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Kann eine Übersetzung jemals ohne Transkription erfolgen?


Diese Frage richtet sich hauptsächlich an Viren mit ssRNA, ist für die +ve-Strang-RNA eine Transkription erforderlich? Wenn ja warum?


Ich gehe davon aus, dass die Frage ist, ob bei einzelligen +ve-RNA-Viren die Translation von Plusstrang-RNA vor der Transkription erfolgen kann.

Erstens gibt es viele verschiedene Familien von Viren, und es wird sicher Gegenbeispiele zu allem geben, was ich hier sage. Allerdings mit diesem Fahrer:

  1. Wir beziehen uns im Allgemeinen eher auf die Replikation von RNA-Viren durch RNA-abhängige RNA-Polymerase als auf die Transkription. Ich bin nicht bewusst eines beliebigen RNA-Virus, das eine RNA-Polymerase aufweist, die Promotoren erkennt und spezifische Gene transkribiert. Diese Viren neigen dazu, im Zytoplasma zu replizieren und haben daher keinen Zugang zur Wirts-RNA-Polymerase.

  2. Es muss eine Replikation geben, und diese ist eher konservativ als halbkonservativ. Damit meine ich, dass wenn Minusstränge erzeugt werden, diese als Template für viele Plusstränge dienen, die für die Viruspartikel benötigt werden.

  3. Bei Picornaviren wie Polio kann die Translation vor der Replikation erfolgen. Wie bei kleinen RNA-Viren üblich, gibt es eine einzige Initiationsstelle für die Translation – bei Polio entsteht ein Polyprotein, das anschließend in einzelne Polypeptide gespalten wird. Das Diagramm unten stammt aus dem Wikipedia-Eintrag für Poliovirus und wird hier unter dem wiedergegeben Creative Commons Lizenz.

[Nidia H De Jesus (Bild und Bildunterschrift) - De Jesus NH (2007). „Epidemien zur Ausrottung: die moderne Geschichte der Poliomyelitis“. Virol. J. 4: 70. DOI: 10,1186/1743-422X-4-70. PMID 17623069. Der zelluläre Lebenszyklus des Poliovirus. Sie wird durch die Bindung eines Poliovirions an das Zelloberflächen-Makromolekül CD155 initiiert, das als Rezeptor fungiert (1). Die Enthüllung der viralen RNA wird durch eine rezeptorabhängige Destabilisierung des Viruskapsids vermittelt (2). Die Spaltung des viralen Proteins VPg erfolgt durch eine zelluläre Phosphodiesterase, und die Translation der viralen RNA erfolgt durch einen Cap-unabhängigen (IRES-vermittelten) Mechanismus (3). Die proteolytische Prozessierung des viralen Polyproteins liefert reife strukturelle und nicht-strukturelle Proteine ​​(4). Die Positiv-Sense-RNA dient als Matrize für die komplementäre Negativstrang-Synthese, wodurch eine doppelsträngige RNA (replikative Form, RF) entsteht (5). Die Initiierung vieler positiver Stränge aus einem einzelnen negativen Strang erzeugt das teilweise einzelsträngige replikative Zwischenprodukt (RI) (6). Die neu synthetisierten Positiv-Sense-RNA-Moleküle können als Template für die Translation dienen (7) oder mit Kapsid-Vorläufern assoziieren, um eine Verkapselung zu durchlaufen und die Reifungsspaltung von VP0 zu induzieren (8), die letztendlich Nachkommen-Virionen erzeugt. Die Lyse der infizierten Zelle führt zur Freisetzung infektiöser Nachkommen-Virionen (9).]


Das genetische Material ist in den meisten Organismen in Form von DNA gespeichert. Beim Menschen enthält der Zellkern jeder Zelle 3 × 10 9 Basenpaare DNA, die auf 23 Chromosomenpaare verteilt sind, und jede Zelle hat zwei Kopien des genetischen Materials. Dies wird zusammenfassend als das menschliche Genom bezeichnet. Das menschliche Genom enthält rund 30 000 Gene, die jeweils für ein Protein kodieren.

Große DNA-Abschnitte im menschlichen Genom werden transkribiert, kodieren aber nicht für Proteine. Diese Regionen heißen Introns und machen etwa 95 % des Genoms aus. Die Nukleotidsequenz des menschlichen Genoms ist jetzt mit einem angemessenen Grad an Genauigkeit bekannt, aber wir verstehen noch nicht, warum so viel davon nicht kodiert. Ein Teil dieser nicht-kodierenden DNA kontrolliert die Genexpression, aber der Zweck vieler davon ist noch nicht verstanden. Ein faszinierendes Thema, das sich in den nächsten Jahren mit Sicherheit rasant weiterentwickeln wird.

Die Zentrales Dogma der Molekularbiologie besagt, dass DNA macht RNA macht Proteine (Abbildung 1).

Abbildung 1 | Das zentrale Dogma der Molekularbiologie: DNA macht RNA macht Proteine

Der Vorgang, bei dem DNA in RNA kopiert wird, wird als Transkription bezeichnet, und der Vorgang, bei dem RNA zur Herstellung von Proteinen verwendet wird, wird als Translation bezeichnet.

DNA Replikation

Jedes Mal, wenn sich eine Zelle teilt, spaltet sich jeder ihrer DNA-Doppelstränge in zwei Einzelstränge. Jeder dieser Einzelstränge fungiert als Matrize für einen neuen Strang komplementärer DNA. Dadurch hat jede neue Zelle ihr eigenes vollständiges Genom. Dieser Vorgang ist bekannt als DNA Replikation. Die Replikation wird durch die Watson-Crick-Paarung der Basen im Matrizenstrang mit ankommenden Desoxynukleosidtriphosphaten kontrolliert und durch DNA-Polymerase-Enzyme gesteuert. Es ist ein komplexer Prozess, insbesondere bei Eukaryoten, an dem eine Reihe von Enzymen beteiligt sind. Eine vereinfachte Version der bakteriellen DNA-Replikation ist in Abbildung 2 beschrieben.

Abbildung 2 | DNA-Replikation in Bakterien Vereinfachte Darstellung der DNA-Replikation in Bakterien.

Die DNA-Biosynthese verläuft in 5&prime- zu 3&prime-Richtung. Dies macht es DNA-Polymerasen unmöglich, beide Stränge gleichzeitig zu synthetisieren. Ein Teil der Doppelhelix muss sich erst abwickeln, und dies wird vermittelt durch Helikase Enzyme.

Der führende Strang wird kontinuierlich synthetisiert, aber der gegenüberliegende Strang wird in kurzen Bursts von etwa 1000 Basen kopiert, wenn die Matrize des nacheilenden Strangs verfügbar wird. Die resultierenden kurzen Stränge heißen Okazaki-Fragmente (nach ihren Entdeckern Reiji und Tsuneko Okazaki). Bakterien haben mindestens drei verschiedene DNA-Polymerasen: Pol I, Pol II und Pol III. Pol III ist hauptsächlich an der Kettenverlängerung beteiligt. Seltsamerweise können DNA-Polymerasen keine DNA-Synthese initiieren de novo, erfordern jedoch einen kurzen Primer mit einer freien 3&prime-Hydroxylgruppe. Diese wird im nacheilenden Strang von einer RNA-Polymerase (genannt DNA-Primase) produziert, die in der Lage ist, die DNA-Matrize zu verwenden und ein kurzes RNA-Stück von etwa 20 Basen Länge zu synthetisieren. Pol III kann dann übernehmen, stößt jedoch schließlich auf eines der zuvor synthetisierten kurzen RNA-Fragmente auf seinem Weg. An diesem Punkt übernimmt Pol I, indem es seine 5&prime- bis 3&prime-Exonuklease-Aktivität verwendet, um die RNA zu verdauen und die Lücke mit DNA zu füllen, bis es eine kontinuierliche DNA-Strecke erreicht. Dies hinterlässt eine Lücke zwischen dem 3&prime-Ende der neu synthetisierten DNA und dem 5&prime-Ende der zuvor von Pol III synthetisierten DNA. Die Lücke wird durch DNA-Ligase gefüllt, ein Enzym, das eine kovalente Bindung zwischen einer 5&prime-Phosphat- und einer 3&prime-Hydroxylgruppe herstellt (Abbildung 3). Die Initiierung der DNA-Replikation am Leitstrang ist komplexer und wird in Fachtexten ausführlich besprochen.

Abbildung 3 | DNA-Polymerasen bei der DNA-Replikation Vereinfachte Darstellung der Wirkung von DNA-Polymerasen bei der DNA-Replikation in Bakterien.

Fehler bei der DNA-Replikation

Die DNA-Replikation ist nicht perfekt. Bei der DNA-Replikation treten Fehler auf, wenn die falsche Base in den wachsenden DNA-Strang eingebaut wird. Dies führt zu nicht übereinstimmend Basenpaare, oder Fehlpaarungen. DNA-Polymerasen haben eine Korrekturleseaktivität, und es wurden DNA-Reparaturenzyme entwickelt, um diese Fehler zu korrigieren. Gelegentlich überleben Fehlpaarungen und werden in der nächsten Replikationsrunde in das Genom eingebaut. Diese Mutationen können keine Folgen haben, sie können zum Tod des Organismus führen, sie können zu einer genetischen Krankheit oder Krebs führen oder sie können dem Organismus einen Wettbewerbsvorteil gegenüber seinen Nachbarn verschaffen, was zur Evolution durch natürliche Selektion führt.

Transkription

Transkription ist der Vorgang, bei dem DNA kopiert wird (transkribiert) zu mRNA, die die für die Proteinsynthese notwendigen Informationen trägt. Die Transkription erfolgt in zwei großen Schritten. Zunächst wird unter Beteiligung von RNA-Polymerase-Enzymen Pre-Messenger-RNA gebildet. Der Prozess beruht auf der Watson-Crick-Basenpaarung, und der resultierende RNA-Einzelstrang ist das umgekehrte Komplement der ursprünglichen DNA-Sequenz. Die Pre-Messenger-RNA wird dann "editiert", um das gewünschte mRNA-Molekül in einem Prozess namens . zu produzieren RNA-Spleißen.

Bildung von Pre-Messenger-RNA

Der Transkriptionsmechanismus weist Parallelen zu dem der DNA-Replikation auf. Wie bei der DNA-Replikation muss die Doppelhelix teilweise entwindet werden, bevor die Transkription stattfinden kann, und es sind die RNA-Polymerase-Enzyme, die diesen Prozess katalysieren.

Im Gegensatz zur DNA-Replikation, bei der beide Stränge kopiert werden, wird nur ein Strang transkribiert. Der Strang, der das Gen enthält, wird als bezeichnet Sinn Strang, während der komplementäre Strang der Antisense Strand. Die bei der Transkription produzierte mRNA ist eine Kopie des Sense-Strangs, aber es ist der Antisense-Strang, der transkribiert wird.

Ribonukleosidtriphosphate (NTPs) richten sich entlang des Antisense-DNA-Strangs aus, mit Watson-Crick-Basenpaarung (A paart mit U). RNA-Polymerase verbindet die Ribonukleotide miteinander, um ein Prä-Messenger-RNA-Molekül zu bilden, das zu einer Region des Antisense-DNA-Strangs komplementär ist. Die Transkription endet, wenn das RNA-Polymerase-Enzym ein Basentriplett erreicht, das als "Stopp"-Signal gelesen wird. Das DNA-Molekül wickelt sich zurück, um die Doppelhelix neu zu bilden.

Abbildung 4 | Transkription Vereinfachte Darstellung der Bildung von Pre-Messenger-RNA (orange) aus doppelsträngiger DNA (blau) bei der Transkription.

RNA-Spleißen

Die so gebildete Prä-Messenger-RNA enthält Introns, die für die Proteinsynthese nicht benötigt werden. Die Prä-Messenger-RNA wird zerhackt, um die Introns zu entfernen und Messenger-RNA (mRNA) in einem Prozess namens RNA-Spleißen zu erzeugen (Abbildung 5).

Abbildung 5 | RNA-Spleißen Introns werden aus der Prä-Messenger-RNA gespleißt, um Messenger-RNA (mRNA) zu ergeben.

Alternatives Spleißen

Beim alternativen Spleißen werden einzelne Exons entweder gespleißt oder eingeschlossen, wodurch mehrere verschiedene mögliche mRNA-Produkte entstehen. Jedes mRNA-Produkt kodiert für eine andere Proteinisoform. Diese Proteinisoformen unterscheiden sich in ihrer Peptidsequenz und damit in ihrer biologischen Aktivität. Es wird geschätzt, dass bis zu 60 % der menschlichen Genprodukte alternatives Spleißen durchlaufen. Es sind mehrere verschiedene Mechanismen des alternativen Spleißens bekannt, von denen zwei in Abbildung 6 dargestellt sind.

Abbildung 6 | Alternatives Spleißen Es gibt mehrere verschiedene Mechanismen des alternativen Spleißens – ein Kassetten-Exon kann entweder in die endgültige RNA eingeschlossen oder von ihr ausgeschlossen werden (oben), oder zwei Kassetten-Exons können sich gegenseitig ausschließen (unten).

Alternatives Spleißen trägt zur Proteindiversität bei – ein einzelnes Gentranskript (RNA) kann Tausende von verschiedenen Spleissmustern aufweisen und wird daher für Tausende verschiedener Proteine ​​kodieren: Aus einem relativ begrenzten Genom wird ein vielfältiges Proteom generiert. Das Spleißen ist für die genetische Regulation wichtig (eine Veränderung des Spleissmusters als Reaktion auf zelluläre Bedingungen verändert die Proteinexpression). Es überrascht vielleicht nicht, dass abnormale Spleißmuster zu Krankheitszuständen wie Krebs führen können.

Reverse Transkription

Bei der reversen Transkription wird RNA in DNA "revers transkribiert". Dieser Prozess, der durch reverse Transkriptase-Enzyme katalysiert wird, ermöglicht es Retroviren, einschließlich des humanen Immunschwächevirus (HIV), RNA als ihr genetisches Material zu verwenden. Reverse Transkriptase-Enzyme haben auch in der Biotechnologie Anwendung gefunden und ermöglichen es Wissenschaftlern, RNA für Techniken wie die PCR in DNA umzuwandeln.

Übersetzung

Die bei der Transkription gebildete mRNA wird aus dem Zellkern in das Zytoplasma zum Ribosom (der Proteinsynthesefabrik der Zelle) transportiert. Hier steuert es die Proteinsynthese. Messenger-RNA ist nicht direkt an der Proteinsynthese beteiligt – dafür wird Transfer-RNA (tRNA) benötigt. Der Prozess, bei dem mRNA mit Hilfe von tRNA die Proteinsynthese steuert, heißt Übersetzung.

Das Ribosom ist ein sehr großer Komplex aus RNA- und Proteinmolekülen. Jeder drei Basen lange Abschnitt der mRNA (Triplett) wird als a . bezeichnet codon, und ein Codon enthält die Informationen für eine bestimmte Aminosäure. Wenn die mRNA das Ribosom passiert, interagiert jedes Codon mit dem Anticodon eines spezifischen Transfer-RNA (tRNA)-Moleküls durch Watson-Crick-Basenpaarung. Dieses tRNA-Molekül trägt an seinem 3&prime-Terminus eine Aminosäure, die in die wachsende Proteinkette eingebaut wird. Die tRNA wird dann aus dem Ribosom ausgestoßen. Abbildung 7 zeigt die Schritte der Proteinsynthese.

Abbildung 7 | Translation (a) und (b) tRNA-Moleküle binden an die beiden Bindungsstellen des Ribosoms, und durch Wasserstoffbrückenbindung an die mRNA (c) bildet sich eine Peptidbindung zwischen den beiden Aminosäuren zu einem Dipeptid, während das tRNA-Molekül übrig bleibt ungeladen (d) das ungeladene tRNA-Molekül verlässt das Ribosom, während das Ribosom um ein Codon nach rechts wandert (das Dipeptid wird von einer Bindungsstelle zur anderen verlagert) (e) ein weiteres tRNA-Molekül bindet (f) eine Peptidbindung bildet sich zwischen den zwei Aminosäuren zu einem Tripeptid (g) das ungeladene tRNA-Molekül verlässt das Ribosom.

RNA übertragen

Transfer-RNA nimmt eine gut definierte Tertiärstruktur an, die normalerweise in zwei Dimensionen als Kleeblattform dargestellt wird, wie in Abbildung 7. Die Struktur der tRNA ist in Abbildung 8 genauer dargestellt.

Abbildung 8 | Zweidimensionale Strukturen der tRNA (Transfer-RNA) Bei einigen tRNAs hat der DHU-Arm nur drei Basenpaare.

Jede Aminosäure hat ihre eigene spezielle tRNA (oder einen Satz von tRNAs). Beispielsweise unterscheidet sich die tRNA für Phenylalanin (tRNAPhe) von der für Histidin (tRNAHis). Jede Aminosäure ist über die 3&prime-OH-Gruppe an ihre tRNA gebunden, um einen Ester zu bilden, der mit der α-Aminogruppe der terminalen Aminosäure der wachsenden Proteinkette reagiert, um während der Proteinsynthese eine neue Amidbindung (Peptidbindung) zu bilden (Abbildung 9). Die Reaktion von Estern mit Aminen ist im Allgemeinen günstig, jedoch wird die Reaktionsgeschwindigkeit im Ribosom stark erhöht.

Abbildung 9 | Proteinsynthese Reaktion der wachsenden Polypeptidkette mit dem 3&prime-Ende der geladenen tRNA. Die Aminosäure wird vom tRNA-Molekül auf das Protein übertragen.

Jedes Transfer-RNA-Molekül hat eine gut definierte Tertiärstruktur, die von dem Enzym Aminoacyl-tRNA-Synthetase erkannt wird, das die richtige Aminosäure an das 3&prime-Ende der ungeladenen tRNA anfügt. Die Anwesenheit modifizierter Nukleoside ist wichtig für die Stabilisierung der tRNA-Struktur. Einige dieser Modifikationen sind in Abbildung 10 dargestellt.

Abbildung 10 | Modifizierte Basen in tRNA Strukturen einiger der modifizierten Basen in tRNA.

Der genetische Code

Der genetische Code ist fast universell. Es ist die Grundlage für die Übertragung von Erbinformationen durch Nukleinsäuren in allen Organismen. Es gibt vier Basen in RNA (A, G, C und U), also gibt es 64 mögliche Triplett-Codes (4 3 = 64). Theoretisch sind nur 22 Codes erforderlich: einer für jede der 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren mit einem Startcodon und einem Stopcodon (um den Anfang und das Ende einer Proteinsequenz anzuzeigen). Viele Aminosäuren haben mehrere Codes (Entartung), so dass alle 64 möglichen Triplettcodes verwendet werden. Arg und Ser haben zum Beispiel jeweils 6 Codons, während Trp und Met nur eines haben. Keine zwei Aminosäuren haben den gleichen Code, aber Aminosäuren, deren Seitenketten ähnliche physikalische oder chemische Eigenschaften haben, neigen dazu, ähnliche Codonsequenzen zu haben, z. die Seitenketten von Phe, Leu, Ile, Val sind alle hydrophob und Asp und Glu sind beides Carbonsäuren (siehe Abbildung 11). Dies bedeutet, dass, wenn die falsche tRNA während der Translation ausgewählt wird (aufgrund einer Fehlpaarung einer einzelnen Base an der Codon-Anticodon-Schnittstelle), die falsch eingebaute Aminosäure wahrscheinlich ähnliche Eigenschaften wie das beabsichtigte tRNA-Molekül hat. Obwohl das resultierende Protein eine falsche Aminosäure enthält, besteht eine hohe Wahrscheinlichkeit, dass es funktionsfähig ist. Organismen zeigen "Codon-Bias" und verwenden bestimmte Codons für eine bestimmte Aminosäure mehr als andere. Zum Beispiel unterscheidet sich die Codon-Verwendung beim Menschen von der bei Bakterien. Manchmal kann es schwierig sein, ein menschliches Protein in Bakterien zu exprimieren, da die relevante tRNA in zu geringer Konzentration vorhanden sein könnte.

Abbildung 11 | Der genetische Code – Triplett-Codon-Zuordnungen für die 20 Aminosäuren. AUG kodiert nicht nur für Methionin, sondern wird auch als Startcodon verwendet, um die Proteinbiosynthese zu initiieren

Eine Übung im Umgang mit dem genetischen Code

Ein Strang genomischer DNA (Strang A, kodierender Strang) enthält die folgende Sequenz, die von 5&prime- bis 3&prime- gelesen wird:

Dieser Strang bildet den folgenden Duplex:

Die Basensequenz im anderen DNA-Strang (Strang B), geschrieben von 5&prime- bis 3&prime-, ist daher

Die Basensequenz in der mRNA, die von Strang A der DNA transkribiert wurde, geschrieben 5&prime- bis 3&prime- ist

Die von der obigen mRNA kodierte Aminosäuresequenz ist

Wenn jedoch DNA-Strang B der kodierende Strang ist, lautet die mRNA-Sequenz:

und die Aminosäuresequenz ist:

Die Wobble-Hypothese

Eine genaue Untersuchung aller verfügbaren Codons für eine bestimmte Aminosäure zeigt, dass die Variation in der dritten Position am größten ist (zum Beispiel sind die Codons für Alanin GCU, GCC, GCA und GCG). Crick und Brenner schlugen vor, dass ein einzelnes tRNA-Molekül Codons mit unterschiedlichen Basen am 3&prime-Ende aufgrund der Nicht-Watson-Crick-Basenpaarbildung mit der dritten Base in der Codon-Anticodon-Interaktion erkennen kann. Diese nicht standardmäßigen Basenpaare unterscheiden sich in ihrer Form von A·U und G·C und der Term Wackel-Hypothese weist darauf hin, dass an dieser Stelle im Ribosom ein gewisses Maß an Flexibilität oder "Wackeln" erlaubt ist. Nicht alle Kombinationen sind möglich Beispiele für „erlaubte“ Paarungen sind in Abbildung 12 dargestellt.

Abbildung 12 | Strukturen von Wobble-Basenpaaren in RNA

Die Fähigkeit von DNA-Basen, Wobble-Basenpaare sowie Watson-Crick-Basenpaare zu bilden, kann dazu führen, dass während der DNA-Replikation Basenpaar-Fehlpaarungen auftreten. Wenn sie nicht durch DNA-Reparaturenzyme repariert werden, können diese Fehlpaarungen zu genetischen Krankheiten und Krebs führen.


Prokaryontische Transkription

Einleitung der Transkription in Prokaryoten

Prokaryonten haben keine membranumschlossenen Kerne. Daher können die Prozesse der Transkription, Translation und des mRNA-Abbaus alle gleichzeitig ablaufen. Die intrazelluläre Ebene eines bakteriellen Proteins kann schnell durch mehrere Transkriptions- und Translationsereignisse amplifiziert werden, die gleichzeitig auf derselben DNA-Matrize auftreten. Die prokaryontische Transkription umfasst oft mehr als ein Gen und produziert polycistronische mRNAs, die mehr als ein Protein spezifizieren.

Unsere Diskussion hier wird die Transkription veranschaulichen, indem wir diesen Prozess in beschreiben Escherichia coli, eine gut untersuchte Bakterienart. Obwohl einige Unterschiede zwischen der Transkription in E coli und Transkription in Archaeen, ein Verständnis von E coli Die Transkription kann auf praktisch alle Bakterienarten angewendet werden.

Prokaryotische RNA-Polymerase

Prokaryoten verwenden dieselbe RNA-Polymerase, um alle ihre Gene zu transkribieren. In E coli, besteht die Polymerase aus fünf Polypeptid-Untereinheiten, von denen zwei identisch sind. Vier dieser Untereinheiten, bezeichnet als α, α, β, und β′ umfassen die Polymerase Kernenzym. Diese Untereinheiten bauen sich jedes Mal zusammen, wenn ein Gen transkribiert wird, und zerlegen sich, sobald die Transkription abgeschlossen ist. Jede Untereinheit hat eine einzigartige Rolle die beiden α-Untereinheiten sind notwendig, um die Polymerase auf der DNA aufzubauen β-Untereinheit bindet an das Ribonukleosidtriphosphat, das Teil des entstehenden „neugeborenen“ mRNA-Moleküls wird und die β′ bindet den DNA-Matrizenstrang. Die fünfte Untereinheit, σ, ist nur an der Transkriptionsinitiation beteiligt. Es verleiht Transkriptionsspezifität, so dass die Polymerase beginnt, mRNA von einer geeigneten Initiationsstelle zu synthetisieren. Ohne σ, würde das Kernenzym von zufälligen Stellen transkribieren und mRNA-Moleküle produzieren, die Protein-Kauderwelsch spezifizierten. Die aus allen fünf Untereinheiten bestehende Polymerase wird als bezeichnet Holoenzym.

Prokaryontische Promotoren

Abbildung 1. Die σ-Untereinheit der prokaryotischen RNA-Polymerase erkennt Konsensussequenzen, die in der Promotorregion stromaufwärts des Transkriptionsstartpunkts gefunden werden. Die σ-Untereinheit dissoziiert von der Polymerase, nachdem die Transkription initiiert wurde.

EIN Promoter ist eine DNA-Sequenz, an die die Transkriptionsmaschinerie bindet und die Transkription initiiert. In den meisten Fällen existieren Promotoren stromaufwärts der Gene, die sie regulieren. Die spezifische Sequenz eines Promotors ist sehr wichtig, da sie bestimmt, ob das entsprechende Gen ständig, gelegentlich oder selten transkribiert wird. Obwohl die Promotoren zwischen den prokaryotischen Genomen variieren, sind einige Elemente konserviert. In den Regionen -10 und -35 stromaufwärts der Initiationsstelle befinden sich zwei Promotoren Konsens Sequenzen oder Regionen, die über alle Promotoren und über verschiedene Bakterienarten hinweg ähnlich sind (Abbildung 1).

Die -10-Konsensussequenz, die als -10-Region bezeichnet wird, ist TATAAT. Die -35-Sequenz, TTGACA, wird erkannt und gebunden von σ. Sobald diese Interaktion erfolgt ist, binden die Untereinheiten des Kernenzyms an die Stelle. Die A–T-reiche -10-Region erleichtert das Abwickeln der DNA-Matrize, und es werden mehrere Phosphodiester-Bindungen hergestellt. Die Initiationsphase der Transkription endet mit der Produktion von abortiven Transkripten, bei denen es sich um Polymere von ungefähr 10 Nukleotiden handelt, die hergestellt und freigesetzt werden.

Elongation und Termination bei Prokaryoten

Die Transkription Elongationsphase beginnt mit der Freisetzung des σ Untereinheit von der Polymerase. Die Dissoziation von σ ermöglicht dem Kernenzym, entlang der DNA-Matrize fortzuschreiten und mRNA in der 5'-zu 3'-Richtung mit einer Geschwindigkeit von ungefähr 40 Nukleotiden pro Sekunde zu synthetisieren. Bei fortschreitender Elongation wird die DNA kontinuierlich vor dem Kernenzym abgewickelt und dahinter wieder aufgewickelt (Abbildung 2). Die Basenpaarung zwischen DNA und RNA ist nicht stabil genug, um die Stabilität der mRNA-Synthesekomponenten aufrechtzuerhalten. Stattdessen fungiert die RNA-Polymerase als stabiler Linker zwischen der DNA-Matrize und den entstehenden RNA-Strängen, um sicherzustellen, dass die Elongation nicht vorzeitig unterbrochen wird.

Abbildung 2. Klicken Sie für ein größeres Bild. Während der Elongation verfolgt die prokaryontische RNA-Polymerase entlang der DNA-Matrize, synthetisiert mRNA in der 5'-zu 3'-Richtung und wickelt die DNA beim Lesen ab und zurück.

Prokaryontische Beendigungssignale

Sobald ein Gen transkribiert ist, muss die prokaryontische Polymerase angewiesen werden, von der DNA-Matrize zu dissoziieren und die neu hergestellte mRNA freizusetzen. Abhängig vom zu transkribierenden Gen gibt es zwei Arten von Terminationssignalen. Einer ist proteinbasiert und der andere ist RNA-basiert. Rho-abhängige Kündigung wird durch das Rho-Protein gesteuert, das hinter der Polymerase auf der wachsenden mRNA-Kette entlangläuft. Gegen Ende des Gens trifft die Polymerase auf eine Reihe von G-Nukleotiden auf der DNA-Matrize und sie bleibt stehen. Dadurch kollidiert das Rho-Protein mit der Polymerase. Die Interaktion mit Rho setzt die mRNA aus der Transkriptionsblase frei.

Rho-unabhängige Terminierung wird durch spezifische Sequenzen im DNA-Matrizenstrang kontrolliert. Wenn sich die Polymerase dem Ende des zu transkribierenden Gens nähert, trifft sie auf eine Region, die reich an C-G-Nukleotiden ist. Die mRNA faltet sich in sich selbst zurück und die komplementären C-G-Nukleotide binden aneinander. Das Ergebnis ist ein stabiler Haarnadel Dies führt dazu, dass die Polymerase anhält, sobald sie beginnt, eine Region zu transkribieren, die reich an A-T-Nukleotiden ist. Die komplementäre U–A-Region des mRNA-Transkripts bildet nur eine schwache Wechselwirkung mit der Template-DNA. Dies, gekoppelt mit der blockierten Polymerase, induziert genügend Instabilität, damit das Kernenzym abbrechen und das neue mRNA-Transkript freisetzen kann.

Nach Beendigung ist der Transkriptionsprozess abgeschlossen. Zum Zeitpunkt der Termination wäre das prokaryontische Transkript bereits verwendet worden, um mit der Synthese zahlreicher Kopien des kodierten Proteins zu beginnen, da diese Prozesse gleichzeitig ablaufen können. Die Vereinheitlichung von Transkription, Translation und sogar mRNA-Abbau ist möglich, weil alle diese Prozesse in der gleichen 5′-zu-3′-Richtung ablaufen und weil es in der prokaryontischen Zelle keine membranöse Kompartimentierung gibt (Abbildung 3). Im Gegensatz dazu schließt das Vorhandensein eines Kerns in eukaryotischen Zellen eine gleichzeitige Transkription und Translation aus.

Abbildung 3. Mehrere Polymerasen können ein einzelnes bakterielles Gen transkribieren, während zahlreiche Ribosomen gleichzeitig die mRNA-Transkripte in Polypeptide übersetzen. Auf diese Weise kann ein bestimmtes Protein in der Bakterienzelle schnell eine hohe Konzentration erreichen.

Besuchen Sie diese BioStudio-Animation, um den Prozess der prokaryotischen Transkription zu sehen.

Fragen zum Üben

Welche Untereinheit der E coli Polymerase verleiht der Transkription Spezifität?

Die -10- und -35-Regionen prokaryotischer Promotoren werden als Konsensussequenzen bezeichnet, weil ________.

  1. sie sind bei allen Bakterienarten identisch
  2. sie sind bei allen Bakterienarten ähnlich
  3. sie existieren in allen Organismen
  4. sie haben in allen Organismen die gleiche Funktion

Prä-RNA und mRNA

Nach der Transkription, eukaryotische Prä-mRNAs müssen mehrere Verarbeitungsschritte durchlaufen, bevor sie übersetzt werden können. Auch eukaryotische (und prokaryotische) tRNAs und rRNAs werden prozessiert, bevor sie als Komponenten in der Proteinsynthesemaschinerie fungieren können.

MRNA-Verarbeitung

Die eukaryotische Prä-mRNA durchläuft eine umfangreiche Verarbeitung, bevor sie translatiert werden kann. Die zusätzlichen Schritte der eukaryotischen mRNA-Reifung erzeugen ein Molekül mit einer viel längeren Halbwertszeit als eine prokaryontische mRNA. Eukaryotische mRNAs halten mehrere Stunden, während die typischen E coli mRNA dauert nicht länger als fünf Sekunden.

Die drei wichtigsten Schritte der Prä-mRNA-Prozessierung sind das Hinzufügen von stabilisierenden und signalgebenden Faktoren an den 5'- und 3'-Enden des Moleküls und das Entfernen von dazwischenliegenden Sequenzen, die die entsprechenden Aminosäuren nicht angeben.

5′ Kappen

Eine Kappe wird durch eine Phosphatbindung an das 5'-Ende des wachsenden Transkripts angefügt. Dieser Zusatz schützt die mRNA vor Abbau. Darüber hinaus erkennen Faktoren, die an der Proteinsynthese beteiligt sind, die Kappe, um die Translation durch Ribosomen zu initiieren.

3′ Poly-A-Schwanz

Sobald die Elongation abgeschlossen ist, fügt ein Enzym namens Poly-A-Polymerase eine Kette von ungefähr 200 A-Resten hinzu, die als bezeichnet wird Poly-A-Schwanz zur Prä-mRNA. Diese Modifikation schützt die prä-mRNA weiter vor Abbau und signalisiert den Export der zellulären Faktoren, die das Transkript benötigt, in das Zytoplasma.

Prä-mRNA-Spleißen

Eukaryotische Gene bestehen aus Exons, die proteinkodierenden Sequenzen entsprechen (Ex-on bedeutet, dass sie Exgedrückt) und intervening sequenzen genannt Introns (intron bezeichnet ihre intdienende Rolle), die während der Verarbeitung aus der prä-mRNA entfernt werden. Intronsequenzen in mRNA kodieren keine funktionellen Proteine.

Alle Introns einer Prä-mRNA müssen vor der Proteinsynthese vollständig und präzise entfernt werden. Wenn der Prozess auch nur um ein einziges Nukleotid fehlschlägt, würde sich der Leserahmen der wieder zusammengefügten Exons verschieben und das resultierende Protein wäre dysfunktional. Der Vorgang des Entfernens von Introns und des Wiederverbindens von Exons wird als . bezeichnet Spleißen (Figur 3).

Übungsfrage

Abbildung 3. Prä-mRNA-Spleißen beinhaltet die präzise Entfernung von Introns aus dem primären RNA-Transkript. Der Spleißprozess wird durch Proteinkomplexe, die Spleißosomen genannt werden, katalysiert, die aus Proteinen und RNA-Molekülen, den snRNAs, bestehen. Spleißosomen erkennen Sequenzen am 5'- und 3'-Ende des Introns.

Fehler beim Spleißen werden mit Krebs und anderen menschlichen Krankheiten in Verbindung gebracht. Welche Mutationen können zu Spleißfehlern führen?


Nein, wirklich, mRNA-Impfstoffe werden Ihre DNA nicht beeinflussen

Die Kurzversion: Es gibt keine plausible Möglichkeit, dass mRNA-Impfstoffe Ihre DNA verändern. Es würde im Grunde alles verletzen, was wir über die Zellbiologie wissen.

In letzter Zeit habe ich einen Zustrom von Fragen erhalten, wie wir wirklich sicher sein können, dass mRNA-Impfstoffe unsere DNA nicht beeinträchtigen. In meinem vorherigen Post zu diesem Thema habe ich geschrieben:

Ein weiteres Anliegen war die Idee, dass mRNA das Genom des Wirts irgendwie verändern kann. Das wäre eigentlich super cool und riesig für die Gentherapie (und ich könnte mir endlich die riesigen Fledermausflügel geben, die ich mir immer gewünscht habe), aber dem ist nicht so. Dies ist normalerweise unmöglich, es sei denn, es ist auch ein Reverse-Transkriptase-Enzym vorhanden, das DNA aus der RNA-Matrize produziert, wie Retroviren funktionieren. Bei keinem mRNA-Impfstoffkandidaten besteht ein solches Risiko. mRNA-Impfstoffe wirken vollständig im Zytosol der Zelle – sie gelangen nicht in die Nähe des Zellkerns, in dem sich die gesamte DNA befindet. Das ist tatsächlich ein großer Vorteil von RNA-basierten Impfstoffen gegenüber DNA-Impfstoffen.

Ich habe diese Antwort zum großen Teil gegeben, weil ich der Meinung war, dass die detaillierte Diskussion der reversen Transkription, des Zellkernhandels, des endozytischen Signalwegs und der anderen etwa 11 fortgeschrittenen zellbiologischen Themen, die ich anführen müsste, um eine rigorose Antwort zu geben, zu komplex war für den Durchschnittsmenschen von Vorteil sein, der einfach wissen möchte, ob dies möglich ist oder nicht. Ich hatte jedoch eine Flut von Fragen zu „Was wäre wenn“ in Bezug auf Retroviren oder Hepadnaviren (Hepatitis B), und ich kann zugeben, dass diese Antwort nicht darauf eingeht, daher werde ich hier versuchen, dies explizit und mit minimaler Komplexität zu beantworten wie ich fähig bin.

Um die Diskussion zu vereinfachen, um nicht die Phasen von Phospholipid-Doppelschichten und die molekulare Zusammensetzung des Lipid-Nanopartikels in Bezug auf die Stabilität erklären zu müssen (besprochen in 1, 2, 3, 4), bitte ich die Leser, davon auszugehen, dass mRNA Impfstoffe werden endozytiert und (und dies) in das Zytoplasma der Zelle freigesetzt.

Damit mRNA Ihre DNA beeinflussen kann, müssen wir zunächst mindestens feststellen, dass sie Zugang zu der fraglichen DNA erhalten muss. Es gibt zwei subzelluläre Kompartimente, in denen dies erreicht werden kann. Der erste ist der Nukleus. Beginnen wir also mit einer Diskussion über den Warenschmuggel im Nukleus. Der Zellkern ist ein isoliertes Kompartiment mit Porenkomplexen (NPCs), die der Größe der Partikel, die frei eintreten können, Grenzen setzen. RNA wird leicht nach außen transportiert, da die Transkription innerhalb des Zellkerns stattfindet, aber die zur Produktion von Proteinen erforderlichen Ribosomen befinden sich im Zytosol oder auf dem rauen endoplasmatischen Retikulum. Dieser Prozess wird durch mehrere akzessorische Proteine ​​vermittelt, die Sie links sehen können. Beachten Sie jedoch, dass es keinen physiologischen Umstand gibt, in dem RNA aus dem Zytosol zum Zellkern zurücktransportiert werden muss. RNA wird im Zellkern synthetisiert. Viren, die in ihrem Replikationszyklus eine Kernphase haben, müssen verschiedene Tricks anwenden, um ihre RNA-Nutzlast eindringen zu lassen. Obwohl RNA nicht ohne weiteres in Zellen transportiert wird, können Proteine ​​dies sein. Dies geschieht über ein Netzwerk von Proteinen, die Importine genannt werden (siehe Abbildung 5–23C oben). Proteine, die eine Aminosäuresequenz enthalten, die als Kernlokalisationssequenz bezeichnet wird (NLS gibt es 2 häufige) sind in der Lage, die Importine zu binden, die sie dann wie links gezeigt durch den Kernporenkomplex transportieren können. RNA-Viren haben oft Replikationszyklen, die keinen Zugang zum Zellkern erfordern, aber es gibt einige Ausnahmen. Influenzaviren sind beispielsweise RNA-Viren, deren Genome mit Ribonukleoproteinen assoziiert sind, und diese Ribonukleoproteine ​​exprimieren Kernlokalisierungssignale, die den Eintritt ihrer genomischen RNA in den Zellkern erleichtern. mRNA-Impfstoffe hingegen sind mit keinen Proteinen assoziiert. Im Zytosol ist die mRNA nackt und der rauen Umgebung von Ribosomen und Exonukleasen ausgesetzt, die die mRNA innerhalb von Stunden (höchstens) zerstören. Es gibt keinen vorstellbaren Mechanismus, durch den mRNA spontan in den Zellkern transportiert werden kann. Da es aus Nukleotiden besteht, kann es keine nukleäre Lokalisierungssequenz enthalten.

Das andere relevante Kompartiment wäre das Mitochondrium. Mitochondrien sind eigentlich rudimentäre Bakterien mit ihren eigenen Genomen, und es wird angenommen, dass vor Milliarden von Jahren ein uraltes Bakterium versuchte, den Vorfahren der Mitochondrien zu verzehren, aber nicht die Maschinerie hatte, um die Verdauung tatsächlich durchzuführen, und die beiden gingen eine symbiotische Beziehung ein. Since that instance, the mitochondria have been an essential feature of our cell’s biologies. This allowed the mitochondria to develop an extremely reduced genome containing only 37 genes (most of the genes relevant to mitochondrial function are still in the nucleus). Mitochondria have their own ribosomes and even their own genetic code (sort of). There is also a specialized process for the clearance of diseased mitochondria called mitophagy, which is the subject of many excellent reviews e.g. this, this, and this.

The collective conclusion from our understanding of these biological process is that a naked mRNA in the cytosol has no potential to end up in a cellular compartment that contains our own DNA means that, irrespective of the presence or absence of other factors, there is no chance of harm to the DNA from the mRNA vaccine. But still people wanted to ask me about reverse transcriptases so let’s discuss those.

The process of going from RNA to DNA (the exact opposite of what the central dogma of molecular biology dictates) is known as reverse transcription, and it is carried out with an enzyme called a reverse transcriptase (which are a really interesting group of enzymes). In general, reverse transcription is performed by a few different genetic entities: retroviruses, hepadnaviruses, telomeres, und retrotransposons. These are worth defining.

  • Retroviruses are viruses who have an RNA genome, from which they create a DNA copy through reverse transcription that then integrates into the cell of the host (by which I mean, literally inserts itself into the host cell’s genome and becomes a permanent part of it, in the form of a sequence called a provirus). The proviral sequence itself can then be transcribed in the host cell to produce viral proteins and particles that can go on to spread to the next cell. The most famous retrovirus is HIV-1.
  • Hepadnaviruses are DNA viruses which have gapped genomes (there is one complete DNA strand and another partial DNA strand which is linked to a pregenomic RNA), and unlike retroviruses, do not integrate into the genome of the host cell they infect. The most famous example is Hepatitis B virus, for which multiple effective vaccines exist.
  • Telomeres are structures present at the ends of human chromosomes which are maintained by a protein complex called telomerase that uses a reverse transcriptase called TERT to maintain them. The reasons this is necessary are discussed in Figure 9–12 on the left. They are about 5–15 kilobases long normally, and shortening results in arrest of cell growth and replication (senescence), or can even trigger cell death by apoptosis.
  • Retrotransposons are actually the most abundant component of our genome. The human genome contains about 21,000–27,000 genes (the number you get depends on how precisely you define a gene and which source you consult), which span 40–48 million base pairs, but this accounts for only about 1.5% of the 3.2 billion total base pairs. Retrotransposons account for about 2 billion base pairs. There are several kinds of retroelements, which are worth discussing further:

  1. SINEs (short interspersed nuclear elements) which encode short transcripts like tRNAs, and cannot function without a LINE-encoded protein.
  2. LINEs (long interspersed nuclear elements) which encode a reverse transcriptase formed from the ORF1 and pol genes which can copy itself and other LINE and SINE elements into other regions of the genome.
  3. About 5–8% of the human genome is also composed of human endogenous retroviruses, HERVs, which also fall into the category of retrotransposons, more specifically LTR (long terminal repeats) retrotransposons (more on this shortly). HERVs contain 3 genes: gag (“group antigens,” which encodes a polyprotein that is cleaved into the structural proteins of the resultant retrovirus), pol (the reverse transcriptase needed for the virus to replicate), and env (envelope, which encodes the protein that gives the viral particles their shape).
  4. More broadly, the term retroelement refers to genetic sequences that have moved from one region of the genome to another via reverse transcription, and these include retrotransposons, and processed pseudogenes. Processed pseudogenes refer to the sequences of processed mRNA that lack introns that have been inserted via reverse transcription (we know they had to be inserted into the genome via reverse transcription in large part because they lack introns). They are incapable of producing any gene product.
  5. The only retrotransposons that can move through the genome (literally copy their DNA to new sites where it was not initially present) are the LINEs and SINEs, and of these, only a few are able to accomplish this. HERVs are stuck where they are, and processed pseudogenes are as well.

Telomerases evolved as a solution to the end replication problem. Nascent (new) DNA strands are synthesized with a leading strand and a lagging strand because the DNA polymerases have a very restricted directionality in that they must travel 3’ to 5’ with respect to the template strand. This creates a problem because the DNA is oriented antiparallel (the strands are parallel but one strand is oriented in the direction opposite to the other), so to make both strands at the same time, a single DNA polymerase would have to manage to concurrently travel what would be a Sisyphean length for it in opposite directions (imaging trying to simultaneously run east and west for 10 miles). To deal with this dilemma, one of the strands is synthesized as a leading strand with a polymerase traveling down the strand uninterrupted for many nucleotides (formally the term is “processively”), and a lagging strand in which fragments of DNA (called Okazaki fragments) are consistently generated that are complementary to the other strand that get ligated (fused) together. The dilemma is that because our chromosomes are not circular, there will always be a missing fragment once we reach the 3’ end of the chromosome, and thus each replication cycle of the DNA will cause the size of the genome to shrink, eventually with the potential to hit genes important for biological function. This is known as the end replication problem.

To your left you see a telomerase complex with its favorite telomerase RNA. The ends of the chromosome contain structures called telomeres, which are repetitive, short, palindromic sequences that get copied many times, until the gaps between the strands are filled for a length of about 5000 to 15000 nucleotides. The production of telomeric DNA occurs via a large protein complex called telomerase, which makes use of TERT (telomerase reverse transcriptase), a reverse transcriptase that takes an RNA template to make the palindromic DNA sequences. Importantly, cells eventually do lose their telomerase function, which is thought to represent a safeguard against cancer (cells that express telomerase at high levels can continue dividing- and therefore accumulating mutations, some of which might be harmful- indefinitely, and thus in most cells after about 50 divisions, the cells will cease to divide telomerase is notably expressed at high levels in stem cells). In practice, mice which have no functional telomerase will have substantial chromosomal shortening within 3 generations and by the fourth generation end up unable to reproduce. Here now, I have to shatter all your preconceived ideas about how RNA works. When speaking about DNA and RNA, we have a tendency to use the term “strand” which conjures up an image of a thread. The thread is relatively linear, it may curve, but the structure is relatively boring. This is a reasonable approximation of most DNA, as DNA can have basically one of 3 structures called A, B, and Z (there are rarer ones though such as i-motifs, and DNAzymes can do weird things). RNA on the other hand, is a much freer spirit when it comes to structure. RNA folds into complex shapes with all sorts of structural motifs in a manner not dissimilar to proteins, in that the structure of a protein relates directly to its function. What this means is: specific RNAs do specific things depending on how they fold, which depends on their sequence. To your right you can see a detailed diagram of telomerase RNA bound to the telomerase complex. That curvy thing with bars like a ladder and bubbles is the telomerase RNA. TERT, the reverse transcriptase of telomerase, binds the telomerase RNA at the core domain and a region called CR4/CR5. I won’t get into the other components of the complex but you can read in detail about how it works here and here. Immediately below the diagram to your right you can see how telomerase works to extend the 3’ cap of the chromosome through the aid of a repetitive, palindromic RNA sequence: CAAUCCCAAUC, which reproduces on the DNA a repeating “GGGTTA” to form a telomere with a length of about 5,000–15,000 nucleotides. For this to work, a bunch of things have to go right but solely for TERT to be able to recognize telomerase RNA there needs to be: the template for reverse transcription (the palindromic sequence CCCAAU), the pseudoknot domain (the core domain in the diagram), a stem–loop that interacts with TERT (CR4/CR5), and a 3′ element required for RNA stability (CR7). This is a very specific set of constraints and mRNA vaccines would have to be designed to have them (see image above for standard organization of an mRNA vaccine). Ribosomes also have intrinsic mRNA helicase activity that destroys such structures so that they can be read and processed for the synthesis of a protein. Additionally, the mature human telomerase RNA is 451 nucleotides in length. The mRNA from these vaccines is approximately 1200–1300 nucleotides long. It is too large to function as a telomerase RNA in humans (there are some animals which have telomerase RNAs of that size but we are not one of them) and given how precisely the telomerase RNA must fold, it is unlikely to assume the required structures for recognition and binding of the telomerase.

I initially considered discussing in detail the reverse transcriptases of the hepadnaviruses (i.e. hepatitis B) and retroviruses (i.e. HIV and HERVs) but the discussion quickly became inaccessible. Suffice it to say, reverse transcriptases are not capable of picking up any random RNA and generating a DNA from it. They require an RNA sequence to prime the reaction. For retroviruses, there is a tRNA that is stolen from the host cell and packaged into the virion. Furthermore, in the retroviruses, reverse transcription occurs within a nucleocapsid which allows dNTPs (the building blocks of DNA) in, but cannot permit something as large as an entirely separate RNA molecule spanning about 1200 bases. Reverse transcription by hepadnaviruses is similar in principle, requiring a pregenomic RNA segment that is chemically linked to the DNA of the hepadnavirus. Reverse transcription will not occur spontaneously with just any RNA. Even for RT-PCR reactions, the reaction requires the binding of an oligodeoxythymidine sequence to the polyA tail of the mRNA in question. Additionally, there’s a secondary requirement here to be able to “change” the DNA of the host: to actually manipulate it in some way. In the case of the hepadnaviruses this doesn’t really happen. The hepadnavirus genome gets into the nucleus and forms a covalently closed circular DNA with its own associated histones, essentially a small, separate chromosome. It doesn’t touch the host’s DNA. In the case of retroviruses, the DNA gets integrated into the host chromosome, and the effect depends on where it gets integrated. HIV for example has a strong bias for inserting itself into genes, which can be problematic if, for example, the gene produces a protein important for the maintenance of genome integrity (which could lead to cancer if left unchecked). The development of cancer from such a process however, cannot simply occur without many other things going wrong, like for instance a massive death of helper T cells that critically impairs the ability of the immune system to conduct surveillance of cells for evidence of malignancy and kill them, as happens in HIV. Now, should we choose to ignore everything thus far established about how cell biology works, including the need for a primer to initiate the reverse transcriptase reaction, and allow that a retrovirus readily permits integration of the resultant spike protein RBD or entire spike protein gene into the host, this would simply lead to the insertion of a gene that may be able to make the spike protein or just the RBD (depending on where it inserted and whether it could recruit transcriptional machinery), which would only serve to present to the immune system a foreign protein that it has been primed to respond against, and subsequently kill the cell. Also, as they are being delivered by an intramuscular injection, the cells in question would most likely be a muscle cell (which you can lose without loss of any eloquent function) or a dendritic cell (which you could also lose without any loss of significant immunological function).

To conclude, and I really hope this ends it:


Structure and Function of Transcriptional Activators

Because transcription factors are central to the regulation of gene expression, understanding the mechanisms of their action is a major area of ongoing research in cell and molecular biology. The most thoroughly studied of these proteins are transcriptional activators, which, like Sp1, bind to regulatory DNA sequences and stimulate transcription. In general, these factors have been found to consist of two domains: One region of the protein specifically binds DNA the other activates transcription by interacting with other components of the transcriptional machinery (Figure 6.26). Transcriptional activators appear to be modular proteins, in the sense that the DNA binding and activation domains of different factors can frequently be interchanged using recombinant DNA techniques. Such manipulations result in hybrid transcription factors, which activate transcription by binding to promoter or enhancer sequences determined by the specificity of their DNA-binding domains. It therefore appears that the basic function of the DNA-binding domain is to anchor the transcription factor to the proper site on DNA the activation domain then independently stimulates transcription by interacting with other proteins.

Figure 6.26

Structure of transcriptional activators. Transcriptional activators consist of two independent domains. The DNA-binding domain recognizes a specific DNA sequence, and the activation domain interacts with other components of the transcriptional machinery. (more. )

Many different transcription factors have now been identified in eukaryotic cells, as might be expected, given the intricacies of tissue-specific and inducible gene expression in complex multicellular organisms. Molecular characterization has revealed that the DNA-binding domains of many of these proteins are related to one another (Figure 6.27). Zinc finger domains contain repeats of cysteine and histidine residues that bind zinc ions and fold into looped structures (𠇏ingers”) that bind DNA. These domains were initially identified in the polymerase III transcription factor TFIIIA but are also common among transcription factors that regulate polymerase II promoters, including Sp1. Other examples of transcription factors that contain zinc finger domains are the steroid hormone receptors, which regulate gene transcription in response to hormones such as estrogen and testosterone.

Figure 6.27

Families of DNA-binding domains. (A) Zinc finger domains consist of loops in which an α helix and a β sheet coordinately bind a zinc ion. (B) Helix-turn-helix domains consist of three (or in some cases four) helical regions. One helix (more. )

Die helix-turn-helix motif was first recognized in prokaryotic DNA-binding proteins, including the E. coli catabolite activator protein (CAP). In these proteins, one helix makes most of the contacts with DNA, while the other helices lie across the complex to stabilize the interaction. In eukaryotic cells, helix-turn-helix proteins include the homeodomain proteins, which play critical roles in the regulation of gene expression during embryonic development. The genes encoding these proteins were first discovered as developmental mutants in Drosophila. Some of the earliest recognized Drosophila mutants (termed homeotic mutants in 1894) resulted in the development of flies in which one body part was transformed into another. For example, in the homeotic mutant called Antennapedia, legs rather than antennae grow out of the head of the fly (Figure 6.28). Genetic analysis of these mutants, pioneered by Ed Lewis in the 1940s, has shown that Drosophila contains nine homeotic genes, each of which specifies the identity of a different body segment. Molecular cloning and analysis of these genes then indicated that they contain conserved sequences of 180 base pairs (called homeoboxes) that encode the DNA-binding domains (homeodomains) of transcription factors. A wide variety of additional homeodomain proteins have since been identified in fungi, plants, and other animals, including humans. Vertebrate homeobox genes are strikingly similar to their Drosophila counterparts in both structure and function, demonstrating the highly conserved roles of these transcription factors in animal development.

Figure 6.28

The Antennapedia mutation. Antennapedia mutant flies have legs growing out of their heads in place of antennae. (A) Head of a normal fly. (B) Head of an Antennapedia Mutant. (Courtesy of F. Rudolf Turner, Indiana University.)

Two other families of DNA-binding proteins, leucine zipper and helix-loop-helix proteins, contain DNA-binding domains formed by dimerization of two polypeptide chains. The leucine zipper contains four or five leucine residues spaced at intervals of seven amino acids, resulting in their hydrophobic side chains being exposed at one side of a helical region. This region serves as the dimerization domain for the two protein subunits, which are held together by hydrophobic interactions between the leucine side chains. Immediately following the leucine zipper is a region rich in positively charged amino acids (lysine and arginine) that binds DNA. The helix-loop-helix proteins are similar in structure, except that their dimerization domains are each formed by two helical regions separated by a loop. An important feature of both leucine zipper and helix-loop-helix transcription factors is that different members of these families can dimerize with each other. Thus, the combination of distinct protein subunits can form an expanded array of factors that can differ both in DNA sequence recognition and in transcription-stimulating activities. Both leucine zipper and helix-loop-helix proteins play important roles in regulating tissue-specific and inducible gene expression, and the formation of dimers between different members of these families is a critical aspect of the control of their function.

The activation domains of transcription factors are not as well characterized as their DNA-binding domains. Some, called acidic activation domains, are rich in negatively charged residues (aspartate and glutamate) others are rich in proline or glutamine residues. These activation domains are thought to stimulate transcription by interacting with general transcription factors, such as TFIIB or TFIID, thereby facilitating the assembly of a transcription complex on the promoter. For example, the activation domains of several transcription factors (including Sp1) have been shown to interact with TFIID by binding to TBP-associated factors (TAFs) (Figure 6.29). An important feature of these interactions is that different activators can bind to different general transcription factors or TAFs, providing a mechanism by which the combined action of multiple factors can synergistically stimulate transcription𠅊 key feature of transcriptional regulation in eukaryotic cells.

Figure 6.29

Synergistic action of transcriptional activators. Different transcriptional activators can interact with the general transcription factor TFIID by binding to different TAFs.


Transkription

Transcription is the process of producing a strand of RNA from a strand of DNA. Similar to the way DNA is used as a template in DNA replication, it is again used as a template during transcription. The information that is stored in DNA molecules is rewritten or ‘transcribed’ into a new RNA molecule.

Sequence of nitrogenous bases and the template strand

Each nitrogenous base of a DNA molecule provides a piece of information for protein production. A strand of DNA has a specific sequence of bases. The specific sequence provides the information for the production of a specific protein.

Through transcription, the sequence of bases of the DNA is transcribed into the reciprocal sequence of bases in a strand of RNA. Through transcription, the information of the DNA molecule is passed onto the new strand of RNA which can then carry the information to where proteins are produced. RNA molecules used for this purpose are known as messenger RNA (mRNA).

A gene is a particular segment of DNA. The sequence of bases in for a gene determines the sequence of nucleotides along an RNA molecule.

Only one strand of a DNA double helix is transcribed for each gene. This strand is known as the ‘template strand’. The same template strand of DNA is used every time that particular gene is transcribed. The opposite strand of the DNA double helix may be transcribed for other genes.

RNA-Polymerase

An enzyme called ‘RNA polymerase’ is responsible for separating the two strands of DNA in a double helix. As it separates the two strands, RNA polymerase builds a strand of mRNA by adding the complementary nucleotides (A, U, G, C) to the template strand of DNA.

A specific set of nucleotides along the template strand of DNA indicates where the gene starts and where the RNA polymerase should attach and begin unravelling the double helix. The section of DNA or the gene that is transcribed is known as the ‘transcription unit’.

Rather than RNA polymerase moving along the DNA strand, the DNA moves through the RNA polymerase enzyme. As the template strand moves through the enzyme, it is unravelled and RNA nucleotides are added to the growing mRNA molecule.

As the RNA molecule grows it is separated from the template strand. The DNA template strand reforms the bonds with its complementary DNA strand to reform a double helix.

In prokaryotic cells, such as bacteria, once a specific sequence of nucleotides has been transcribed then transcription is completed. This specific sequence of nucleotides is called the ‘terminator sequence’.

Once the terminator sequence is transcribed, RNA polymerase detaches from the DNA template strand and releases the RNA molecule. No further modifications are required for the mRNA molecule and it is possible for translation to begin immediately. Translation can begin in bacteria while transcription is still occurring.

Modification of mRNA in eukaryotic cells

Creating a completed mRNA molecule isn’t quite as simple in eukaryotic cells. Like prokaryotic cells, the end of a transcription unit is signalled by a certain sequence of nucleotides. Unlike prokaryotic cells, however, RNA polymerase continues to add nucleotides after transcribing the terminator sequence.

Proteins are required to release the RNA polymerase from the template DNA strand and the RNA molecule is modified to remove the extra nucleotides along with certain unwanted sections of the RNA strand. The remaining sections are spliced together and the final mRNA strand is ready for translation.

In eukaryotic cells, transcription of a DNA strand must be complete before translation can begin. The two processes are separated by the membrane of the nucleus so they cannot be performed on the same strand at the same time as they are in prokaryotic cells.

Rate of transcription

If a certain protein is required in large numbers, one gene can be transcribed by several RNA polymerase enzymes at one time. This makes it possible for a large number of proteins to be produced from multiple RNA molecules in a short time.


Can translation ever occur without transcription? - Biologie

In transcription, the strand of DNA that is used to synthesize mRNA is known as the template strand. Whereas, the non-template or coding strand matches the sequence of the RNA. However, it doesn’t match it exactly as RNA has uracil (U) instead of thymine (T). The nucleotides of RNA are known as ribonucleotides. These nucleotides bond to the template strand via hydrogen bonds after the DNA molecule opens up. And then those nucleotides are bonded together with a phosphodiester bond just like DNA is bonded.

RNA is an enzyme that synthesizes RNA from the template strand of DNA. And it happens a lot like DNA polymerase, except for the the fact that it does not require a primer before transcription begins Bacteria have a single RNA polymerase, whereas Eukaryotes have three different enzymes.

Initiation of Transcription

Transcription is initiated by the attachment of a protein known as a sigma. The sigma attaches to one strand of the DNA (the template strand) at a very specific location. In bacteria, several sigmas exists and each one initiates the transcription of a specific sequence of DNA (or gene). Once this sigma protein attaches to the DNA molecule, it serves to guide the RNA polymerase down the template strand. The sigma protein recognizes and binds to what is deemed the promoter sequence. The promoter sequence is a specific group of base pairs. Once the sigma binds to the DNA, transcription begins. There are several different sigmas. Each one is unique and initiates the synthesis of a specific gene, or in some cases several different genes. While there are several sigmas, each for different gene complexes, RNA Polymerase is the same molecule that connects to all the different sigmas. RNA Polymerase adds ribonucleotides to the template strand based on complementary base pairing, generating an mRNA.

The sigma protein first opens DNA’s double helix at the promoter section of the DNA strand. Then the template strand of the DNA is threaded through the RNA polymerase. Incoming RNA nucleotides come through a channel in the sigma protein and pairs with the complementary bases of the DNA’s template strand. At this point the RNA polymerase is functional and the begins to work. And once that happens the sigma disconnects from the DNA chain. This defines the beginning of the elongation phase of transcription.

Once the appropriate sigma is attached, RNA Polymerase attaches to the sigma protein. After successful attachment, the sigma guides the DNA into place inside of the RNA Polymerase. As the DNA is thread through the RNA Polymerase, hydrogen bonds are split between the the DNA molecule, by a zipper. Once DNA is inserted in to RNA Polymerase, ribonucleotides enter an entrance portal into the RNA Polymerase and match up with the D-nucleotides based on complementary base pairing. Similar to DNA base pairing, cytosine-containing deoxyribonucleotides (D-cytosine) pair with guanine containing ribonucleotides (R-guanine), D-guanine pairs with R-cytosine, and D-thymine pairs with R-adenine. Different from DNA base pairing, D-adenine pairs with R-uracil. Through another portal in the RNA Polymerase, emerges the developing mRNA. Once a few ribonucleotides are synthesized by RNA Polymerase, the sigma protein is removed. Once the sigma is removed, it can be reused to initiate transcription.

Elongation of Transcription

Elongation in transcription is fairly straight forward. The RNA polymerase zips along the open DNA molecule matching up complementary RNA base pairs from the template strand of the open DNA. After the sigma is removed, RNA Polymerase continues to unzip template and coding strands of the the DNA, and R-nucleotides are bonded via phosphodiester linkages using the code provided by the template strand of DNA. The incoming DNA enters into an intake portal and is unzipped by a zipper. As the DNA passes the zipper, the hydrogen bonds reattach between the coding and template strand and the DNA double helix leaves through an exit portal. Ribonucleotides enter in through another intake portal and are combined via complementary base pairing to the template strand of DNA. The R-nucleotides are bonded together via phosphodiester linkages. Ribonucleotides are continuously added to the 3’ end of the developing RNA strand. The 5’ end of the RNA strand leaves through another exit portal of the RNA Polymerase.

Termination of Transcription

In bacteria, once RNA Polymerase transcribes a specific sequence of ribonucleotides from the DNA template strand, transcription ends (or terminates). When this sequence is synthesized, a section of the RNA bends back on itself forms a short double helix based on complementary base pairing. This forms a RNA hairpin. This hairpin forces the RNA to separate from the DNA and the RNA Polymerase detaches and the opened DNA reattaches based on complementary base pairing

Transcription in Eukaryotes

Fundamentally, transcription in eukaryotes is similar to transcription in prokaryotes with a few exceptions. In bacteria, RNA Polymerase can synthesize any RNA molecule. In eukaryotes, there are three different RNA Polymerases (I, II, and III). RNA Polymerase I is primarily responsible for the synthesis of ribosomal RNA (rRNA), the molecule that makes up ribosomes. Most eukaryotic RNA Polymerase are RNA Polymerase II. RNA Polymerase II is responsible for synthesizing mRNA, making it the only RNA Polymerase capable of transcribing protein-coding genes. RNA Polymerase III is responsible for synthesizing transfer RNA (tRNA). During translation, tRNAs read the messages from the mRNA and link a specific amino acid sequence generating proteins.

Where bacterial transcription is initiated by a sigma protein, RNA Polymerases in eukaryotes require a group of proteins known as basal transcription factors. Like sigma in prokaryotes, once the basal transcription factors attach to the DNA, its respective RNA Polymerase attaches and transcription begins. The elongation process is virtually identical in prokaryotes and eukaryotes. However, termination of transcription differs between prokaryotes and eukaryotes. In eukaryotes, a short sequence in the DNA signals the attachment of an enzyme downstream of active transcription. This enzyme cuts the emerging RNA, leaving the RNA Polymerase.

In eukaryotes, pre-RNA is made up of regions of mRNA that code for amino acids (known as exons) and regions of mRNA that don’t code for amino acids. Before the mRNA can be functional the introns must be removed in a process known as RNA splicing, or post-transcriptional modification.

Post-transcriptional modification of mRNA in eukaryotes

In bacteria, transcription from DNA to mRNA is a direct pathway. However in eukaryotes once mRNA is synthesized by RNA Polymerase II, the mRNA goes through further modification (Fig. 11). The product following transcription is known as a primary transcript (or pre-mRNA). Before mRNA travels outside the nucleus, the mRNA is shortened by cutting out specific sections of mRNA and reattaching the remaining sections back together. This process is known as RNA splicing and the resulting, modified mRNA is known as mature mRNA. Segments of the mRNA that are respliced back together are known as exons (because they exit the nucleus) while the segments of mRNA that are removed from the pre-mRNA are known as introns. The exons (which collectively make up the mature mRNA) leave the nucleus through a nuclear pore and travel to a ribosome in the cytosol and begin the process of translation.

RNA splicing is processed by hybrid protein-RNA complexes known as small nuclear ribonucleoproteins (or snRNPs). RNA splicing begins when a primary snRNP binds to a guanine R-nucleotide (G) adjacent to an uracil R-nucleotide (U) at the 5’ end of the pre-mRNA. This marks the exon-intron boundary. Another secondary snRNP reads from 5’ to 3’ down the mRNA and when it comes in contact with an adenine (A), and it attaches at that point. This point represents the intron-exon boundary. Once the primary and secondary snRNPs are attached other snRNPS attach to those, in a complex known as a spliceosome. Collectively the spliceosome breaks the G-U bond of the primary snRNP and the bond between the adenine (A) of the secondary snRNP and its adjacent R-nucleotide. Since U and A are complementary bases, the spliceosomes places them in close contact with each other, generating an intron loop. Nucleotides of the intron loop are disassembled into their monomers, ribonucleotides, and are recycled for future transcriptional events. Exons are spliced back together generating a mature mRNA.


28.2.6. Enhancer Sequences Can Stimulate Transcription at Start Sites Thousands of Bases Away

The activities of many promoters in higher eukaryotes are greatly increased by another type of cis-acting element called an enhancer. Enhancers' sequences have no promoter activity of their own yet can exert their stimulatory actions over distances of several thousand base pairs. They can be upstream, downstream, or even in the midst of a transcribed gene. Moreover, enhancers are effective when present on either DNA strand (equivalently, in either orientation). Enhancers in yeast are known as upstream activator sequences (UASs).

A particular enhancer is effective only in certain cells. For example, the immunoglobulin enhancer functions in B lymphocytes but not elsewhere. Cancer can result if the relation between genes and enhancers is disrupted. In Burkitt lymphoma and B-cell leukemia, a chromosomal translocation brings the proto-oncogene myc (a transcription factor itself) under the control of a powerful immunoglobin enhancer. The consequent dysregulation of the myc gene is believed to play a role in the progression of the cancer.

Transcription factors and other proteins that bind to regulatory sites on DNA can be regarded as passwords that cooperatively open multiple locks, giving RNA polymerase access to specific genes. The discovery of promoters and enhancers has opened the door to understanding how genes are selectively expressed in eukaryotic cells. The regulation of gene transcription, discussed in Chapter 31, is the fundamental means of controlling gene expression.

In Absprache mit dem Verlag ist dieses Buch über die Suchfunktion zugänglich, jedoch nicht durchsuchbar.


Where Does Transcription Occur in a Prokaryotic Cell

Prokaryotic cells are the primitive ones that lack a nucleus. This is the reason why the entire process of protein synthesis in such cells takes place in the cytoplasm. The transcription and translation is done alongside simultaneously. The process is nearly the same as in eukaryotes, but the only difference is the location where it takes place. The eukaryotes have a membrane bound nucleus. Hence, the ribosomes do not reach the mRNA to carry on the translation process. But in the prokaryotes, the ribosome is easily available in the cytoplasm, and hence, both the processes take place simultaneously.

Transcription process in prokaryotes can be divided into three stages – initiation, elongation, and termination. In initiation, the RNA polymerase binds to the sigma factor to form holoenzyme. This enzyme recognizes the promoter region in the DNA to form a closed complex. The RNA then starts proceeding towards the elongation stage. Thus, the RNA transcript increases in length. Then finally, in the termination stage, the RNA polymerase pauses, and the mRNA molecule is terminated from the DNA molecule.

Protein synthesis is an important function of the cell, and hence, an important part of DNA research and studies.

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