der miRNAs-Bindungsstellen und Ähnlichkeiten in beiden Reichen schließen lässt.

Eine erfolgreiche Zielerkennung von miRNAs hängt zusätzlich von ihrer Stabilität ab, die durch Zieltranskripte moduliert wird. Frühere Studien haben interessante Hinweise auf reziproke Regulationen zwischen miRNAs und ihren Zielsequenzen geliefert, so dass Ziel-RNAs wiederum den miRNA-Zerfall modulieren können [87,88,89]. Das Ausmaß der Sequenzkomplementarität scheint sowohl bei Pflanzen als auch bei Tieren entscheidend für den miRNA-Abbau zu sein [90]. Da bei Tieren die Komplementarität von miRNAs für die meisten endogenen Ziele auf den Samen beschränkt ist und das unmethylierte 3′-Ende der miRNA im Ago verbleiben kann, ist der Abbau von miRNA durch Zieltranskripte ungewöhnlich [87]. Die Exposition einer miRNA gegenüber einer künstlichen Ziel-RNA mit extensiver Paarung führt jedoch möglicherweise zu einem 3′-Trimmen und Tailing der miRNA über Verdrängung des miRNA 3′-Endes von Ago [87,88,89]. Verglichen mit miRNAs in Tieren sind pflanzliche miRNAs nahezu perfekt komplementär zu ihren Ziel-RNAs und eine ausgedehnte Paarung kann das 3′-Ende von miRNAs freilegen [90]. In Abwesenheit der Methyltransferase-Aktivität von HEN1 unterliegt eine unmethylierte miRNA einem 3′-Trimming und Tailing durch Enzyme [91]. Obwohl die 2'-O-Methylierung an der 3'-terminalen Ribose die pflanzlichen miRNAs deutlich stabilisiert, können auch methylierte miRNAs abgebaut werden, was möglicherweise mit einer Demethylierung einhergeht [90]. Neben den zielabhängigen Mechanismen umfassen andere Faktoren, die die miRNA-Stabilität beeinflussen, miRNA-abbauende Enzyme [92], cis-Elemente in miRNAs [93] und RNA-bindende Proteine ​​[94]. Bis heute sind die Dynamik des miRNA-Abbaus und die damit verbundenen molekularen Mechanismen weitgehend unklar. Weitere Anstrengungen werden erforderlich sein, um zu klären, wie pflanzliche miRNAs im Tierreich-System dem Abbau unterliegen.

Wirkungsmechanismus von miRNAs

Sowohl in Pflanzen als auch in Tieren müssen miRNAs einen Ribonukleoproteinkomplex, RISC, bilden, um Ziel-mRNAs zum Schweigen zu bringen [95, 96]. Das minimale RISC besteht aus einer kleinen RNA (sRNA) und Ago [97]. Die miRNAs üben Gen-Silencing durch zwei Hauptmechanismen aus: mRNA-Zerfall und translationale Repression [96]. Die Art der Zielrepression wurde weitgehend durch den Grad der Komplementarität zwischen der miRNA und ihren mRNA-Zielen bestimmt. Eine hohe Komplementarität, wie sie in Pflanzen beobachtet wird, fördert die Zielspaltung durch RISC, während die Samenübereinstimmung oft zu einer translationalen Hemmung führt, von der angenommen wird, dass sie bei Tieren die dominante Wirkungsweise von miRNAs ist [98]. In den letzten Jahren verschwimmen die Grenzen zwischen pflanzlichen und tierischen miRNAs in Bezug auf die Wirkmechanismen, da es immer mehr Hinweise darauf gibt, dass miRNA-Zerfall und translationale Hemmung in beiden Reichen auftreten können. Obwohl sie möglicherweise durch Mechanismen feiner Unterscheidungen funktionieren.

MiRNA-vermittelter mRNA-Zerfall bei Tieren

Ursprünglich wurde angenommen, dass tierische miRNAs die Ziel-mRNA-Spiegel nicht beeinflussen, sondern nur die Translation unterdrücken [2, 99]. Folgestudium in C. elegans und Zebrafische zeigten, dass miRNAs auch den Abbau ihrer Ziel-mRNAs förderten [100], aber der Mechanismus des mRNA-Zerfalls war unabhängig von der endonukleolytischen Spaltung, die sich von der von Pflanzen-miRNAs unterschied. Bei Tieren gibt es normalerweise drei Schritte beim miRNA-vermittelten mRNA-Zerfall. Der erste Schritt ist die Deadenylierung. Die miRNAs induzieren eine Poly(A)-Verkürzung, indem sie zwei Deadenylase-Komplexe, Kohlenstoffkatabolit-Repressor (CCR)4-negativ auf TATA (NOT) und Poly(A)-Nuklease (PAN)2-PAN3, auf Ziel-mRNAs durch GW182 (Glycin- Tryptophan-Protein von 182 kDa) Proteine ​​(Trinukleotid-Repeat-enthaltend (TNRC)6 bei Säugetieren und GW182 oder Gawky in Drosophila) [98, 101]. Es ist erwähnenswert, dass GW182-Proteine ​​eine zentrale Rolle im tierischen miRNA-Weg spielen und als flexible Gerüste fungieren, um die Interaktion zwischen Ago-Proteinen und nachgeschalteten Effektorkomplexen wie CCR4–NOT und PAN2–PAN3 zu überbrücken. Neben der Rekrutierung von Deadenylasen fördern GW182-Proteine ​​auch die Dissoziation von Poly(A)-bindendem Protein (PABP), was die Zugänglichkeit des Poly(A)-Schwanzes für Deadenylasen verbessern könnte, wodurch die Effizienz der Deadenylierung erhöht wird [102]. Der zweite Schritt ist die Entkappung über das Decapping-Protein (DCP)2, das für volle Aktivität oder Stabilität zusätzliche Cofaktoren benötigt. Zu diesen Cofaktoren gehören DCP1, Enhancer of Decapping (EDC)3, EDC4 und DEAD Box Helicase 6 (DDX6 auch bekannt als Dhh1, RCK, p54 und Me31B in verschiedenen Spezies) [103]. Schließlich werden deadenylierte und entkappte mRNAs von der wichtigsten zytoplasmatischen Nuklease 5'-zu-3'-Exoribonuklease (XRN)1 abgebaut [98].

MiRNA-vermittelter mRNA-Zerfall in Pflanzen

Im Gegensatz zu tierischen miRNAs können pflanzliche miRNAs die Deadenylierung nicht fördern [104] stattdessen führen sie die Spaltung der Ziel-mRNA durch, die an einer genauen Position erfolgt. Dieses sogenannte „Slicing“ wird von der P-Element-induzierten Wimpy Testes (PIWI)-Domäne von Ago-Proteinen durchgeführt, die eine RNase H-ähnliche Faltung bildet und Endonuklease-Aktivität aufweist. Die Endonuklease-Aktivität der PIWI-Domäne wurde experimentell bestätigt für Arabidopsis Ago1 [56, 105] sowie Ago2 [106], Ago4 [107], Ago7 [108] und Ago10 [109]. Beim Schneiden werden zwei mRNA-Fragmente erzeugt: eines ist ein 5'-Fragment, das an seinem 5'-Ende durch die Kappenstruktur mit einem ungeschützten 3'-Ende geschützt ist, und das andere ist ein 3'-Fragment mit einem exponierten 5'-Ende und einem Poly( A)-geschütztes 3′-Ende. Die beiden entstandenen Fragmente müssen zügig beseitigt werden, damit das RISC zum nächsten Ziel vordringen kann. In Arabidopsis, XRN4, eine 5'-zu-3'-Exoribonuklease, ist für den Abbau der 3'-Fragmente verantwortlich, da in einer funktionslosen Mutante von XRN4 eine akkumulierte Menge an 3'-Fragmenten gefunden wurde [110]. Zur Entfernung der resultierenden 5'-Fragmente gibt es verschiedene Wege, die dazu beitragen könnten. Ähnlich wie 3'-Fragmente können die 5'-Spaltungsfragmente durch XRN4 abgebaut werden. Darüber hinaus kann auch das zytoplasmatische Exosom eine Rolle spielen, da die Untereinheiten seines Cofaktors, wie Superkiller (SKI)2, SKI3 und SKI8, für den Abbau von RISC-generierten 5′-Fragmenten benötigt werden [111]. Darüber hinaus wird das 3′-Ende des 5′-Fragments häufig durch HEN1-Suppressor (HESO)1 uridyliert [112], was den Abbau des 5′-Fragments beschleunigen kann.

MiRNA-vermittelte translationale Repression bei Tieren

Obwohl in den letzten Jahren beträchtliche Fortschritte bei der Aufklärung der Biochemie, Biologie und Genomik der miRNA-gesteuerten mRNA-Regulierung erzielt wurden, wird der detaillierte Mechanismus der translationalen Repression noch immer intensiv diskutiert. Grob unterteilt umfasst die Translation drei Schritte: Ribosomen-Initiation, Elongation und Termination. Interessanterweise gibt es Beweise sowohl für die Initiation als auch für die Repression nach der Initiation. Mit dem Aufkommen der Ribosomen-Profiling-Methode, die genaue Messungen der Translationseffizienz ermöglicht, wird nun akzeptiert, dass inhibitorische Mechanismen, die nach der Initiation auftreten, ausgeschlossen werden können [98]. Der sich abzeichnende Konsens auf diesem Gebiet ist, dass miRNAs die cap-abhängige Translation bei der Initiation hemmen [113], aber der genaue molekulare Mechanismus dafür ist mehrdeutig [114]. Die Translationsinitiation beginnt mit der Bindung des eukaryotischen Translationsinitiationsfaktors (eIF)4F-Komplexes an die Cap-Struktur der mRNA. Der EIF4F-Komplex besteht aus dem Cap-bindenden Protein eIF4E, der RNA-Helikase eIF4A und dem Gerüstprotein eIF4G, wobei letzteres sowohl mit eIF4E als auch mit eIF4A interagiert. Vorgeschlagene Mechanismen für die miRNA-vermittelte translationale Repression umfassen die GW182-vermittelte PABP-Verdrängung [102, 115], die Rekrutierung der translationalen Repressoren durch GW182 [116,117,118,119] und die Dissoziation von eIF4A vom eIF4F-Komplex [120,121,122].

GW182-vermittelte PABP-Verdrängung

GW182-Proteine ​​induzieren nicht nur Deadenylierung und anschließenden mRNA-Zerfall, sondern auch translationale Repression [123]. PABP, das an den 3'-Poly(A)-Schwanz von mRNAs bindet, stimuliert die Translation, indem es die Bindung des eIF4F-Komplexes an die Cap-Struktur durch Interaktion mit eIF4G stabilisiert. Strukturstudien haben gezeigt, dass GW182-Proteine ​​in der Lage sind, über das PABP-interagierende Motiv (PAM)2 direkt mit der C-terminalen Mademoiselle (MLLE)-Domäne von PABP zu interagieren, wodurch PABP eingeschränkt wird. Interessanterweise haben neuere Erkenntnisse gezeigt, dass miRNA die Dissoziation von PABP von Ziel-mRNAs auf Deadenylierungs-unabhängige Weise fördert [102]. Dieses Phänomen passt zu dem vorgeschlagenen Modell, das postuliert, dass die GW182-vermittelte Verdrängung von PABP aus dem Poly(A)-Schwanz die durch die Wechselwirkung zwischen eIF4G und PABP gebildete „geschlossene Schleife“-Struktur aufbricht und dadurch die Translationsinitiation unterdrückt [124].

Rekrutierung der Translationalen Repressoren durch GW182

Über den CCR4-NOT-Komplex rekrutiert GW182 nachgelagerte translationale Repressoren wie DDX6 oder eIF4E-Transporter (4E-T) auf Ziel-mRNAs. DDX6 ist als Decapping-Aktivator bekannt, kann aber auch bei der translationalen Repression wirken [125]. In embryonalen Stammzellen der Maus wird gezeigt, dass DDX6 an die miRNA-Targets rekrutiert wird, indem es mit dem hyperplastischen Bandscheibenprotein EDD (E3-Ligase identifiziert/isoliert durch Differential Display) von Säugetieren interagiert, das an GW182-Proteine ​​in den Argonaute-miRNA-Komplexen bindet [126]. Neuere Studien haben auch vorgeschlagen, dass 4E-T, ein eIF4E-bindendes Protein, an den CCR4-NOT-Komplex rekrutiert werden könnte, um die Translation durch DDX6, PATL (PAT1-ähnliches Protein)1 oder LSM (Sm-ähnliche Domäne enthaltendes Protein) zu unterdrücken )14 [118, 119]. Fragen, wie beispielsweise welcher Schritt der Translation durch diese Repressoren blockiert wird, erfordern jedoch eine weitere Charakterisierung.

miRNA-vermittelte Dissoziation von eIF4A

EIF4A-RNA-Helikasen sind Translationsinitiationsfaktoren, die Sekundärstrukturen innerhalb der 5’-UTR der mRNA entwinden, sodass die 43S-Prä-Initiationskomplexe (PIC) die 5’-UTR in Richtung des Startcodons scannen können. Einige neuere Studien haben gezeigt, dass miRNAs auch die Translation unterdrücken können über Verdrängung von eIF4A aus dem Cap-Bindungskomplex eIF4F, der die 43S-PIC-Rekrutierung oder das ribosomale Scanning in vitro blockiert [120,121,122]. Dieses Modell bleibt jedoch die Überprüfung durch direkte Beweise.

MiRNA-vermittelte translationale Repression in Pflanzen

Pflanzen-miRNAs sollten ursprünglich Ziel-mRNAs nur durch die endonukleolytische Aktivität von Ago-Proteinen zum Schweigen bringen. Auffallend ist, dass das GW182-Protein, die Kernkomponente, die für die miRNA-vermittelte translationale Repression bei Tieren erforderlich ist, in Pflanzen fehlt und seine homologen Proteine ​​bisher nicht gefunden wurden. Die unverhältnismäßigen Wirkungen von miRNAs auf die Zielgenexpression auf Transkript- und Proteinebene implizierten jedoch, dass pflanzliche miRNAs zusätzlich zur Zielspaltung eine Translationsrepression induzieren könnten [127,128,129]. Frühe Beispiele für miRNA-vermittelte translationale Hemmung in Pflanzen waren Apetala (AP)2 und Squamosa-Promotor-Bindungsprotein-like (SPL)3, die durch miR172 bzw. miR156/7 reguliert werden [127, 128]. Wenn miR172 und miR156/7 abnormal akkumulierten, waren AP2 und SPL3 auf Proteinniveau im Vergleich zu denen des Wildtyps verändert, während ihre Transkriptwerte vergleichbar waren. Ähnliche Beobachtungen wurden anschließend für andere miRNAs gemacht, darunter miR159 [130], miR164, miR165/6 [131], miR171, miR395, miR398 und miR834 [78].Bekannte Faktoren, die an der translationalen Repression beteiligt sind, umfassen das Mikrotubuli-severing Enzym Katanin1 (KTN1), den Decapping-Aktivator Ge-1 Homolog Varicose (VCS) [78], das GW-Repeat Protein SUO [132], das ER Membran Protein Altered Meristem Program (AMP)1 und sein Homolog, wie AMP (LAMP)1 [131]. Derzeit ist noch nicht klar, wie diese Faktoren ihre Funktionen in den miRNA-Wegen von Pflanzen ausüben und wie die miRNA-vermittelte translationale Repression reguliert wird.

Zusammengenommen weisen die Biogenese und der Wirkmechanismus von miRNAs ein hohes Maß an Ähnlichkeit zwischen Tieren und Pflanzen auf, obwohl es tatsächlich einige subtile Unterschiede gibt.

Von der Nahrung/von Pflanzen abgeleitete miRNAs bei Tieren

Tatsächlich ist bekannt, dass die natürliche Aufnahme von aus der Nahrung stammenden miRNAs oder dsRNAs in einer Vielzahl von niederen Eukaryoten oder Wirbellosen biologisch wirksam ist [31]. 1998 wurde erstmals entdeckt, dass sRNAs, die in Nahrungsmaterial gefunden werden, die Genexpression von aufnehmenden Organismen in C. elegans durch den Prozess der RNA-Interferenz [133]. Seitdem wurde gezeigt, dass verschiedene wirbellose Organismen sRNA-Moleküle aus verschiedenen Nahrungsquellen aufnehmen können, indem sie Nahrungsmaterial oral ausgesetzt werden, das entweder in vitro synthetisierte dsRNA [134, 135] oder künstlich exprimierte dsRNA von Pflanzen [136] oder Bakterien [137 ]. Kontinuierliche Beweise haben durchgängig gezeigt, dass die Aufnahme von sRNA aus Umweltquellen, einschließlich der Nahrung, in einfacheren Metazoen-Organismen möglich ist.

Interessanterweise deuten einige neuere Beweise darauf hin, dass ein ähnliches Phänomen bei Menschen und anderen Säugetieren auftreten könnte. Der revolutionäre Bericht von Zhang et al. behaupteten, dass aus der Nahrung stammende pflanzliche miRNAs im Kreislauf und in den Organen von Mensch und Maus gefunden wurden und dass sie ausreichend und effizient waren, um menschliche mRNAs zu regulieren [28]. Obwohl bereits früher bekannt war, dass exogene miRNAs in systemischen Flüssigkeiten nachgewiesen werden können [138,139,140,141], war dies der erste Beweis dafür, dass eine aus der Nahrung stammende/pflanzliche miRNA, nämlich aus Reis stammendes miR168a, die Genexpression bei ihren Empfängern regulieren kann. Bemerkenswert ist, dass pflanzliche miRNAs aufgrund der 2’-O-Methylierung an den terminalen Nukleotiden sehr resistent gegen Periodatoxidation sind. Diese charakteristische Struktur pflanzlicher miRNAs macht es den Autoren möglich und zuverlässig, miRNAs pflanzlichen Ursprungs klar von denen von Tieren zu unterscheiden. In ihrem Bericht wurde gezeigt, dass miRNAs aus Reis auf das Low-Density-Lipoprotein-Rezeptor-Adapter-Protein (LDLRAP)1 abzielen, ein Gen, das am Cholesterinstoffwechsel beteiligt ist [28]. Funktionelle Studien in vitro und in vivo zeigten, dass die Bindung von miR168a an LDLRAP1-mRNA die LDLRAP1-Expression in Leberzellen hemmte und folglich die Entfernung von Lipoproteinen niedriger Dichte (LDL) aus dem Blut verringerte [28]. Es wird daher vorgeschlagen, dass Darmepithelzellen pflanzliche miRNAs in der Nahrung aufnehmen und miRNAs in Mikrovesikel (MVs) verpacken könnten, um sie vor dem Abbau zu schützen und anschließend miRNAs in den Kreislauf freizusetzen. Die freigesetzten miRNAs wurden dann geliefert über den Blutstrom zu verschiedenen Geweben/Zellen, wo sie die Expression des Zielgens modulierten [28]. Darüber hinaus implizierten sie auch, dass pflanzliche miRNAs sogar das Ago2-Protein von Säugetieren verwenden könnten, um ihr eigenes RISC zu bilden und ihre Funktionen ähnlich denen von Säugetier-miRNAs auszuführen [28]. Obwohl aufregend, haben mehrere Gruppen in der Folge komplexere Beweise vorgelegt, die die Möglichkeit einer pflanzlichen miRNA-Aufnahme und ihren potenziellen Einfluss auf biologische Prozesse bei Tieren belegen (Tabellen 1 und 2).

Belege (Tabelle 1)

Nach Zhangs Arbeit wurde eine Studie von Liang et al. zeigte, dass miR172 aus Kohl (Brassica oleracea) wurde in Blut, Milz, Leber und Niere von Mäusen nachgewiesen, die mit pflanzlicher Gesamt-RNA gefüttert wurden [142]. Darüber hinaus fanden sie heraus, dass sRNAs in Gegenwart von abbauenden Enzymen 36 Stunden oder länger in Blut- und Stuhlproben überleben können, was auf die potenzielle Stabilität von sRNAs hinweist. Im Jahr 2015 veröffentlichte eine andere Gruppe ihre Ergebnisse von Freiwilligen, die Wassermelonensaft tranken oder gemischte Früchte (Wassermelone, Banane, Apfel, Orange, Traube, Mango und Melone) aßen [143]. Mithilfe von Echtzeit-Reverse-Transkriptions-Polymerase-Kettenreaktion (RT-qPCR) und Northern-Blotting identifizierten sie 10 Pflanzen-miRNAs in menschlichem Plasma mit hohen Basalspiegeln [143]. Mit einer Kinetikstudie bewiesen sie, dass die Aufnahme pflanzlicher miRNA kein technisches Artefakt oder Kontamination, sondern ein reales physiologisches Ereignis ist. Wichtig ist, dass sie ein Standardverfahren für die Messung von pflanzlichen miRNAs in menschlichem und tierischem Plasma etablierten, das Untersuchungen in diesem aufstrebenden Gebiet fördern würde.

Studien, die die biologisch relevante Aufnahme von miRNAs pflanzlichen Ursprungs unterstützen, konzentrierten sich auf miR2911, eine aus Geißblatt gewonnene miRNA [29, 144,145,146,147]. Geißblatt ist ein bekanntes chinesisches Kraut, das bei der Vorbeugung und Bekämpfung von Epidemien weit verbreitet ist. Moderne pharmakologische Studien haben bestätigt, dass Geißblatt ein breites Spektrum antimikrobieller Aktivität aufweist [148]. Zhanget al. [29] zeigten, dass kontinuierliches Trinken oder Füttern der Abkochung von gekochtem Geißblatt mit einer Sonde zu einer Erhöhung von miR2911 in den Seren und Lungen von Mäusen führte. Interessanterweise wurde miR2911 während des Geißblattkochprozesses nicht abgebaut [29]. Dieses Phänomen stimmte mit einer Simulationsstudie überein, in der diRNAs aus Nahrungspflanzen nach Lagerung, Verarbeitung, Kochen und frühem Verdau stabil in intakter Form vorhanden waren [149]. Nachfolgende funktionelle Studien von miR2911 zeigten, dass miR2911 verschiedene IAVs angreift und hemmt, einschließlich H1N1, H5N1 und H7N9 [29]. Sie zeigten auch, dass der Großteil von miR2911 im peripheren Blut der Maus in der MVs-Fraktion nachgewiesen wurde und größtenteils mit dem Ago2-Komplex assoziiert ist, was darauf hindeutet, dass miR2911 seine Funktion über denselben MV-vermittelten Weg ausüben könnte. Bezüglich der Stabilität von miR2911 wurde vorgeschlagen, sich auf seine einzigartige Sequenz und seinen hohen GC-Gehalt zu verlassen. Aufschlussreicheres Wissen über miR2911 wurde durch vier unabhängige Studien von Yang et al. [144,145,146,147]. Konsequenterweise berichtete Yang über einen signifikanten Anstieg von pflanzlichem miR2911 in den Seren und im Urin der Geißblatt-Abkochung konsumierenden Mäuse [144]. Darüber hinaus führte die durch Cisplatin verursachte Schädigung des Darms auch zu einer erhöhten miRNA-Retention im Mauskreislauf [144], was die Möglichkeit der Übertragung von miRNAs von Pflanzen auf Tiere weiter bestätigte. Yangs Arbeit [145, 146] schlug auch vor, dass die hohe Stabilität von zirkulierendem miR2911 weder mit Exosomen noch mit dem Ago-Komplex in Zusammenhang steht. Darüber hinaus zeigten sie, dass miR2911 im Gegensatz zu den meisten pflanzlichen Biomolekülen atypisch war, da ihre Häufigkeit positiv mit dem Abbau pflanzlicher Lebensmittel und rRNAs (ribosomale RNAs) korrelierte und ihre Biogenese Dicer-unabhängig war [147]. Die obigen Informationen legen nahe, dass miRNAs eine der versteckten, aber bioaktiven Komponenten in pflanzlichen Arzneimitteln sein könnten.

Die Potenziale für den therapeutischen Einsatz pflanzlicher miRNAs wurden auch durch Studien anderer Labore belegt [150,151,152,153]. Eine Gruppe berichtete, dass die orale Verabreichung eines Cocktails von drei Tumorsuppressor-miRNAs, die entworfen wurden, um in Pflanzen produzierte sRNAs nachzuahmen, die Tumorbelastung in einem Mausmodell für Dickdarmkrebs reduzierte [150]. Eine andere Gruppe zeigte, dass miR159 aus Pflanzen hauptsächlich in westlichen menschlichen Seren und Tumorgeweben nachgewiesen werden konnte und mit der Inzidenz und Progression von Brustkrebs in Verbindung gebracht wurde [151]. Noch wichtiger ist, dass weitere Daten zeigten, dass synthetische Formen von pflanzlichem miR159 das Wachstum von Brusttumoren bei Mäusen signifikant reduzierten, indem sie die Sequenz der 3′-UTR der Transkriptionsfaktor (TCF)7-mRNA ansteuerten. Ihre Studie deutete darauf hin, dass pflanzentechnisch hergestellte miRNA, die für spezifische Ziele entwickelt wurde, ein signifikantes Potenzial für klinische therapeutische Anwendungen besitzt [151]. Unterstützend haben Cavalieri et al. [152] demonstrierten, dass Erdbeer-miRNAs als Liganden fungieren und an den Toll-like-Rezeptor (TLR)3 auf dendritischen Zellen binden können, wodurch deren Reaktionen auf Entzündungsstoffe moduliert werden. Diese Studie konsolidierte die therapeutische Kapazität von pflanzlichen miRNAs bei der Prävention menschlicher Erkrankungen. Ein neueres Ergebnis von Wang et al. [153] zeigten, dass exogenes miR451 in der Lage war, durch das Verdauungssystem von Mäusen in den Kreislauf zu gelangen, um die antioxidative Aktivität in vivo zu erhöhen über Foxo3-Weg. Diese Studien legen nahe, dass aus Pflanzen oder Nahrung gewonnene miRNAs nicht nur effektiv auf Tiere übertragen werden können, sondern ihre Genregulationsfunktion länderübergreifend ausüben.

Widersprüchliche Beweise (Tabelle 2)

Zusammen mit den oben genannten Studien, die die Aufnahme und biologische Funktion von miRNAs aus Pflanzen unterstützen, wurden große Anstrengungen unternommen, um die Rationalität dieses Problems zu argumentieren, einschließlich direkter Replikationen von Zhangs Arbeit. Dickensonet al. [154] versuchten, die ursprüngliche Arbeit von Zhang [28] zu validieren, fanden jedoch keinen konsistenten Beweis für die Aufnahme von miR168a über die Nahrung nach der Reisfütterung. In ihrer Studie wurden Mäuse in Standardfutter eingeteilt, eine ernährungsphysiologisch ausreichende Ernährung mit 41% Reis bzw. rohem Reis. Leider wurden im Blut oder in der Leber von Mäusen, die mit reishaltiger Nahrung gefüttert wurden, wenig oder keine pflanzlichen miRNAs oder miR168a nachgewiesen. Interessanterweise waren in Übereinstimmung mit den Ergebnissen von Zhang [28] die LDL-Spiegel in der Mäuseleber bei Mäusen, die mit ungekochtem Reis gefüttert wurden, tatsächlich erhöht, aber die Expression von LDLRAP1 blieb in allen drei experimentellen Gruppen unverändert. Sie schlugen daher vor, dass der von Zhang et al. war das Ergebnis einer kurzzeitigen Ernährungsbeeinflussung und möglicherweise der Freisetzung von endogenen Cholesterinspeichern, wenn die Cholesterinaufnahme unter dieser experimentellen Bedingung unzureichend war [154]. Unter Verwendung kürzlich entwickelter Deep-Sequencing-Technologien und bioinformatischer Analysen fanden zwei weitere Gruppen [155, 156] variable Mengen an pflanzlichen miRNAs in öffentlichen Tier-sRNA-Datensätzen. Unter ihnen war miR168a das am häufigsten vorkommende Molekül mit einer für monokotyle Pflanzenarten typischen Sequenz. Außerdem haben Zhang et al. [155] führten auch Experimente mit kontrollierter Insektenfütterung durch, bei denen aus Pflanzen abgeleitete miRNAs einschließlich miR168a auch in Datensätzen für Insekten gefunden wurden, die sich nicht mit einkeimblättrigen Pflanzen ernährten. Basierend auf experimentellen Beweisen, die darauf hindeuten, dass die Kreuzkontamination während der Bibliotheksherstellung eine unbemerkte Quelle exogener miRNAs war, haben Tosar et al. [156] wies direkt darauf hin, dass die zugrunde liegende Ursache für die von Zhang und Kollegen erzielten Ergebnisse eine Kontamination von miRNAs war, anstatt von miRNAs, die aus anderen Königreichen übertragen wurden.

Außerdem wurden bei verschiedenen Insekten und Tieren negative Ergebnisse bezüglich der speziesübergreifenden Übertragung von pflanzlichen miRNAs erhalten [157,158,159,160]. Studie von Baier et al. zeigten, dass pflanzenbasierte miRNAs beim Menschen möglicherweise nicht bioverfügbar sind, da das Brassica-spezifische miR824 und das pflanzenspezifische miR167a im Blut von vier zufällig ausgewählten Teilnehmern nach Verzehr einer Brokkolisprossenmahlzeit kaum nachweisbar waren [157]. Konsequenterweise haben Snow et al. fanden einen erheblichen Gehalt an pflanzlichem miR156a, miR159a und miR169a in einer Nahrung, die üblicherweise von Menschen, Mäusen und Honigbienen konsumiert wird [158]. Nach Einnahme von Früchten voller aufgelisteter pflanzlicher miRNAs wiesen jedoch alle untersuchten Probanden keine nachweisbaren Plasmaspiegel dieser Moleküle auf [158]. Ähnliche negative Befunde wurden gezeigt für Macaca-Nemestrina, ein nicht-menschliches Primatenmodell, das von Witwer et al. [159] bei der Untersuchung ihrer Reaktionen auf die Nahrungsaufnahme einer miRNA-reichen Pflanze. Die Spiegel bestimmter pflanzlicher miRNAs im Blut wurden vor und nach (1, 4 und 12 h) der Einnahme durch RT-qPCR und digitale Tröpfchen-PCR bestimmt. Obwohl sie geringe Konzentrationen einiger untersuchter Pflanzen-miRNAs beobachteten, war die Amplifikation variabel und möglicherweise unspezifisch. Kürzlich zielte eine andere Forschungsgruppe darauf ab, Mais-miRNAs in Blinddarm, Kot, Leber und im Vollblut von Mäusen nachzuweisen [160]. Ähnlich wie in den oben diskutierten Studien gelang es Huang und Kollegen [160] nicht, Mais-miRNAs in den genannten Organen nach Supplementierung von Mais-miRNAs in der Tierernährung oder mit der Sonde an die Tiere zu identifizieren. Ein weiteres In-vitro-Verdauungssystem deutete darauf hin, dass der Abbau von miRNAs für die Beobachtungen verantwortlich war [160]. Zusammengenommen bestätigten diese unabhängigen Untersuchungen eine geringe oder geringe messbare Aufnahme von pflanzlichen miRNAs in Menschen und andere Säugetiere nach dem Verzehr von Pflanzen oder pflanzlichen miRNAs und zeigten entscheidende Probleme auf, die bei der Untersuchung der Übertragung von miRNAs zwischen den Königreichen existieren.

Die häufigsten Fallstricke, die von Andersdenkenden behauptet werden, sind die Zuverlässigkeit und Sensitivität von Techniken, die üblicherweise bei der Untersuchung der Übertragung von miRNAs zwischen den Königreichen angewendet werden. Zum einen konnte eine Kontamination mit endogenen miRNAs von Empfängern oder Studienplattformen nicht ausgeschlossen werden. Daher werden ein Standard- und Konsensus-Experimentalprotokoll, das pflanzliche und tierische miRNAs wirklich unterscheidbar macht, und eine genaue experimentelle Leistung in Abwesenheit jeglicher bekannter Quellen für Pflanzenkontaminationen dringend empfohlen. Zweitens geben Rauschen von Hintergrundsignalen während der RT-qPCR oder Artefakte aus dem Sequenzierungsverfahren große Bedenken, insbesondere wenn schwache Signale von Ziel-miRNAs nachgewiesen wurden. Dieser technische Fehler erfordert zuverlässige Negativkontrollgruppen und eine doppelte Bestätigung positiver Ergebnisse mit unabhängigen Methoden. Drittens führt die Auswahl relevanter experimenteller Kontrollen zu einigen Diskrepanzen. Ein umfassendes Design, Anwendung und Analyse von mehr als einer Kontrollgruppe kann dazu beitragen, die Meinungsverschiedenheiten zu verringern. Schließlich könnte ein direkter Beweis dafür, dass miRNAs pflanzlichen Ursprungs den GI kreuzen, die bestehenden Divergenzen auf diesem Gebiet beeinträchtigen.

Eine lange Reise: Lieferung von miRNAs aus der Nahrung/von Pflanzen (Abb. 2)

Abgesehen von Kontroversen darüber, ob aus der Nahrung/von Pflanzen stammende miRNAs ausreichend und effizient sind, um ihre Regulation der Genexpression in Empfängerzellen länderübergreifend durchzuführen, gibt es Bedenken, wie diese Moleküle den Magen-Darm-Trakt überleben, in das Kreislaufsystem eindringen und schließlich ihre auch Ziele wurden angehoben. Der erste entscheidende Punkt ist die Stabilität von miRNAs aus aktiver Nahrung/von Pflanzen im Herstellungsprozess sowie im Säugerkreislauf. Bei miRNAs aus Reis oder pflanzlichen Arzneimitteln sind Hochtemperaturprozessierungen wie Kochen oder Kochen unumgänglich, bei denen miRNAs weitgehend zerstört werden können. Darüber hinaus können die Existenz von RNasen, Phagozytose und extremer pH-Wert im GI-Trakt sowie die Blutzirkulation auch aufgenommene miRNAs destabilisieren, bevor sie zu den Empfängerzellen gelangen. Glücklicherweise scheint das Vorhandensein von 2’-O-Methylierung am 3'-terminalen Nukleotid aus der Nahrung/von Pflanzen stammenden miRNAs eine erhöhte Stabilität zu verleihen und ihre regulatorische Aktivität sicherzustellen [50, 54]. Ansonsten kann die erhöhte Stabilität auch durch die einzigartige Sequenz und den GC-Gehalt pflanzlicher miRNAs erklärt werden. Das prominenteste Beispiel ist das von Geißblatt abgeleitete miR2911 [29], wie oben erwähnt. Über die angeborene Fähigkeit von aus der Nahrung/von Pflanzen abgeleiteten miRNAs hinaus ist es wahrscheinlicher, dass die vermeintliche Existenz von miRNA-Trägern die aus Pflanzen/von der Nahrung stammenden miRNAs unter extrem harten Bedingungen schützt und anschließend ihre Translokation in Säugetiere unterstützt [30, 161]. Je nach Herkunft, Größe und Formulierungsmechanismus lassen sich diese Träger einteilen in: (1) Exosomen (50–100 nm), die von der endosomalen Membran abstammen (2) Mikrovesikel (20 nm-1 µm), die bei Zellstress von der Plasmamembran freigesetzt und (3) apoptotische Körper (1–5 μm), die als Reaktion auf apoptotische Stimuli freigesetzt werden [162, 163]. Es wurde berichtet, dass die oben aufgeführten Vesikel einerseits extrazelluläre miRNAs gegen RNasen schützen und andererseits ihren Transfer innerhalb des Wirts erleichtern können [164, 165]. 2014 haben Mu et al. [166] charakterisierten essbare, aus Pflanzen gewonnene exosomähnliche Nanopartikel (EPDENs), in denen Proteine, Lipide und miRNAs identifiziert wurden. Ihre Daten legten nahe, dass EPDENs bei oraler Verabreichung von Darmmakrophagen und Stammzellen aufgenommen wurden und aktiv biologische Funktionen auf die Empfängerzellen ausübten. Dieser Befund impliziert möglicherweise EPDENs als mögliche Mediatoren im Crosstalk zwischen dem Pflanzenreich und Säugerzellen. Darüber hinaus wurde nachgewiesen, dass die Stabilisierung extrazellulärer miRNAs mit RNA-bindenden Proteinen wie Nucleophosmin 1 [167], High-Density-Lipoproteinen (HDL) [168] und Ago-2 [169] assoziiert ist.

Ein schematisches Modell der Reise von miRNAs aus der Nahrung/von Pflanzen von der Natur zu menschlichen Empfängerzellen. Pflanzliche Lebensmittel oder Kräutermaterialien wie in Form von Abkochungen sind in miRNAs reichlich vorhanden, die möglicherweise in Vesikeln verpackt oder mit Proteinen eingebaut werden. Bei der Aufnahme dieser Pflanzenmaterialien könnten verschiedene Formen von Nahrung/von Pflanzen abgeleiteten miRNAs freigesetzt und anschließend in die Darmepithelzellen übertragen werden über verschiedene mögliche Mechanismen, 1) durch SID-ähnliche Transporter 2) Vesikel-vermittelte Transzytose 3) Ribonukleoproteinkomplex-vermittelte Endozytose 4) durch Immunzellen in der Darmbarriere 5) oder Diffusion in den Raum zwischen Epithelzellen. Durch die Darmschleimhaut absorbiert, gelangt miRNAs in den Kreislauf. Einmal an Zielzellen in Organen wie der Leber abgegeben und verschlungen, werden aus der Nahrung/von Pflanzen stammende miRNAs freigesetzt und führen anschließend ihre Funktionen aus. Wenn es unglücklich ist, können diese zirkulierenden miRNAs gefiltert und in der Niere ausgeschieden werden, bevor sie zu den Empfängerzellen gelangen

Ein weiteres wichtiges Thema ist, wie miRNAs aus der Nahrung/von Pflanzen den Magen-Darm-Trakt passieren. Durch die Verwendung eines ex vivo umgestülpten Darmsacks, um den realen physiologischen Zustand zu simulieren, hat eine aktuelle Studie von Luo et al. berichteten, dass exogene pflanzliche miRNAs in Lebensmitteln die Darmbarriere überwinden und in den Blutkreislauf von Schweinen gelangen könnten, obwohl die zugrunde liegenden Mechanismen nicht erforscht waren [170]. Bei Wirbellosen ermöglicht das transmembrane systemische RNA-Interferenz-defekte Protein (SID)-1 den Transport von sRNAs in Zellen außerhalb des Verdauungstrakts in C. elegans [171]. Inzwischen ist SID-2 ein weiteres kürzlich identifiziertes Transmembranprotein in C. elegans. Im Gegensatz zur ubiquitären Expression von SID-1 wird SID-2 in der Darmlumenmembran exprimiert und könnte die Endozytose von sRNAs aus dem Lumen vermitteln [172]. Bemerkenswerterweise existieren in den meisten Vertebraten zwei homologe Proteine ​​von SID-1, nämlich SID-1 Transmembrane Family Member (SIDT)1 und SIDT2, die an der sRNA-Aufnahme beim Menschen beteiligt sein könnten [173, 174].Es wird allgemein angenommen, dass intestinale Epithelzellen (IECs) bei Säugetieren eine kontinuierliche physikalische Barriere bilden, die die Aufnahme von Umwelt-sRNAs stark behindert [175]. Bisherige Beweise definieren zwei mögliche Transportwege durch das Epithel des Verdauungstrakts, entweder transzellulär oder parazellulär. Während des transzellulären Weges könnten miRNAs den Darm passieren über Transzytose oder Proteintransporter. Alternativ könnten einige Vesikel wie Mikrovesikel oder Exosomen auch mit der Epithelzellmembran fusionieren, was den Transport erleichtert. Darüber hinaus hat sich bei Ribonukleoproteinkomplexen, die sRNAs enthalten, gezeigt, dass die Endozytose eine Rolle bei der Aufnahme von sRNAs aus Nahrungsquellen spielt. Ein relevantes Beispiel zeigte, dass mit HDL komplexierte miRNAs nach Interaktion mit dem HDL-Rezeptor-Scavenger-Rezeptor Klasse B Typ I (SRBI) endozytosiert werden können [168]. Andererseits ermöglicht der parazelluläre Weg die Diffusion von Molekülen in den Raum zwischen Epithelzellen. Dieser Transfermodus unterliegt normalerweise einer delikaten Regulierung interzellulärer Tight Junctions [175]. Unterstützend haben Yang et al. [144] schlugen vor, dass Darmverletzungen oder das Mikrobiom innerhalb des GI-Trakts eine Rolle spielen könnten, indem es die Permeabilität des GI-Trakts beeinflusst und die Zufuhr von sRNAs aus der Nahrung in den Kreislauf weiter verbessert. Neben Darmepithelzellen [175] wird der Verdauungstrakt von Säugetieren von einer Vielzahl von Immunzellen besiedelt, die auf der einen Seite sRNAs und andere Moleküle einfangen und auf der anderen freisetzen können, mit oder ohne Bewegung der Zelle ein neuer Standort [176].

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass das aktuelle Modell des miRNAs-Wegs von der Nahrungsquelle zu den Empfängerzellen wie folgt aufgebaut sein kann: Pflanzenmaterialien können durch orale Aktivität mechanistisch zerkleinert und durch verschiedene Enzyme in unserem Mund/Magen teilweise verdaut werden. Während dieser Prozesse werden pflanzliche miRNAs aus zerstörten Zellen freigesetzt und in die Darmepithelzellen transferiert, wo pflanzliche miRNAs selektiv mit Proteinen eingebaut oder in Vesikel verpackt werden könnten. Durch die Darmschleimhaut absorbiert, gelangt miRNAs in den Kreislauf. Einmal an Zielzellen geliefert und eingeschlossen, werden Pflanzen-miRNAs freigesetzt und führen anschließend ihre Funktionen aus.

MiRNAs als neuartige hormonähnliche Botenstoffe

Die oben beschriebenen miRNAs aus der Nahrung/von Pflanzen scheinen hormonähnlich zu wirken. Hormone sind Chemikalien, die von Drüsen abgesondert werden und in den Blutkreislauf gelangen, wo sie zirkulieren, bis sie eine Wirkung auf eine nachgeschaltete Zielzelle ausüben. Sowohl tierische als auch pflanzliche Zellen verwenden Hormone für die Fernkommunikation. Jüngste Erkenntnisse deuten darauf hin, dass zirkulierende miRNAs eine neue Form des Zell-zu-Zell-Kommunikators sind [161, 177]. Dieser Standpunkt spiegelt sich in der Tatsache wider, dass zirkulierende miRNAs von Spenderzellen in den Kreislauf sezerniert, dann stabil in andere Körperteile transportiert und von Empfängerzellen aufgenommen werden [178]. Die Aufdeckung hormonähnlicher Wirkungen von miRNAs in Empfängerzellen hat diese Vorstellung vorangetrieben. Skog et al. zeigten, dass Glioblastom-spezifische Proteine ​​und RNAs (die miR-21 enthalten) in MVs freigesetzt und von normalen Empfängerzellen in funktionelle Signale umgewandelt wurden, um die Proliferation zu stimulieren und die Tumorprogression zu fördern [179]. In einer anderen Studie wurde gezeigt, dass miR-335 Immunantworten während des unidirektionalen Transfers von T-Zellen zu Antigen-präsentierenden Zellen (APC) moduliert [180]. Diese Ergebnisse deuten stark darauf hin, dass sekretierte miRNAs einen neuen Signalweg für den Ferntransport von Botschaften darstellen, durch den Spenderzellen die Genexpression von Empfängerzellen und damit physiologische und pathologische Prozesse beeinflussen können.

Mit der Entdeckung zirkulierender miRNAs in menschlichen Körperflüssigkeiten wird eine kompliziertere Ebene der zellulären Kommunikation und Regulation eingeführt, und es treten Wechselwirkungen zwischen Hormonen und miRNAs auf. Angesichts der Bedeutung von miRNAs und ihrer Beteiligung an verschiedenen biologischen Prozessen überrascht es nicht, dass miRNAs an der Synthese [181, 182] und Sekretion [183] ​​mehrerer Hormone beteiligt sind. Ebenso ist die Expression mehrerer miRNAs wiederum hormonreguliert.

Ein Befund hat die Rolle von miRNAs in der Physiologie der Nebennierenzellen berichtet [184]. Es wurde bestätigt, dass Angiotensin (Ang)II, das Endprodukt des Renin-Angiotensin-Systems, die Expression von miR-21 in menschlichen Nebennierenrindenzellen (H295R) hochreguliert [184]. Bemerkenswerterweise wurde bei der Microarray-Analyse von mehr als 200 miRNAs nur das Expressionsniveau von miR-21 durch Ang II hochreguliert, und seine Überexpression verursachte eine Zunahme der Aldosteronsekretion und Zellproliferation [184]. Eine andere Studie zeigte, dass Hormone miRNAs in den steroidogenen Zellen von Hoden, Eierstöcken und Nebennieren regulieren könnten und das Expressionsniveau von Nebennieren-miRNAs scheint von mehr als einem Hormon reguliert zu werden [185]. Schilddrüsenhormone (TH), von denen bekannt ist, dass sie für die Entwicklung, Differenzierung und Aufrechterhaltung des metabolischen Gleichgewichts bei Säugetieren essentiell sind, könnten die miRNA-Expression verändern, was wiederum die mRNA-Häufigkeit verändern könnte [186]. In Dongs Bericht wurden 40 signifikant veränderte miRNAs in der Leber von hypothyreoten Mäusen nachgewiesen [186]. Die TH-Regulation von miRNAs wurde auch durch neuere Studien zu miR-181d in Leberzellen gestützt [187]. Basierend auf ihren Daten wurden auch zwei neue TH-regulierte Zielgene identifiziert und charakterisiert, die dem miR-181d-Signalweg nachgeschaltet sind, die Homöobox vom kaudalen Typ (CDX)2 und die Sterol-O-Acyltransferase (SOAT)2. Darüber hinaus dürfte die miR181d/CDX2/SOAT2-Kaskade zu dieser TH-abhängigen Veränderung des hepatischen und systemischen Lipidstoffwechsels beitragen [187]. Im Hypothalamus und in der Hypophyse wurden ansteigende miRNAs als Kommunikatoren in Verbindung gebracht, die mit Hormonen interagieren [188,189,190]. Es wurde gezeigt, dass MiR-375 die Expression von Proopiomelanocortin (POMC) hemmt und die Synthese und Sekretion von Hypophysenhormonen beeinflusst [188]. Die Untersuchung von miR-24 hat seine Rolle bei der Kontrolle des Oxytocinspiegels gezeigt, der in den paraventrikulären und supraoptischen Kernen des Hypothalamus produziert wird [189]. Eine andere Studie hat gezeigt, dass miR-361-3p an der sekretorischen Regulation des follikelstimulierenden Hormons (FSH) in der vorderen Hypophysenzelle des Schweins beteiligt ist [190].

Abgesehen vom Crosstalk zwischen Hormonen und miRNAs bei Säugetieren scheinen ihre Interaktionen bei Pflanzen rational zu sein. Das Expressionsniveau von miR159 wurde durch Abscisinsäure (ABA), ein Pflanzenhormon, das an der Knospen- und Samenruhe, dem Wurzelwachstum, der Blattalterung und -abszission, der Öffnung der Spaltöffnungen und dem Stressschutz beteiligt ist, erhöht [191]. Außerdem wurde nachgewiesen, dass miR159, miR319 und miR166 am Stoffwechselweg des Pflanzenhormons Gibberellin beteiligt sind [192,193,194]. Die hormonelle Modulation von miRNAs in Pflanzen wurde im Fall von Auxin veranschaulicht. Um eine normale Entwicklung aufrechtzuerhalten, führte die Änderung der exogenen Auxinspiegel zu Veränderungen der miR168- und miR169-Spiegel [195, 196]. Ein weiteres Beispiel für dieses Szenario sind miR172 und miR319, die bei einer Behandlung mit Cytokinin 6-Benzylaminopurin (6-BA) als herunterreguliert entdeckt wurden [195]. Darüber hinaus haben Liu et al. hat verringerte Werte von miR159 und miR394 beobachtet, wenn sie einer Ethylenbehandlung in Reis unterzogen wurden [195].

Zusammen können miRNAs hormonähnlich wirken, und Hormone und miRNAs werden in beiden Königreichen wechselseitig reguliert. Die Wechselwirkung zwischen den Hormonen und miRNAs kann ein wesentliches Licht darauf werfen, ob Hormone beim Menschen einen Einfluss auf die Ernährung/pflanzliche miRNAs haben und wie die aus der Ernährung/von Pflanzen stammenden miRNAs mit den menschlichen Hormonen koordinieren, um ihre gesamte Funktion zu erfüllen.


MicroRNAs als Biomarker von Krankheiten

Die neuere Literatur zu Biomarkern hat sich auf die zahlreichen Eigenschaften von miRNAs als potenzielle und spezifische Biomarker für verschiedene Krankheiten konzentriert, darunter rheumatoide Arthritis (61) und Krebs (62). Studien haben gezeigt, dass etwa 50 % aller Gene durch miRNAs reguliert werden, was die Bedeutung des Verständnisses ihrer Beteiligung an Krankheiten weiter unterstreicht (63). Daher werden miRNAs als eine der wichtigsten und am häufigsten vorkommenden Gruppen von Translationsregulatoren eingestuft (64). Laut miRbase Version 18 gibt es 1921 miRNAs beim Menschen (65). Da die meisten miRNAs in Zellen und Geweben identifiziert wurden, ist es nun möglich, Expressionsstudien in GvHD-Proben durchzuführen, um eine miRNA-Signatur für die Krankheit zu entwickeln.

Wie bereits erwähnt, sind miRNAs nicht nur reichlich vorhanden, sondern aufgrund ihrer Nukleasenresistenz auch sehr stabil (66). Diese Tatsache macht Expressionsstudien mit Formalin-fixierten Paraffin-eingebetteten (FFPE) Proben (67) und Speichelproben möglich (68). Da die meisten Forschungsinstitute über Archive von Patientenproben verfügen, steht eine beträchtliche Anzahl relevanter Patientenmaterialien (Serum, Plasma, FFPE, Urin) für Untersuchungen zur Entdeckung von Biomarkern zur Verfügung. Studien haben auch gezeigt, dass es eine Korrelation zwischen Serum- und Biopsie-miRNA-Profilen in einer Reihe von Krebsstudien gibt, die von Alevizos und Illei überprüft wurden (61). Mitchellet al. (69) haben gezeigt, dass zirkulierende miRNAs in Plasma und Serum stabil sind und ihre Messungen miteinander korrelieren. Dieses Ergebnis stärkt die Hypothese, dass miRNAs aus Tumoren in das Blut transloziert werden und daher die Messung von miRNAs aus Plasma oder Serum als Krebsbiomarker dienen kann (69). Die Verfügbarkeit potenzieller miRNAs zur Kreislaufdiagnostik (61) könnte den Bedarf an invasiven Methoden wie Hautbiopsien zur Diagnose von GvHD bei Allo-HSCT-Patienten reduzieren und die Krankheitsüberwachung unterstützen. Darüber hinaus werden miRNAs unter bestimmten Bedingungen exprimiert, die für den physiologischen und pathologischen Zustand der Krankheit, wie beispielsweise rheumatische Erkrankungen, repräsentativ sein können (61). Es wurde gezeigt, dass MicroRNAs funktionell einzigartige Zell- oder Organexpressionsmuster aufweisen (27). Zum Beispiel ist miR-1 eine herzspezifische miRNA (70), während miR-122 hauptsächlich in der Leber exprimiert wird (71). Da miRNA-Expressionsmuster krankheitsspezifisch sind, ist eine Unterscheidung zwischen normalen, entzündeten und geschädigten Organen möglich (72). MicroRNA-Muster, die bereits bei systemischem Lupus erythematodes und anderen systemischen Autoimmunerkrankungen etabliert wurden, können zum Verständnis der Pathogenese der cGVHD nützlich sein (73).

Obwohl ein einzelner prognostischer Marker klinisch nützlich sein kann, wäre eine Reihe validierter Marker, die zusätzlich zu klinischen Faktoren Informationen über Überleben, Krankheitsverlauf und das Ansprechen des Patienten auf die Behandlung liefern können, von Vorteil. Somit könnte die Identifizierung eines charakteristischen miRNA-Profils für GVHD sowohl als prognostischer Biomarker der Krankheit dienen als auch zum weiteren Verständnis der Komplexität der Krankheitsbiologie beitragen. Spezifische Biomarker können auch bei der Entwicklung neuer Therapien und wirksamerer Medikamente zur Behandlung der GvHD helfen.


MiRNAs in AML: Hintergrund

AML ist eine heterogene Erkrankung, die durch die erhöhte Proliferation und das Überleben von unreifen myeloischen Zellen gekennzeichnet ist und das Ergebnis einer Reihe genetischer Anomalien, einschließlich Mutationen und Chromosomenumlagerungen, ist. 5 Frühe Studien zur Charakterisierung der Rolle von miRNAs bei AML konzentrierten sich auf die Identifizierung von AML-spezifischen miRNA-Expressionsmustern. Ausgeprägte miRNA-Profile wurden für viele zytogenetische Subtypen von AML, 6-8, sowie für mehrere spezifische Mutationen bei zytogenetisch normaler AML identifiziert, einschließlich Mutationen in NPM1, FLT3, und CEBPA. 9-13 miRNA-Expressionsprofile korrelieren ebenfalls mit der Prognose, 12,14 was die potenzielle Bedeutung von miRNAs bei dieser Krankheit unterstreicht. Obwohl miRNAs an Leukämie-assoziierten genomischen Veränderungen angereichert sind, werden jedoch nur ∼100 über dem Hintergrundniveau exprimiert, 15 was darauf hindeutet, dass nur eine Untergruppe von miRNAs funktionelle Wirkungen bei AML hat.

Abgesehen von fehlregulierten miRNA-Expressionsprofilen ist es mittlerweile allgemein anerkannt, dass miRNAs bei vielen Subtypen der AML entweder als oncomiRs oder als Tumorsuppressoren fungieren können und ein breites Spektrum leukämischer Prozesse beeinflussen, einschließlich Proliferation, Überleben, Differenzierung, Selbsterneuerung, epigenetische Regulation, in in vivo Krankheitsprogression und Chemotherapieresistenz 8,15-57 (Tabelle 1). miRNAs beeinflussen die Entwicklung und das Fortschreiten der Leukämie durch die Zusammenarbeit mit bekannten Onkogenen oder Tumorsuppressoren, entweder indem sie diese direkt auf der mRNA-Ebene angreifen oder gemeinsam mit diesen Proteinen die Malignität fördern. Um diese Konzepte zu veranschaulichen, haben wir in Tabelle 1 die Ergebnisse ausgewählter miRNAs zusammengefasst, die durchweg eine Rolle bei AML spielen, und wir diskutieren einige der neueren Aspekte der miRNA-Biologie bei AML unten, da ein besseres Verständnis der miRNA-Biologie mehr ermöglichen wird strategisches Design von Therapien in der Zukunft.

Ausgewählte miRNAs, die an der AML-Pathogenese beteiligt sind

miRNA. Ausdruck ändern. Mechanismus der Dysregulation. Bestätigte Ziele. Funktionelle Wirkung des Ausdrucks . Verweise .
OncomiR . Tumorsuppressor.
miR-9 ↑ MLL-rearrangierte AML, ↓ t(821), ↓ EVI1-induzierte AML Promotor, der von MLL-Fusionsproteinen angesteuert wird EVI1 hypermethyliert Promotor RHOH, RYBP, HMGA2, LIN28B, FOXO1, FOXO3↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↑ Leukemogenese bei Mäusen (MLL neu geordnet) ↓ Proliferation, ↑ Monozytendifferenzierung (t(821) und EVI1+) 16-18
miR-17-92-Cluster ↑ In LSCs bei MLL-assoziierter AML Aktiviert durch MYC epigenetisch aktiviert durch MLL-Fusionsproteine ​​genomische Amplifikation in MLL-rearrangierter AML P21↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Selbsterneuerung, ↑ Fähigkeit zur Koloniebildung, ↑ Leukemogenese bei Mäusen 19, 20
miR-22 ↑ MDS/MDS-abgeleitete AML, ↓ de novo AML Herunterreguliert über TET1/GFI1/EZH2/SIN3A-vermittelte epigenetische Repression und DNA-Kopienzahlverlust erhöht mit Verlust von PU.1 TET2, CRTC1, FLT3, MYCBP↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Selbsterneuerung, Überexpression führt zu myeloischer Malignität bei Mäusen (MDS/MDS-derived AML) ↓ AML-Blastenzellwachstum, ↑ Differenzierung, ↓ leukämisches Fortschreiten bei Mäusen (de novo AML) 21-23
miR-29b ↓ Verschiedene Subtypen von AML Herunterreguliert durch Verlust von CEBPA Chromosom 7q Deletionen MYC reprimiert NF-kB reprimiert MCL-1, CXXC6, CDK6, AKT2, CCND2, SP1, DNMT3A, DNMT3B ↓ Zellwachstum, ↑ Apoptose, ↓ leukämisches Fortschreiten in vivo, ↓ KIT-Aktivierung, verhindert globale DNA-Hypermethylierung 24-27, 56
miR-125b ↑ t(211)(p21q23) AML, ↑ MDS/MDS-abgeleitete AML, ↑ pädiatrische AML Erhöht um t(211)(p21q23)-Translokation LIN28A, IRF4↑ Proliferation, ↑ Produktion myeloischer Vorläufer, ↑ Selbsterneuerung, Überexpression führt bei Mäusen zu AML 28-32
miR-126 ↑ t(821) AML, ↑ in LSCs von CN-AML Promotor demethyliert in t(821) AML PLK2, ADAM9, SORTE, GOLPH3, CDK3, TOM1, ERRFI1, SPRED1, FZD7↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Fähigkeit zur Koloniebildung, ↑ LSC-Erhaltung und Selbsterneuerung, ↓ Zellzyklus, ↑ Ruhe, ↑ Chemotherapieresistenz 8, 33-36
miR-146a ↓ Verschiedene Subtypen der AML, ↓ 5q-Syndrom MDS/MDS-abgeleitete AML Löschung in del(5q) MDS/MDS-abgeleiteter AML TRAF6, IRAK1, TIRAP ↓ Proliferation, ↓ Überleben, ↓ NF-kB-Aktivierung, Deletion führt zu Myeloproliferation bei Mäusen 15, 37-41
miR-155 ↑ CN-AML (höchste in FLT3-ITD + AML) Zielgerichtet durch STAT5 und NF-kB in FLT3-ITD + AML hochreguliert durch MLL-Fusionsgene über MEIS1 CEBPB, SCHIFF1, VPE.1↑ Proliferation, ↑ Überleben, Überexpression führt zu myeloproliferativem Neoplasma bei Mäusen, verleiht negative Prognose bei CN-AML, keine Wirkung im MLL-AF9-Mausmodell der Leukämie 42-46
miR-193a ↓ Verschiedene Subtypen von AML (niedrigste in t(821) AML) Epigenetisch zum Schweigen gebracht durch AML1/ETO AML1/ETO, DNMT3A, HDAC3, KIT, CCND1, MDM2 ↓ Zellwachstum, ↑ Apoptose, ↑ Differenzierung, ↓ Zellzyklus, ↓ KIT-Expression 47, 48
miR-196b ↑ MLL-assoziierte AML Aktiviert durch MLL-Fusionsproteine, die mit co-exprimiert werden HOXA9 bei MLL-rearrangierter Leukämie HOXA9, MEIS1, FAS↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↓ Replating-Potenzial, ↑ MLL-AF9-induzierte leukämische Progression bei Mäusen 49, 50
miR-223 ↓ t(821) AML, ↓ verschiedene Subtypen von AML Gezielt durch die Transkriptionsfaktoren CEBPA (aktiviert) und E2F1 (reprimiert) epigenetisch zum Schweigen gebracht durch AML1/ETO E2F1, MEF2C, FBXW7 ↓ Proliferation, ↑ Apoptose, ↑ Differenzierung/Granulopoese 51-54
miRNA. Ausdruck ändern. Mechanismus der Dysregulation. Bestätigte Ziele. Funktionelle Wirkung des Ausdrucks . Verweise .
OncomiR . Tumorsuppressor.
miR-9 ↑ MLL-rearrangierte AML, ↓ t(821), ↓ EVI1-induzierte AML Promotor, der von MLL-Fusionsproteinen angesteuert wird EVI1 hypermethyliert Promotor RHOH, RYBP, HMGA2, LIN28B, FOXO1, FOXO3↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↑ Leukemogenese bei Mäusen (MLL neu geordnet) ↓ Proliferation, ↑ Monozytendifferenzierung (t(821) und EVI1+) 16-18
miR-17-92-Cluster ↑ In LSCs bei MLL-assoziierter AML Aktiviert durch MYC epigenetisch aktiviert durch MLL-Fusionsproteine ​​genomische Amplifikation in MLL-rearrangierter AML P21↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Selbsterneuerung, ↑ Fähigkeit zur Koloniebildung, ↑ Leukemogenese bei Mäusen 19, 20
miR-22 ↑ MDS/MDS-abgeleitete AML, ↓ de novo AML Herunterreguliert über TET1/GFI1/EZH2/SIN3A-vermittelte epigenetische Repression und DNA-Kopienzahlverlust erhöht mit Verlust von PU.1 TET2, CRTC1, FLT3, MYCBP↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Selbsterneuerung, Überexpression führt zu myeloischer Malignität bei Mäusen (MDS/MDS-derived AML) ↓ AML-Blastenzellwachstum, ↑ Differenzierung, ↓ leukämisches Fortschreiten bei Mäusen (de novo AML) 21-23
miR-29b ↓ Verschiedene Subtypen von AML Herunterreguliert durch Verlust von CEBPA Chromosom 7q Deletionen MYC reprimiert NF-kB reprimiert MCL-1, CXXC6, CDK6, AKT2, CCND2, SP1, DNMT3A, DNMT3B ↓ Zellwachstum, ↑ Apoptose, ↓ leukämische Progression in vivo, ↓ KIT-Aktivierung, verhindert globale DNA-Hypermethylierung 24-27, 56
miR-125b ↑ t(211)(p21q23) AML, ↑ MDS/MDS-abgeleitete AML, ↑ pädiatrische AML Erhöht um t(211)(p21q23)-Translokation LIN28A, IRF4↑ Proliferation, ↑ Produktion myeloischer Vorläufer, ↑ Selbsterneuerung, Überexpression führt bei Mäusen zu AML 28-32
miR-126 ↑ t(821) AML, ↑ in LSCs von CN-AML Promotor demethyliert in t(821) AML PLK2, ADAM9, SORTE, GOLPH3, CDK3, TOM1, ERRFI1, SPRED1, FZD7↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↑ Fähigkeit zur Koloniebildung, ↑ LSC-Erhaltung und Selbsterneuerung, ↓ Zellzyklus, ↑ Ruhe, ↑ Chemotherapieresistenz 8, 33-36
miR-146a ↓ Verschiedene Subtypen der AML, ↓ 5q-Syndrom MDS/MDS-abgeleitete AML Löschung in del(5q) MDS/MDS-abgeleiteter AML TRAF6, IRAK1, TIRAP ↓ Proliferation, ↓ Überleben, ↓ NF-kB-Aktivierung, Deletion führt zu Myeloproliferation bei Mäusen 15, 37-41
miR-155 ↑ CN-AML (höchste in FLT3-ITD + AML) Zielgerichtet durch STAT5 und NF-kB in FLT3-ITD + AML hochreguliert durch MLL-Fusionsgene über MEIS1 CEBPB, SCHIFF1, VPE.1↑ Proliferation, ↑ Überleben, Überexpression führt zu myeloproliferativem Neoplasma bei Mäusen, verleiht negative Prognose bei CN-AML, keine Wirkung im MLL-AF9-Mausmodell der Leukämie 42-46
miR-193a ↓ Verschiedene Subtypen von AML (niedrigste in t(821) AML) Epigenetisch zum Schweigen gebracht durch AML1/ETO AML1/ETO, DNMT3A, HDAC3, KIT, CCND1, MDM2 ↓ Zellwachstum, ↑ Apoptose, ↑ Differenzierung, ↓ Zellzyklus, ↓ KIT-Expression 47, 48
miR-196b ↑ MLL-assoziierte AML Aktiviert durch MLL-Fusionsproteine, die mit co-exprimiert werden HOXA9 bei MLL-rearrangierter Leukämie HOXA9, MEIS1, FAS↑ Proliferation, ↑ Überleben, ↓ Differenzierung, ↓ Replating-Potenzial, ↑ MLL-AF9-induzierte leukämische Progression bei Mäusen 49, 50
miR-223 ↓ t(821) AML, ↓ verschiedene Subtypen von AML Gezielt durch die Transkriptionsfaktoren CEBPA (aktiviert) und E2F1 (reprimiert) epigenetisch zum Schweigen gebracht durch AML1/ETO E2F1, MEF2C, FBXW7 ↓ Proliferation, ↑ Apoptose, ↑ Differenzierung/Granulopoese 51-54

Die Tabelle stellt ausgewählte miRNAs dar, die an der AML-Krankheitsprogression beteiligt sind, mit einem Schwerpunkt auf miRNAs mit klinischen Nachweisen einer Fehlregulation sowie in vivo und in vitro funktionellen Nachweisen einer Rolle bei der Leukemogenese.

CN, zytogenetisch normales LSC, leukämische Stammzelle.


5 ALTERNATIVE VERWENDUNG DES MIRNA-STRANGS BEI MENSCHLICHEN KRANKHEITEN

Die Fähigkeit von Zellen, die miRNA-Armpräferenz zu ändern, wird auch in Fällen von physiologischen oder pathogenen Zuständen deutlich, was die Idee weiter unterstützt, dass die miRNA-Strangauswahl ein regulierter Prozess ist. Es wurde auch beobachtet, dass Umweltfaktoren die Auswahl des miRNA-Strangs beeinflussen. In menschlichen Zellen wurde gezeigt, dass DNA-Schäden Veränderungen in der Expression von miRNAs fördern (Dickey, Zemp, Martin & Kovalchuk, 2011), und es gibt Hinweise darauf, dass DNA-Schäden die Strangauswahl bestimmter miRNAs beeinflussen (Tarasov et al. , 2016). In einem anderen Beispiel, Drosophila Ethanolexposition führt zur Akkumulation bestimmter miR-Passagierstränge (Ghezzi, Zomeno, Pietrzykowski & Atkinson, 2016). Da die Ethanolexposition Veränderungen der 5p/3p-Verhältnisse bestimmter miRNAs fördert, ist es möglich, dass die Deregulierung der miRNA-Strangselektion bei Alkoholmissbrauchsstörungen eine Rolle spielen könnte (Ghezzi et al., 2016). Es sind jedoch zusätzliche Arbeiten erforderlich, um festzustellen, ob diese veränderten 5p/3p-Verhältnisse aus Änderungen der miRNA-Strangselektion resultieren. Während Veränderungen in der Häufigkeit von miRNA-Strangen aus mehreren verschiedenen Mechanismen resultieren können, schlagen wir vor, dass eine veränderte Auswahl von miRNA-Strangen wahrscheinlich ein Hauptmechanismus ist, der zum miRNA-Armwechsel führt (Abbildung 5).

Es gibt viele Beispiele und mehrere berichtete Mechanismen, durch die eine Deregulierung der miRNA-Strangselektion mit einer menschlichen Krankheit in Verbindung gebracht wird. Während unter Wildtyp-Bedingungen die meisten miRNAs einen dominant exprimierten miRNA-Strang aufweisen (Abbildung 6a), unterliegen zahlreiche miRNAs einem Arm-Switching bei Krebserkrankungen (Chen et al., 2018). Krebszellen ohne BRCA1 (Brustkrebs 1) und BAP1 (BRCA1-assoziiertes Protein), denen die homologe Rekombination fehlt, exprimieren anomal hohe Spiegel von miR-223* (5p) (Srinivasan et al., 2019 Abbildung 6b, Tabelle 1) . miR-223 (3p) zielt direkt auf Komponenten des nichthomologen End-Joining (NHEJ)-Pfads ab. Die Verringerung der miR-223 (3p)-Abundanz und die Erhöhung der miR-223* (5p)-Stabilität wird vorgeschlagen, um NHEJ zu dereprimieren und die Zellproliferation zu ermöglichen (Srinivasan et al., 2019). Konsequenterweise ist die Wiederherstellung von miR-223 (3p) in BRCA1-BAP1-defizienten Krebszellen synthetisch tödlich, wahrscheinlich aufgrund der Repression von NHEJ-Komponenten (Srinivasan et al., 2019). In ähnlicher Weise scheint der Strangbias von miR-193a in Brustkrebszelllinien sowie in Patientengeweben verändert zu sein (Tsai et al., 2016). Beim Menschen produziert der miR-193a-Locus zwei nahezu gleich häufige miRNAs: miR-193a-5p und miR-193-3p. Die Häufigkeit von miR-193a-5p, nicht jedoch von miR-193-3p, ist bei Brustkrebs signifikant verringert und wird vermutlich auf die reduzierte Verfügbarkeit von miR-193a-5p-Zielen zurückgeführt (Tsai et al., 2016).

Krankheit miRNA Strangüberfluss Referenz
miR miR*
Brustkrebs miR-223 Sririvasan et al., 2019
miR-193a a a miR-193-5p ist erniedrigt (beide Arme sehr häufig).
n / A Tsai et al., 2016
miR-24-2 = Martin et al., 2012
Papilläres Schilddrüsenkarzinom miR-146a n / A isomiRs Jazdzewski et al., 2009
Multiple Sklerose miR-155 Mycko, Cichalewska, Cwiklinska & Selmaj, 2015
Lungenkrebs miR-144 Song et al., 2018
miR-193b Choi, Shin, Lee, Ji & Kim, 2019
Magenkrebs miR-574 Zhang et al., 2019
Plattenepithelkarzinom miR-21 Ge, Zhang, Nikolova, Reva & Fuchs, 2015
Vorhofflimmern miR-133 Ohanian et al., 2013
Glioblastom miR-324 Kim et al., 2020
  • Abkürzungen: =, unverändert n/a, nicht bewertet.
  • a miR-193-5p ist erniedrigt (beide Arme sehr häufig).

Die Expression von miR-144* (5p) ist bei nichtkleinzelligem Lungenkrebs (NSCLC) herunterreguliert (Song et al., 2018), (Tabelle 1). miR-144* (5p) zielt direkt auf ATF2 ab, und es ist möglich, dass erhöhte ATF2-Spiegel bei reduzierter miR-144* (5p)-Aktivität zum Fortschreiten des NSCLC beitragen (Song et al., 2018). In einem anderen Beispiel werden sowohl miR-193b (3p) als auch miR-193b* (5p) bei Lungenkrebs herunterreguliert und die Wiederherstellung der Spiegel beider Stränge unterdrückt bösartige Phänotypen, einschließlich metastasierendem Potenzial und Zellproliferation (Choi et al., 2019). (Tabelle 1). Beide Stränge scheinen auf Cyclin-D (CCND1), Ajuba LIM-Protein (AJUBA) und Herzentwicklungsprotein mit EGF-ähnlichen Domänen (HEG1) abzuzielen, und das Herunterbrechen dieser Zielphänokopien stellte die miR-193b-Spiegel wieder her (Choi et al., 2019). miR-574* (5p) ist onkogen bei Darmkrebs, NSCLC und PTC (Cui, Tang, Chen & Wang, 2014 Ji et al., 2012 Ma et al., 2016 X. Wang, Lu, Geng, Yang, & Shi, 2017 Zhou et al., 2015 Zhou et al., 2016), während miR-574 (3p) bei Brustkrebs und Leukämie tumorsuppressiv wirkt (Chiyomaru et al., 2013 Ujihira et al., 2015 Xu et al. , 2020 Yao, Wu, Lindner & Fox, 2017). Bei Magenkrebs sind beide Arme von miR-574, miR-219 und miR-369 leicht nachweisbar (Zhang et al., 2019), (Tabelle 1). Eine hohe Expression von miR-574* (5p) ist mit fortgeschrittenen Magenkrebsstadien verbunden (Zhang et al., 2019). Die Überexpression von miR-574*(5p) verstärkt die Zellproliferation, während die Expression von miR-574 (3p) die Proliferation unterdrückt. miR-574* (5p) zielt auf QKI6 (Quaking), während miR-574-3p auf ACVR1B (Activin-Rezeptor-Typ-1) abzielt und die Erschöpfung der Zielphänokopie eines miRNA-Strangs den Verlust des anderen miRNA-Strangs in Magenkrebszellen verursacht (Zhang et al., 2019). Interessanterweise überlappen sich über ein Drittel der Gene, die durch miR-574-3p und miR-574-5p reguliert werden, was darauf hindeutet, dass, obwohl jeder Strang eine einzigartige Samensequenz enthält, es wesentliche gemeinsame Ziele der beiden Stränge geben kann (Zhang et al. , 2019).

Beim Plattenepithelkarzinom sind sowohl miR-21 (5p) als auch miR-21* (3p) hochreguliert und jeweils für das Überleben der Zellen erforderlich (Ge et al., 2015 Abbildung 6c, Tabelle 1). Die Onkogenität von miR-21* (3p) wird über sein Zielgen Phosphatase und Aktinregulator 4 vermittelt (PPACTR4 Ge et al., 2015). miR-21* (3p) Herunterregulierung von PPACTR4 scheint die Aktivität der Proteinphosphatase 1 (PP1) zu verringern, was zu einer erhöhten Phosphorylierung und Inaktivierung des Tumorsuppressors Rb/E2F (Retinoblastom/E2-Transkriptionsfaktor) führt, was letztendlich zur Tumorentstehung führt (Ge et al. , 2015 Ohanian et al., 2013). In einem anderen Beispiel führt eine einzelne Punktmutation (U–C), die den relativen TS des menschlichen miR-133a-Duplex beeinflusst, zu veränderten 5p/3p-Verhältnissen von miR-133a und ist vermutlich durch Auswirkungen auf das mRNA-Targeting mit Vorhofflimmern verbunden (Ohanian et al., 2013 Abbildung 6d).

Kürzlich wurde gezeigt, dass die Uridylierung von miR-324 durch TUT-4/7 den Armwechsel von miR-324 direkt beeinflusst (Kim et al., 2020, Abbildung 4c, Tabelle 1). TUT-4/7 uridylat den 3p-Arm von miR-324, was zur Selektion des miR-324* (3p)-Strangs anstelle des miR-324 (5p)-Strangs führt. Interessanterweise sind TUT-4/7 beim Glioblastom hochreguliert und der miR-324-Armwechsel scheint mit einer schlechten Prognose zu korrelieren (Kim et al., 2020). Zusammengenommen zeigen diese Daten, dass die miRNA-Strangselektion stark reguliert werden kann und Veränderungen dieses normalerweise robusten Prozesses dramatische Folgen haben können und bei menschlichen Krankheiten weit verbreitet sind.


Werden microRNAs vom gleichen DNA-Strang wie ihre Eltern-Messenger-RNAs transkribiert? - Biologie

Abbildung 1. Das zentrale Dogma der Molekularbiologie.

Das zentrale Dogma der Molekularbiologie

James Crick (Mitbegründer der Sekundärstruktur der DNA) schlug vor, dass DNA ein Informationsspeichermolekül ist, das sich selbst replizieren kann. Darüber hinaus schlug er vor, dass die übertragenen Informationen von einem produzierenden Körper innerhalb der Zelle „gelesen“ werden müssten, der Aminosäuren in einer bestimmten Sequenz zusammenfügt, um schließlich ein Protein zu synthetisieren. Dies wurde bekannt als die zentrales Dogma der Molekularbiologie.

Das zentrale Dogma sagt voraus, dass DNA als Matrize für die direkte Synthese eines Boten-RNA-Moleküls (mRNA) dient, in einem Prozess, der als . bekannt ist Transkription. Zweitens wird mRNA an einem Ribosom durch Transfer-RNAs (tRNAs) „gelesen“, die zusammenarbeiten, um eine spezifische Kette von Aminosäuren aufzubauen, die sich kollektiv zu einem Protein zusammenfügen, ein Prozess, der als . bekannt ist Übersetzung.

Figur 2. Retroviren stellen eine Ausnahme vom zentralen Dogma dar.

Messenger-RNA ist nur eine von sieben verschiedenen Arten von RNA. Einige sind auch an der Proteinsynthese beteiligt (wie Transfer-RNA). Und DNA kodiert direkt für diese RNA-Moleküle. Der Informationsfluss wäre in diesem Fall also einfach von DNA zu RNA. Die andere große Ausnahme von diesem Dogma ist, dass der Informationsfluss umgekehrt ist. Manche Viren haben zum Beispiel Gene, die aus DNA bestehen. Wenn diese Viren eine Zelle infizieren, synthetisiert die virale RNA DNA. Auf diese Weise würde der Informationsfluss von RNA zu DNA erfolgen. Aber auch wenn es Ausnahmen vom Dogma gibt, umfasst das zentrale Dogma der Molekularbiologie den wichtigsten Informationsfluss für das Leben. DNA kodiert für RNA und diese RNA kodiert Proteine.

RNA-Replikation ist das Kopieren einer RNA auf eine andere. Viele Viren vermehren sich auf diese Weise. Die Enzyme, die RNA in neue RNA kopieren, sogenannte RNA-abhängige RNA-Polymerasen, kommen auch in vielen Eukaryoten vor, wo sie an der RNA-Stummschaltung beteiligt sind. Auch das RNA-Editing, bei dem eine RNA-Sequenz durch einen Komplex aus Proteinen und einer "Leit-RNA" verändert wird, könnte als RNA-zu-RNA-Transfer angesehen werden.

Sobald die Biologen das Dogma verstanden hatten, verstanden sie das allgemeine Muster des Informationsflusses in der Zelle. Die nächste Herausforderung bestand darin zu verstehen, wie die Basensequenz in einem Messenger-RNA-Strang für die Aminosäuresequenz in einem Protein kodiert. Was ist der genetische Code? Welche Regeln bestimmen die Beziehung zwischen der Nukleotidsequenz in der DNA und der Aminosäuresequenz in einem Protein? George Gamow schlug einen Code vor, der auf Logik basiert. Er schlug vor, dass jedes Codewort drei Basen enthält. Seine Argumentation basierte auf der Beobachtung, dass es 20 Aminosäuren gibt.

Da es in der DNA nur vier einzigartige Nukleotide und 20 Aminosäuren gibt, war eine Kombination von Basenpaaren erforderlich, um die Aminosäuren zu kodieren. Wenn eine Aminosäure auf einem einzigen Nukleotid basiert, gäbe es nur vier Aminosäuren. Mit derselben Logik vermutete Gamow, dass der Code nicht durch eine Kombination von zwei Nukleotiden dargestellt werden könnte, da 4x4 16 ist und es 20 Aminosäuren gibt. Der Code muss ein Drei-Basen-Code (oder Triplett-Code) sein, da er der einfachste Code ist, der die 20 bekannten Aminosäuren zulässt: 4 x 4 x 4 = 64. Dies legt nahe, dass es bis zu 64 einzigartige Aminosäuren geben könnte. Allerdings gibt es nur 20 Aminosäuren.

Figur 3. Der genetische Code. Die Triplett-Code-mRNA kodiert direkt für den Zusammenbau von Aminosäuren, aus denen ein Protein besteht. Um die von der mRNA-Sequenz codierte Aminosäure zu identifizieren, suchen Sie den mRNA-Triplett-Code (Codon), das graue Kästchen rechts davon steht für die entsprechende Aminosäure. CCC bezeichnet beispielsweise die Aminosäure Prolin (Pro).

Es gibt weit mehr Möglichkeiten von Aminosäuren, die durch einen Triplett-Code bereitgestellt werden, als die Anzahl der Aminosäuren (20), die wir in der Natur sehen. Daher wird gesagt, dass der Code ist redundant, Das bedeutet, dass Aminosäuren durch mehr als einen Triplett-Code kodiert werden können. Zum Beispiel kodieren die Triplett-Codes von CCU und CCC von mRNA für dieselbe Aminosäure: Prolin. Tatsächlich werden alle Aminosäuren von mehr als einem Triplett-Code kodiert, außer Methionin und Tryptophan. Weitere Untersuchungen zeigten, dass ein spezifischer Triplettcode immer für dieselbe Aminosäure kodierte. Mit anderen Worten, der Code ist eindeutig. Beispielsweise kodiert der Triplett-Code von AUG in mRNA immer für Methionin. Erstaunlicherweise funktioniert der Code für alle lebenden Organismen, von Bakterien bis hin zu Pflanzen und Tieren, genau gleich! Obwohl es nur sehr wenige Ausnahmen gibt, deutet die Konsistenz des Codes über sehr variable Organismen hinweg darauf hin, dass wir alle von einem einzigen gemeinsamen Vorfahren abstammen. Der Code ist Universal. Schließlich ist der Code konservativ. Wenn die ersten beiden Basenpaare der mRNA gleich sind, das dritte jedoch unterschiedlich ist, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit (aber keine absolute Sicherheit), dass sie für dieselbe Aminosäure kodiert.

Die Gruppe der drei Basen, aus denen eine bestimmte Aminosäure besteht, wird als a . bezeichnet codon. Und nach der Triplett-Hypothese von Gamow besteht jedes Codon aus drei Nukleotiden. Und jedes Gen wird durch ein Startcodon und ein Stopcodon definiert. Das Startcodon wurde identifiziert, und es ist das gleiche Startcodon für jedes einzelne Gen jedes einzelnen Organismus auf der Erde. Im Gegensatz dazu gibt es drei Stoppcodons.

Figur 4. Vorhersage von Polypeptidketten aus DNA. In diesem Beispiel ist der DNA-Matrizenstrang (der Strang, der in RNA transkribiert): 3' – TAC GTC TAG TCC ATC – 5'. Dieser wird in den mRNA-Strang transkribiert: 5' - AUG CAG AUC AGG UAG-3'. Anhand der Aminosäuretabelle (Abb. 4) können wir die Aminosäuresequenz für dieses Protein vorhersagen: Methionin (START CODON)-Glutaminsäure-Isoleucin-Arginin-STOP.

Vorhersage von Proteinen aus DNA

Nachdem der Code entschlüsselt wurde, kann jede DNA-Sequenz gelesen werden, um die Sequenz von Aminosäuren oder einer Polypeptidkette zu bestimmen (Abb. 4). Bei Eukaryoten besteht die DNA aus vielen Chromosomen. Jedes Chromosom besteht aus mehreren Genen (zusammen mit anderen nicht-transkribierenden Regionen). Jedes Gen synthetisiert eine mRNA, die dann in ein Protein transkribiert wird. Für den DNA-Abschnitt, aus dem ein Gen besteht, synthetisiert nur ein Strang die mRNA, die als bekannt ist Vorlage stehen. Der andere DNA-Strang, der keine mRNA synthetisiert, wird als bezeichnet Nicht-Vorlagen-Strang, oder häufiger die codierender Strang. Der Anfang eines Gens wird durch die drei Basen des Template-Strangs TAC definiert, der in die Startcodon, AUG. Soweit wir wissen, haben alle lebenden Organismen für jedes erzeugte Protein das gleiche Startcodon. Die nächsten drei Desoxyribonukleinsäuren werden in das nächste Codon transkribiert. In 4 werden die Desoxyribonukleinsäuren (GTC) in das mRNA-Codon (CAG) transkribiert, das schließlich in die Aminosäure Glutaminsäure übersetzt wird. Wiederholen Sie diese Sequenz, bis Sie eines der drei STOP-Codons erreichen, das, wie Sie unten sehen werden, keine Aminosäure kodiert. Vielmehr kodiert es für einen Terminationsfaktor, der den Translationsprozess beendet, was zu einem Protein führt.

Abbildung 5. Punktmutationen. Punktmutationen sind eine Veränderung eines einzelnen Desoxyribonukleotids, die während einer Fehlpaarung während der DNA-Replikation auftritt. Punktmutationen können das letztendliche Protein beeinflussen, indem sie eine Aminosäure in der Polypeptidkette verändern.

Mutationen sind dauerhafte Veränderungen in der DNA eines Organismus, eine Veränderung im Informationsarchiv der Zelle. Mutationen sind in der Evolution wichtig, weil sie der einzige bekannte Mechanismus sind, der tatsächlich neue Allele erzeugt. Neue Allele können unterschiedliche Proteine ​​und folglich unterschiedliche zelluläre Funktionalitäten erzeugen und als Ursprung der Biodiversität dienen. Mutationen können entweder die Fitness, die Fähigkeit eines Organismus zu überleben und sich fortzupflanzen oder nicht. Mutationen zur Steigerung der Fitness werden als bezeichnet vorteilhaft, während diejenigen, die die Fitness beeinträchtigen, als bezeichnet werden schädlich. Mutationen, die keinen Einfluss auf die Fitness eines Organismus haben, werden als . bezeichnet Leise Mutationen. Die meisten Mutationen sind neutral oder leicht schädlich. Mutationen lassen sich in zwei Kategorien einteilen. Punktmutationen sind, wenn sich ein einzelnes Nukleotid ändert und Mutationen auf Chromosomenebene mit der Hinzufügung, Deletion oder Modifikation von Chromosomen auftreten.

Abbildung 6. Genotypen bestimmen Phänotypen. Eine Veränderung eines einzelnen Desoxyribonukleotids kann die Sequenz von Aminosäuren verändern, was sich auf den Phänotyp des Organismus auswirken kann.

Punktmutationen treten auf, wenn der Korrekturlesemechanismus der DNA (DNA-Polymerase) ein nicht übereinstimmendes Basenpaar vor dem Abschluss der DNA-Replikation, dem Prozess, bei dem sich die DNA selbst kopiert, nicht korrigiert. Dies führt zu einem einzigen Basenwechsel in einem der neu synthetisierten DNA-Stränge (Abb. 5). Es gibt zwei resultierende Konsequenzen von Punktmutationen. Punktmutationen, die zu einer Veränderung der Aminosäuresequenz führen, werden als Ersatzmutationen oder Missense-Mutationen (Abb. 6). Eine Veränderung der Aminosäure kann (und tut es oft) die Funktionalität des Proteins, für das sie kodiert, verändern, was die Fitness des Organismus verändern kann: entweder positiv, negativ oder gar nicht. Wohingegen, stille Mutationen sind Punktänderungen, die die Aminosäuresequenz nicht verändern, weil die DNA eine mRNA transkribiert, die für dieselbe Aminosäure kodiert wie der ursprüngliche DNA-Strang. Wenn es zum Beispiel eine Änderung im DNA-Matrizenstrang von TAA (transkribiert in das Codon AUU) zu TAT (transkribiert als AUA) gab, wäre die resultierende Aminosäure nach der Translation für beide Isoleucin. Silent sind am häufigsten, wenn das dritte Nukleotid in einem Codon verändert ist, was die konservativ Eigenschaft des Codes.

Bei einer Mausspezies (Abb. 6) trat in der Vergangenheit eine Punktmutation an einem einzelnen Basenpaar auf, die das Endprodukt des Proteins veränderte, was zu einem anderen Phänotyp der Fellfarbe führte, a missense Mutation. Wo die dunkle Maus an einer bestimmten Stelle eine Arginin-Aminosäure in ihrem Protein hat, hat die weiße Maus ein Cystein. Diese einzige Veränderung in einem DNA-Molekül reicht aus, um den Phänotyp der Maus zu verändern, und hat dazu geführt, dass Mitglieder derselben Spezies in unterschiedlichen Umgebungen leben, ein erster Schritt, um verschiedene Spezies zu werden.

Abbildung 7. Mutationen auf Chromosomenebene.

Mutationen auf Chromosomenebene sind große Veränderungen in der DNA von Eukaryoten, mit der Hinzufügung, Deletion oder Verschiebung von Chromosomenabschnitten oder sogar ganzer Chromosomen. Fast alle dieser Mutationen treten als Fehler während der Kernteilung auf (entweder während der Meiose oder Mitose) und fast alle von ihnen wirken sich negativ auf die Fitness eines Organismus aus. Inversion ist eine Veränderung der Struktur eines einzelnen Chromosoms, wenn ein Segment des Chromosoms abgelöst, invertiert und wieder an dieselben Chromosomen angefügt wird. Alle Gene im invertierten Abschnitt dienen nicht mehr als Vorlage für die ursprünglichen Proteine, für die sie transkribiert wurden. Dies liegt daran, dass die Nukleotidsequenz vollständig umgekehrt zur ursprünglichen DNA ist und die Transkription nur in eine Richtung erfolgt. Translokation tritt auf, wenn ein Segment eines Chromosoms entfernt und mit einem anderen Chromosom wieder verbunden wird. Potenziell können die translozierten Gene angemessen transkribieren, solange keine Inversion aufgetreten ist.

Während des Zellzyklus replizieren sich die Chromosomen und werden während der Mitose in verschiedene Kerne aufgeteilt. Nach der Mitose werden die doppelten Kerne in zwei Zellen getrennt. Manchmal passieren Fehler während dieses Prozesses. Gelegentlich trennen sich die duplizierten Chromosomen nie und hinterlassen eine doppelte Kopie der Chromosomen in der Zelle. Dies ist bekannt als Polyploidie, und ist bei Tieren sehr selten. Es ist jedoch bei Pflanzen relativ häufig und kann den Ursprung einer neuen Art bilden, da polyploide Pflanzen reproduktiv aus diploiden Pflanzen isoliert werden. Typischerweise wird während der Meiose jeder Satz replizierter Chromosomen in zwei Hälften geteilt, wodurch schließlich Gameten produziert werden. Gelegentlich trennt sich eines der replizierten Chromosomen während der Meiose nicht richtig. Nach der Befruchtung hat die Zygote (und der eventuelle Organismus) ein zusätzliches Chromosom in ihren Zellen. Beim Menschen wird das Down-Syndrom durch das Vorhandensein einer zusätzlichen Kopie von Chromosom 21 verursacht. Zwei Chromosom 21 stammten von einem Elternteil, während eines vom anderen stammte. Die meisten Menschen haben zwei Kopien jedes Chromosoms, eine von ihrer Mutter und eine von ihrem Vater, bekannt als homologe Chromosomen. Homologe Chromosomen haben eine ähnliche Größe und die gleiche Gensequenz, können sich jedoch in den Allelen unterscheiden, die sie tragen. Der Mensch hat 23 homologe Chromosomenpaare, 23 von der Mutter und 23 vom Vater, also insgesamt 46 Chromosomen.

Transkription

Abbildung 8. Die Transkription erzeugt ein Transkript oder mRNA entsprechend der komplementären Basenpaarung des DNA-Matrizenstrangs.

Bei der Transkription synthetisiert ein DNA-Abschnitt (bekannt als Gen) mRNA. RNA sind Polymere, die aus einer Kette von Ribonukleotide. Ribonukleotide enthalten den Zucker ribose wohingegen Desoxyribonukleotide (von DNA) enthalten den Zucker Desoxyribose. Während DNA doppelsträngig und RNA einzelsträngig ist, enthält RNA die stickstoffhaltige Base uracil (U) wo DNA hätte von Thymin (T). Für ein bestimmtes Gen ist nur einer der DNA-Stränge, der Vorlagenstrang, synthetisiert aktiv eine Strang-mRNA, bekannt als a transkript. Der andere DNA-Strang, der Kodierungsstrang, ist nicht an der Transkription beteiligt. Der kodierende DNA-Strang ist jedoch der mRNA ähnlicher, da sowohl der kodierende Strang als auch das Transkript zum Matrizenstrang komplementär sind. Es passt jedoch nicht genau dazu. Die Ribonukleotide des Transkripts weisen die Zuckerribose auf, und wo der kodierende Strang die stickstoffhaltige Base Thymin aufweisen würde, weist das Transkript Uracil auf.

Während der Transkription binden Ribonukleotide an den Matrizenstrang basierend auf komplementärer Basenpaarung über Wasserstoffbrücken. Die Ribonukleotide verbinden sich dann mit einer Phosphodiesterbindung, genau wie DNA gebunden wird.

Einleitung der Transkription

Bei Prokaryoten wird die Transkription durch die Anheftung eines Proteins, das als Sigma bekannt ist, initiiert. Das Sigma heftet sich an einer ganz bestimmten Stelle an einen Strang der DNA (den Matrizenstrang). In Bakterien existieren mehrere Sigmas und jedes initiiert die Transkription einer bestimmten DNA-Sequenz (oder Gens). Sobald sich dieses Sigma-Protein an das DNA-Molekül anlagert, dient es dazu, die RNA-Polymerase den Matrizenstrang hinunter zu leiten. Das Sigma-Protein erkennt und bindet an die sogenannte Promotorsequenz. Die Promotorsequenz ist eine spezifische Gruppe von Basenpaaren. Sobald das Sigma an die DNA bindet, beginnt die Transkription. Es gibt verschiedene Sigmas. Jedes ist einzigartig und initiiert die Synthese eines bestimmten Gens oder in einigen Fällen mehrerer verschiedener Gene. Während es mehrere Sigmas gibt, jedes für verschiedene Genkomplexe, ist die RNA-Polymerase das gleiche Molekül, das mit all den verschiedenen Sigmas verbunden ist. Die RNA-Polymerase fügt dem Matrizenstrang basierend auf komplementärer Basenpaarung Ribonukleotide hinzu, wodurch eine mRNA erzeugt wird.

Abbildung 9. Transkriptionsschritte bei Prokaryonten.

Das Sigma-Protein öffnet zuerst die Doppelhelix der DNA am Promotorabschnitt des DNA-Strangs. Dann wird der Matrizenstrang der DNA durch die RNA-Polymerase gefädelt. Eingehende RNA-Nukleotide kommen durch einen Kanal im Sigma-Protein und paaren sich mit den komplementären Basen des DNA-Matrizenstrangs. An diesem Punkt ist die RNA-Polymerase funktionsfähig und beginnt zu arbeiten. Und sobald das passiert, trennt sich das Sigma von der DNA-Kette. Dies definiert den Beginn der Elongationsphase der Transkription.

Sobald das geeignete Sigma angebracht ist, bindet die RNA-Polymerase an das Sigma-Protein. Nach erfolgreicher Anheftung führt das Sigma die DNA in die RNA-Polymerase. Wenn die DNA durch die RNA-Polymerase gefädelt wird, werden Wasserstoffbrückenbindungen zwischen dem DNA-Molekül durch einen Reißverschluss aufgespalten. Sobald DNA in die RNA-Polymerase eingefügt ist, treten Ribonukleotide in ein Eingangsportal in die RNA-Polymerase ein und passen sich den D-Nukleotiden basierend auf komplementärer Basenpaarung an. Ähnlich wie bei der DNA-Basenpaarung paaren sich Cytosin-haltige Desoxyribonukleotide (D-Cytosin) mit guaninhaltigen Ribonukleotiden (R-Guanin), D-Guanin-Paare mit R-Cytosin und D-Thymin-Paare mit R-Adenin. Anders als bei der DNA-Basenpaarung paart sich D-Adenin mit R-Uracil. Durch ein weiteres Portal in der RNA-Polymerase taucht die sich entwickelnde mRNA auf. Sobald einige Ribonukleotide durch die RNA-Polymerase synthetisiert sind, wird das Sigma-Protein entfernt. Sobald das Sigma entfernt wurde, kann es wiederverwendet werden, um die Transkription zu initiieren.

Verlängerung der Transkription

Elongation in der Transkription ist ziemlich geradlinig. Die RNA-Polymerase bewegt sich entlang des offenen DNA-Moleküls und passt komplementäre Ribonukleotid-Basenpaare aus dem Matrizenstrang der offenen DNA (A-U, T-A, C-G und G-C) an. Nachdem das Sigma entfernt wurde, fährt die RNA-Polymerase fort, die Matrizen- und Kodierungsstränge der DNA zu entpacken, und Ribonukleotide werden über Phosphodiester-Bindungen basierend auf komplementärer Paarung, die durch den Matrizenstrang der DNA bestimmt wird, gebunden. Die ankommende DNA tritt in ein Aufnahmeportal ein und die Stränge werden durch einen inneren Reißverschluss getrennt. Wenn die DNA den Reißverschluss passiert, verbinden sich die Wasserstoffbrücken zwischen dem Kodierungs- und dem Matrizenstrang wieder und die DNA-Doppelhelix verlässt ein Ausgangsportal. Ribonukleotide treten durch ein anderes Aufnahmeportal ein und werden über komplementäre Basenpaarung mit dem Matrizenstrang der DNA kombiniert. Die Ribonukleotide sind über Phosphodiester-Bindungen aneinander gebunden und bilden eine entstehende . Ribonukleotide werden kontinuierlich am 3’-Ende des sich entwickelnden RNA-Strangs hinzugefügt. Das 5’-Ende des RNA-Strangs verlässt ein weiteres Austrittsportal der RNA-Polymerase.

Beendigung der Transkription

In Bakterien endet die Transkription (oder endet), sobald die RNA-Polymerase eine spezifische Sequenz von Ribonukleotiden aus dem DNA-Matrizenstrang transkribiert. Bei der Synthese dieser Sequenz biegt sich ein Abschnitt der RNA in sich selbst zurück und bildet aufgrund komplementärer Basenpaarung eine kurze Doppelhelix. Dies bildet a RNA-Haarnadel. Diese Haarnadelkurve zwingt die RNA, sich von der DNA zu trennen, und die RNA-Polymerase löst sich und die geöffnete DNA heftet sich basierend auf komplementärer Basenpaarung wieder an

Abbildung 10. Transkriptionsschritte in Eukaryoten und RNA-Spleißen.

Transkription in Eukaryoten

Grundsätzlich ähnelt die Transkription in Eukaryoten der Transkription in Prokaryoten mit wenigen Ausnahmen. In Bakterien kann die RNA-Polymerase jedes beliebige RNA-Molekül synthetisieren. In Eukaryoten gibt es drei verschiedene RNA-Polymerasen (I, II und III). Die RNA-Polymerase I ist hauptsächlich für die Synthese von ribosomaler RNA (rRNA) verantwortlich, dem Molekül, aus dem Ribosomen bestehen. Die meisten eukaryotischen RNA-Polymerase sind RNA-Polymerase II. RNA-Polymerase II ist für die Synthese von mRNA verantwortlich und ist damit die einzige RNA-Polymerase, die Protein-kodierende Gene transkribieren kann. Die RNA-Polymerase III ist für die Synthese von Transfer-RNA (tRNA) verantwortlich. Während der Translation lesen tRNAs die Botschaften von der mRNA und verknüpfen eine bestimmte Aminosäuresequenz, die Proteine ​​​​erzeugt.

Wenn die bakterielle Transkription durch ein Sigma-Protein initiiert wird, benötigen RNA-Polymerasen in Eukaryoten eine Gruppe von Proteinen, die als basale Transkriptionsfaktoren bekannt sind. Wie bei Sigma in Prokaryoten heften sich die basalen Transkriptionsfaktoren an die DNA, ihre jeweilige RNA-Polymerase heftet sich an und die Transkription beginnt. Der Elongationsprozess ist bei Prokaryoten und Eukaryoten praktisch identisch. Die Termination der Transkription unterscheidet sich jedoch zwischen Prokaryoten und Eukaryoten. Bei Eukaryoten signalisiert eine kurze Sequenz in der DNA die Anlagerung eines Enzyms stromabwärts der aktiven Transkription. Dieses Enzym schneidet die entstehende RNA und hinterlässt die RNA-Polymerase.

In Eukaryoten besteht Prä-RNA aus Regionen der mRNA, die für Aminosäuren kodieren (bekannt als Exons) und Regionen der mRNA, die nicht für Aminosäuren kodieren. Bevor die mRNA funktionsfähig sein kann, müssen die Introns in einem Prozess entfernt werden, der als RNA-Spleißen oder posttranskriptionelle Modifikation bekannt ist.

Posttranskriptionelle Modifikation von mRNA in Eukaryoten

In Bakterien ist die Transkription von DNA zu mRNA ein direkter Weg. In Eukaryoten durchläuft die mRNA jedoch, sobald die mRNA durch die RNA-Polymerase II synthetisiert wurde, weitere Modifikationen ( 11 ). Das auf die Transkription folgende Produkt wird als primäres Transkript (oder Prä-mRNA) bezeichnet. Bevor die mRNA den Kern verlässt, wird die mRNA verkürzt, indem bestimmte Abschnitte der mRNA herausgeschnitten und die verbleibenden Abschnitte wieder zusammengefügt werden. Dieser Vorgang wird als RNA-Spleißen bezeichnet und die resultierende, modifizierte mRNA wird als reife mRNA bezeichnet. Segmente der mRNA, die wieder zusammengefügt werden, werden als Exons bezeichnet (weil sie den Kern verlassen), während die Segmente der mRNA, die von der Prä-mRNA entfernt werden, als Introns bezeichnet werden. Die Exons (die zusammen die reife mRNA bilden) verlassen den Kern durch eine Kernpore und wandern zu einem Ribosom im Zytosol und beginnen den Translationsprozess.

Das RNA-Spleißen wird durch hybride Protein-RNA-Komplexe, die als kleine nukleäre Ribonukleoproteine ​​(oder snRNPs) bekannt sind, verarbeitet. Das RNA-Spleißen beginnt, wenn ein primärer snRNP an ein Guanin-R-Nukleotid (G) neben einem Uracil-R-Nukleotid (U) am 5’-Ende der Prä-mRNA bindet. Dies markiert die Exon-Intron-Grenze. Ein weiteres sekundäres snRNP liest von 5’ bis 3’ die mRNA hinunter und wenn es mit einem Adenin (A) in Kontakt kommt, und bindet es an diesem Punkt. Dieser Punkt repräsentiert die Intron-Exon-Grenze. Sobald die primären und sekundären snRNPs verbunden sind, heften sich andere snRNPS an diese in einem Komplex, der als Spleißosom bekannt ist. Zusammen bricht das Spleißosom die G-U-Bindung des primären snRNP und die Bindung zwischen dem Adenin (A) des sekundären snRNP und seinem benachbarten R-Nukleotid. Da U und A komplementäre Basen sind, bringen die Spleißosomen sie in engen Kontakt miteinander und erzeugen eine Intronschleife. Nukleotide der Intronschleife werden in ihre Monomere, Ribonukleotide, zerlegt und für zukünftige Transkriptionsereignisse recycelt. Exons werden wieder zusammengespleißt, wodurch eine reife mRNA entsteht.

Übersetzung in Prokaryoten

Abbildung 11. Kontrast von Transkription und Translation bei Prokaryoten und Eukaryoten.

Transkription ist der Prozess der Erzeugung von mRNA aus DNA Translation ist der Prozess der Umwandlung der genetischen Information von mRNA in Proteine. Da prokaryontische DNA nicht durch einen Kern begrenzt ist, erfolgt die Translation in Prokaryonten (d. h. Bakterien) bevor die Transkription abgeschlossen ist. Übersetzung und Transkription erfolgen gleichzeitig. Ribosomen grenzen an die transkribierende DNA an, sodass die Ribosomen mit der Translation beginnen, bevor die Transkription beendet wird. Dies ermöglicht eine effizientere Translation von Proteinen in Prokaryonten als in Eukaryonten.

Übersetzung in Eukaryoten

Bei Eukaryoten erfolgt die Transkription und Modifikation von mRNA ausschließlich im Zellkern. Nach der mRNA-Prozessierung wandert die reife mRNA aus dem Kern durch eine Kernpore. In dem Zytosol, dem Körper der Zelle außerhalb des Zellkerns, bindet sich die reife mRNA an ein Ribosom und durchläuft die Translation, um schließlich ein Protein zu produzieren. Die meisten Ribosomen sind am rauen endoplasmatischen Retikulum befestigt. Es gibt jedoch auch mehrere Ribosomen im Zytosol selbst.

Diese Trennung von Transkription und Translation bietet eine bessere Kontrolle über die Genregulation, insbesondere durch die Entfernung von Introns aus der Prä-mRNA. Es wird vermutet, dass die Entfernung von Introns eine Abwehr gegen die Expression alter retroviraler Gene ist, einem wichtigen Studiengebiet in der HIV-Forschung. Es wird auch vermutet, dass eukaryotische DNA aufgrund der physikalischen Barriere der Kernhülle zwischen DNA und Zytosol weniger anfällig für Mutationen ist als Prokaryoten.

Neben der mRNA ist ein weiteres wichtiges RNA-Molekül die Transfer-RNA, bekannt als tRNA, tRNA ist das Molekül, das den genetischen Code mit einem bestimmten Protein verbindet. Jedes Transfermolekül ist an eine bestimmte Aminosäure gebunden. Und jede Aminosäure hat am gegenüberliegenden Ende drei Basenpaare. Am Ribosom verbinden sich die drei Basenpaare der tRNA mit dem Komplement der drei Basenpaare der mRNA. So werden die drei komplementären Basenpaare der Transfer-RNA als Anticodon bezeichnet, während der Triplettcode der Messenger-RNA als Codon bezeichnet wird. Jedes Anticodon der tRNA ist mit einer bestimmten Aminosäure verknüpft, das am Ribosom mit dem komplementären Codon der mRNA verknüpft ist. Und dann werden die Aminosäuren durch Peptidbindungen zu einer wachsenden Peptidkette verbunden.

Abbildung 12. Schritte der Übersetzung.

Der ribosomale Komplex besteht aus einer anderen RNA (ribosomal RNA) und Proteinen. Diese bilden zwei Strukturen. Die kleine Untereinheit hält die mRNA während der Translation an Ort und Stelle, während sich in der großen Untereinheit die Peptidbindungen bilden. Und die große Untereinheit hat drei verschiedene Kammern: A, P und E. Im Allgemeinen besteht die Funktion des Ribosoms darin, Proteine ​​zu synthetisieren. Zuerst tritt die mit einer tRNA verbundene Aminosäure an der A-Stelle in das Ribosom ein. Wenn ein weiteres tRNA-Molekül in die A-Stelle kommt, bewegt sich das andere tRNA-Molekül über drei Basenpaare und eine Peptidbindung wird zwischen den beiden Aminosäuren gebildet. Wenn ein weiteres tRNA-Molekül in den ribosomalen Komplex eindringt, bewegen sich die anderen beiden tRNAs um 3 Basen und die älteste tRNA verlässt das Ribosom an der E-Stelle. Denken Sie nur an APE.

Einleitung der Übersetzung

Schauen wir uns die Prozessübersetzung genauer an (Abb. 12). Die mRNA hat einen speziellen Abschnitt direkt vor dem Startcodon, das das Ribosom erkennt, die sogenannte Ribosomenbindungsstelle. Die Translation beginnt mit dem Startcodon auf der mRNA. An die tRNA des Startcodons ist eine Aminosäure namens f-Met angeschlossen. Sobald die f-Met-tRNA an die kleine Untereinheit des Ribosoms bindet, bindet die große Untereinheit des Ribosoms an die kleine Einheit und die Translation kann beginnen.

Die Translation beginnt, wenn sich eine mRNA mit dem verbindet kleine Untereinheit eines Ribosoms. Ribosomen bestehen aus Proteinen und einer anderen Art von RNA, ribosomale RNA (oder rRNA). Die Translation beginnt, wenn die rRNA an eine bestimmte Sequenz der mRNA bindet, die als bekannt ist Ribosomenbindungsstelle. Diese Verbindung basiert auf einer komplementären Basenpaarung benachbarter Ribonukleotide von rRNA und mRNA, die durch spezielle Proteine, bekannt als Initiationsfaktoren. Einer der Initiationsfaktoren dient auch als Andockstation für die erste tRNA, die sich an die Startcodon von mRNA, die AUG für die Synthese aller Proteine ​​ist. tRNAs haben einen komplementären Triplett-Code, der mit dem Codon der mRNA verbunden ist, bekannt als an Anticodon (Abb. 12). Das Anticodon der anfänglichen tRNA ist UAC. An die anfängliche tRNA ist die Aminosäure Methionin (met) gebunden. Sobald diese tRNA an die kleine Untereinheit angelagert ist, heftet sich die große Untereinheit des Ribosoms daran und die Translationsverlängerung beginnt.

Verlängerung der Übersetzung

Die nächste tRNA tritt aufgrund der komplementären Basenpaarung des Codons der mRNA und des Anticodons der tRNA in die A-Stelle ein. Sobald die Codon-Anticodon-Paarung erfolgreich ist, wird die neue tRNA an der A-Stelle so positioniert, dass die von ihr getragene Aminosäure an die bereits in der P-Stelle vorhandene Aminosäure angrenzt. Diese Nähe ermutigt a Peptidbindung zwischen den beiden benachbarten Aminosäuren den Anfang einer Polypeptidkette zu bilden.

bindet an sein komplementäres Codon in der A-Stelle der großen Untereinheit des Ribosoms.

Zweitens bildet sich eine Peptidbindung an der P-Stelle. Als nächstes bewegt sich der gesamte Ribosomenkomplex drei Basenpaare nach unten. Die tRNA der A-Stelle wandert zur P-Stelle und die tRNA der P-Stelle wandert zur E-Stelle, und die tRNA der E-Stelle verlässt den ribosomalen Komplex. Dieser Vorgang wird als Translokation bezeichnet.

Beendigung der Übersetzung

Die Translation wird durch eines von drei Stopcodons beendet. Sobald das Ribosom auf eines dieser Stoppcodons stößt, bewirkt es, dass ein spezifisches Protein, ein sogenannter Freisetzungsfaktor, in das Ribosom eindringt und die Freisetzung der Polypeptidkette bewirkt. Auch zu diesem Zeitpunkt trennt sich das große Ribosom von der kleinen Untereinheit.


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