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6B: Kinetik einfacher und enzymkatalysierter Reaktionen - Biologie


Lernziele

  • Schreiben Sie geeignete chemische und Differentialgleichungen für die Geschwindigkeit des Verschwindens von Reaktanten oder das Auftreten von Produkten für 1. Ordnung, pseudo 1. Ordnung, 2. Ordnung, reversible 1. Ordnung
  • Graphen für integrierte Geschwindigkeitsgleichungen (die Reaktanten- oder Produktkonzentrationen als Funktion der Zeit zeigen) und Anfangsgeschwindigkeitsgleichungen (die die Anfangsgeschwindigkeit vo als Funktion des Reaktanten zeigen) zeichnen und interpretieren;
  • kinetische Geschwindigkeitskonstanten aus Daten und Graphen von integrierten Geschwindigkeits- und Anfangsgeschwindigkeitsgleichungen ableiten;
  • schreiben Sie geeignete chemische Differentialgleichungen und Anfangsgeschwindigkeitsgleichungen für die Geschwindigkeit des Verschwindens von Reaktanten oder das Auftreten von Produkten für eine einfache enzymkatalysierte Reaktion;
  • zwischen schnellen und stationären Annahmen unterscheiden;
  • vereinfachen Sie die anfängliche Geschwindigkeitsgleichung, die Geschwindigkeitskonstanten für enzymkatalysierte Reaktionen enthält, um die Geschwindigkeitskonstanten durch kcat und KM zu ersetzen, und geben Sie operative und mathematische Definitionen dieser Konstanten an;

Enzyme sind hochspezifische Katalysatoren für biochemische Reaktionen, wobei jedes Enzym eine Selektivität für einen einzelnen Reaktanten aufweist, oder Substrat. Beispielsweise katalysiert das Enzym Acetylcholinesterase den Abbau des Neurotransmitters Acetylcholin zu Cholin und Essigsäure. Viele Enzym-Substrat-Reaktionen folgen einem einfachen Mechanismus, der aus der anfänglichen Bildung eines Enzym-Substrat-Komplexes (ES) besteht, der sich anschließend zu einem Produkt zersetzt und das Enzym zur erneuten Reaktion freisetzt.

Abbildung (PageIndex<1>): Ein Enzym katalysiert die Reaktion zweier Substrate zu einem Produkt. aus Wikipedia.

Dies wird im folgenden mehrstufigen Mechanismus beschrieben

wobei (k_1), (k_<&ndash1>), (k_2) und (k_<&ndash2>) Geschwindigkeitskonstanten sind. Das Reaktionsgeschwindigkeitsgesetz zur Erzeugung des Produkts ([P]) ist

Wenn wir jedoch früh in der Reaktion messen, ist die Konzentration der Produkte vernachlässigbar, d.

und wir können die Rückreaktion ignorieren (zweiter Term auf der rechten Seite von Gleichung ( ef<13.21A>)). Dann ist unter diesen Bedingungen die Reaktionsgeschwindigkeit

Um analytisch nützlich zu sein, müssen wir Gleichung ( ef<13.21>) in Bezug auf die Reaktanten (z. B. die Konzentrationen von Enzym und Substrat) schreiben. Dazu verwenden wir die stationäre Näherung, wobei wir annehmen, dass die Konzentration von (ES) im Wesentlichen konstant bleibt. Nach einer anfänglichen Phase, in der sich der Enzym-Substrat-Komplex zuerst bildet, ist die Geschwindigkeit, mit der sich (ES) bildet

ist gleich der Geschwindigkeit, mit der es verschwindet

wobei ([E]_0) die ursprüngliche Konzentration des Enzyms ist. Die Kombination der Gleichungen ( ef<13.22>) und ( ef<13.23>) ergibt

die wir nach der Konzentration des Enzym- und Substratkomplexes auflösen

wobei (K_m) das ist Michaelis konstant. Einsetzen der Gleichung ( ef) in Gleichung ( ef<13.21>) lässt uns mit unserer endgültigen Geschwindigkeitsgleichung.

Ein Diagramm der Gleichung ( ef), wie in Abbildung (PageIndex<1>) gezeigt, ist aufschlussreich, um Bedingungen zu definieren, unter denen wir die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion für die quantitative Analyse eines Enzyms oder Substrats verwenden können.

Abbildung (PageIndex<1>) : Diagramm der Gleichung ( ef) Grenzen für die Analyse von Substraten und Enzymen in einem enzymkatalysierten chemisch-kinetischen Analyseverfahren aufzeigen. Die Kurve im rot markierten Bereich folgt der Gleichung ( ef<13.27>) und die Kurve im grün markierten Bereich folgt der Gleichung ( ef).

Für hohe Substratkonzentrationen, wobei ([S] gg K_m), Gleichung ( ef) vereinfacht zu

wo (V_) ist die maximale Geschwindigkeit für die katalysierte Reaktion. Unter diesen Bedingungen ist die Reaktion im Substrat nullter Ordnung und wir können (V_) um die Enzymkonzentration zu berechnen, typischerweise unter Verwendung einer Methode mit variabler Zeit. Bei niedrigeren Substratkonzentrationen, wobei ([S] ll K_m), Gleichung ( ef) wird

Die Reaktion ist jetzt in Bezug auf das Substrat erster Ordnung, und wir können die Reaktionsgeschwindigkeit verwenden, um die Substratkonzentration nach einer Methode mit fester Zeit zu bestimmen.

Die Michaelis-Konstante (K_m) ist die Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist, und ist ein inverses Maß für die Affinität des Substrats für das Enzym&mdass ein kleiner (K_m) eine hohe Affinität anzeigt, was bedeutet, dass die Geschwindigkeit nähert sich (V_) schneller. Der Wert von (K_m) ist sowohl vom Enzym als auch vom Substrat sowie von Bedingungen wie Temperatur und pH-Wert abhängig.

Die Michaelis-Konstante (K_m) ist die Substratkonzentration, bei der die Reaktionsgeschwindigkeit halbmaximal ist.

Aus den letzten beiden Termen in Gleichung ( ef<13.27>) können wir (V_) in Bezug auf a Umsatzzahlen ((k_)):

wobei ([E]_0) die Enzymkonzentration ist und (k_) ist die Umsatzzahl, definiert als die maximale Anzahl von Substratmolekülen, die pro Enzymmolekül pro Sekunde in Produkt umgewandelt werden. Daher ist die Turnover-Zahl definiert als die maximale Anzahl chemischer Umwandlungen von Substratmolekülen pro Sekunde, die ein einzelnes katalytisches Zentrum bei einer gegebenen Enzymkonzentration ([E]_o) ausführt.

Beispiel (PageIndex<1>): Umsatz der Acetylcholinesterase

Acetylcholinesterase (AChE) ist möglicherweise eines der schnellsten Enzyme. Es hydrolysiert Acetylcholin zu Cholin und einer Acetatgruppe. Einer der frühesten Werte der Umsatzzahl war (3 imes 10^7) (Acetylcholinmoleküle) pro Minute pro Enzymmolekül. Ein neuerer Wert bei 25°C, pH = 7,0, Acetylcholinkonzentration von (2,5 x 10^<&minus3> M), wurde als (7,4 x 10^5 min^<&minus1>) gefunden ( J. Biol. Chem. J. Biol. 236 (8): 2292&ndash5. ).

Es können etwa 30 aktive Zentren pro Molekül vorhanden sein. AChE ist eine Serinhydrolase, die mit Acetylcholin nahe . reagiert die diffusionskontrollierte Rate. Eine diffusionskontrollierte Reaktion läuft so schnell ab, dass die Reaktionsgeschwindigkeit der Transportgeschwindigkeit der Reaktanden durch die Lösung entspricht a  s schnell wenn die Reaktanten aufeinander treffen, reagieren sie.


Enzymregulation

Konkurrenzhemmung und nicht-kompetitive Hemmung

Enzyme können durch Störungen anderer Verbindungen gehemmt oder aktiviert werden. Diese beeinflussen die Reaktion, indem sie (K_m) oder (V_) der Reaktion. Die meisten Enzymhemmer wirken reversibel und verursachen keine dauerhaften Veränderungen des Enzyms. Es gibt aber auch irreversible Inhibitoren, die das Zielenzym kovalent und dauerhaft modifizieren. Diese werden als Suizidinhibitoren bezeichnet.

Inhibitoren können kategorisiert werden als wettbewerbsfähig oder nicht wettbewerbsfähig und dies kann durch Vergleich der Kinetik der normalen gegenüber der gehemmten Reaktion bestimmt werden.

Abbildung 1.6: Kompetitive vs. nichtkompetitive Hemmung.

Wettbewerbshemmer binden das Enzym am aktiven Zentrum und konkurrieren mit dem Substrat um die Bindung. Viele fungieren als Substratanaloga. In Gegenwart des Inhibitors wird daher eine höhere Substratkonzentration benötigt, um eine halbmaximale Rate der Michaelis-Konstanten (K_m) zu erreichen. Wenn die Substratkonzentrationen erhöht sind, wird dies letztendlich den Inhibitor verdrängen und (V_) erreicht werden. Die maximale Rate, (V_), wird daher nicht durch kompetitive Inhibitoren beeinflusst. In diesem Fall gibt es keine ändern auf (V_) da Konkurrenz durch eine Erhöhung der Substratkonzentration überwunden werden kann, aber Zunahme der scheinbaren (K_m) von 5 Abbildung 1.5 Lineweaver-Burk-Diagramm zur Veranschaulichung von (K_m) und (V_). (Übernommen von Marks&rsquo Medical Biochemistry) Abbildung 1.6 Kompetitive vs. nichtkompetitive Hemmung. (Angepasst von Marks Medical Biochemistry) die Reaktion, da eine höhere Substratkonzentration erforderlich ist, um (V_) (Abbildung 1.6A).

Im Gegensatz, nicht kompetitive Inhibitoren binden das Enzym an einer alternativen Stelle zur Substratbindungsstelle und daher können seine Wirkungen nicht durch eine Erhöhung des Substrats überwunden werden. In diesem Fall (K_m) bleibt unverändert, aber (k_) (die Geschwindigkeit der Produktbildung) und damit (V_), nimmt ab. Irreversible Inhibitoren führen normalerweise zu einer nicht-kompetitiven Hemmung, da die Konzentration des aktiven Enzyms [E] abnimmt (Abbildung 1.6B).

Die Wirkung von Inhibitoren lässt sich im Lineweaver‒Burk-Plot anschaulich veranschaulichen. Bei dieser Darstellung entspricht der Schnittpunkt der Näherungsgeraden mit der y-Achse 1/(V_), während der Schnittpunkt der x-Achse den Wert -1/(K_m) ergibt. Deshalb schneiden sich die in Abwesenheit (blau) und Anwesenheit eines kompetitiven Inhibitors (A, rot) erhaltenen Geraden auf der y-Achse (1/ (V_), unverändert), während nicht-kompetitive Inhibitoren (B, rot) zu einer Geraden mit höherem y-Achsenabschnitt aber unverändertem x-Achsenabschnitt (1/(V_) erhöht, (K_m) unverändert) (Abbildung 1.6).


Enzymkinetik

Geschwindigkeitsgleichungen für einige bireaktante Mechanismen

In einigen Fällen werden unterschiedliche kinetische Mechanismen durch unterschiedliche Geschwindigkeitsgleichungen beschrieben. (Siehe Standardtexte zur Enzymkinetik für die Verfahren, die verwendet werden, um diese Gleichungen abzuleiten.) Folglich ist es manchmal möglich, zwischen Mechanismen aus den Eigenschaften der doppelreziproken Diagramme zu unterscheiden. Zum Beispiel lautet die Geschwindigkeitsgleichung für einen geordneten Doppelreaktantenmechanismus unter stationären Bedingungen in Abwesenheit von Produkten

wo KmA und KmB sind die Michaelis-Konstanten der beiden Substrate und KNS ist die einfache Dissoziationskonstante des EA-Komplexes. (Geschwindigkeitsgleichungen für Multireaktanten-Mechanismen enthalten oft beide Arten von Konstanten.) Wenn [EIN] bei verschiedenen festen Konzentrationen von B variiert wird, kann die Geschwindigkeitsabhängigkeit in Form der Michaelis-Menten-Gleichung geschrieben werden:

Oder, in doppelter reziproker Form:

Wann [B] bei verschiedenen festen Konzentrationen von A variiert wird, lauten die Gleichungen

Bei einer festen Konzentration eines Substrats, z. B. A, kann die Geschwindigkeitsabhängigkeit von der Konzentration von Substrat B auch durch eine vereinfachte Form von Gl. (25) :

bei dem die scheinbare Konstanten beziehen sich auf die wahren oder begrenzenden Konstanten, wie unten gezeigt.

Mit anderen Worten, die experimentell ermittelte „Km" und "Vmax“ hängen von der Konzentration des Co-Substrats ab und entsprechen nicht den Grenzwerten, es sei denn, diese Konzentration ist unendlich hoch („sättigend“). In der Praxis erhält man die kinetischen Grenzkonstanten aus entsprechenden Wiederholungen der Steigungen und 1/v-Achsenabschnitte der doppelreziproken Plots. (Ersteres ist eine Neuauflage von Km,app/Vmax, App Letzteres ist eine Wiederholung von 1/Vmax, App.) Zum Beispiel die Replots für die Familie von 1/v gegen 1/[B] Plots an verschiedenen festen [EIN] werden durch die folgenden linearen Gleichungen beschrieben:

Die Gleichungen für den Doppelreaktionsmechanismus des substituierten Enzyms (Ping-Pong) in Abwesenheit von Produkten sind

Wann [EIN] ist unterschiedlich unterschiedlich [B] sind die Michaelis-Menten- und die doppelt-reziproken Gleichungen

Die Gleichungen für verschiedene [B] Bei verschiedenen [EIN] sind symmetrisch zu denen, die für verschiedene [EIN]. Abbildung 3 zeigt die Familien von 1/v gegen 1/[EIN] Plots für einen geordneten und einen Ping-Pong-Mechanismus. In beiden Mechanismen unterschiedliche feste [B]-Werte wirken sich auf die Achsenabschnitte der vertikalen Achse aus. Im geordneten Mechanismus ändert sich [B] beeinflusst auch die Steigungen des 1/v gegen 1/[EIN] Grundstücke. Aber im Ping-Pong-Mechanismus ändert sich die feste [B] hat keine Auswirkung auf die Pisten. (Beachten Sie, dass die Gleichungen (24) und (33) diese Effekte vorhersagen.) Das Fehlen eines Steigungseffekts reicht oft aus, um den Ping-Pong-Mechanismus zu identifizieren. Das Vorliegen von Steigungs- und Achsenabschnittseffekten (wie in Abbildung 3A gezeigt) reicht jedoch nicht aus, um den geordneten Mechanismus zu diagnostizieren, da in Abwesenheit von Produkten ein geordneter Steady-State-, ein Theorell-Chance- und ein Zufallsmechanismus mit schnellem Gleichgewicht alle haben die gleiche Geschwindigkeitsgleichung. Folglich sind die doppelreziproken Plotmuster der drei verschiedenen Mechanismen gleich. Zusätzliche Messungen sind erforderlich, um zwischen diesen Mechanismen zu unterscheiden. Studien zur Produkthemmung können aufschlussreich sein. In einem geordneten Steady-State-Mechanismus ist beispielsweise eines der Produkte (P, das zuerst vom Enzym dissoziiert) in Bezug auf beide Substrate nicht kompetitiv, aber in einem Theorell-Chance- und Zufallsmechanismus ist jedes Produkt mit at . kompetitiv mindestens ein Substrat. Sackgassen-Hemmungsstudien können ebenfalls nützlich sein. Zum Beispiel ist ein nichtreaktives Analogon, das mit B kompetitiv ist, nicht kompetitiv mit A im geordneten und Theorell-Chance-Mechanismus, aber nicht kompetitiv mit A im zufälligen Mechanismus. (Dies setzt voraus, dass der Inhibitor einen EAI-Komplex im Theorell-Chance-Mechanismus bildet und Substrat B vollständig im Zufallsmechanismus nachahmt, indem er sowohl an E als auch an EA bindet.)

Figur 3 . Doppelreziproke Plots von 1/v gegen 1/[EIN] bei verschiedenen festen Konzentrationen von B. A wird als variiertes Substrat bezeichnet, B wird als sich änderndes festes Substrat bezeichnet. (A) Ein sequentieller Mechanismus. Die Diagramme könnten für einen geordneten Steady-State-, Theorell-Chance- oder einen schnellen Gleichgewichts-Zufallsmechanismus sein. (B) Ping-Pong-Mechanismus. Für die obigen Mechanismen sind die Diagramme von 1/v gegen 1/[B] an verschiedenen festen [EIN] haben das gleiche Aussehen wie bei variiert 1/[EIN]. Die begrenzenden kinetischen Konstanten, KmA, KmB, KNS, Vmax, usw. werden durch Umzeichnen der Steigungen und/oder 1/v-Achsenabschnitte der doppelreziproken Auftragungen gegen den Kehrwert der sich ändernden festen Substratkonzentration.


Inhalt

1901 fand der französische Physikochemiker Victor Henri heraus, dass Enzymreaktionen durch eine Bindung (allgemein eine Bindungswechselwirkung) zwischen dem Enzym und dem Substrat initiiert werden. [4] Seine Arbeit wurde von der deutschen Biochemikerin Leonor Michaelis und der kanadischen Ärztin Maud Menten aufgegriffen, die die Kinetik eines enzymatischen Reaktionsmechanismus, der Invertase, untersuchten, der die Hydrolyse von Saccharose zu Glucose und Fructose katalysiert. [5] 1913 schlugen sie ein mathematisches Modell der Reaktion vor. [6] Dabei bindet ein Enzym E an ein Substrat S, um einen Komplex ES zu bilden, der wiederum ein Produkt P freisetzt, das das ursprüngliche Enzym regeneriert. Dies kann schematisch dargestellt werden als

wobei k f > (Vorwärtsgeschwindigkeitskonstante), k r > (Reverse-Rate-Konstante) und k c a t >> (katalytische Geschwindigkeitskonstante) bezeichnen die Geschwindigkeitskonstanten, [7] die Doppelpfeile zwischen S (Substrat) und ES (Enzym-Substrat-Komplex) repräsentieren die Tatsache, dass die Enzym-Substrat-Bindung ein reversibler Prozess ist, und der einzelne Vorwärtspfeil repräsentiert die Bildung von P (Produkt).

Unter bestimmten Annahmen – z. B. dass die Enzymkonzentration viel geringer ist als die Substratkonzentration – ist die Geschwindigkeit der Produktbildung gegeben durch

Das Modell wird in einer Vielzahl biochemischer Situationen außer der Enzym-Substrat-Interaktion verwendet, einschließlich der Antigen-Antikörper-Bindung, der DNA-DNA-Hybridisierung und der Protein-Protein-Interaktion. [9] [12] Sie kann verwendet werden, um eine generische biochemische Reaktion zu charakterisieren, genauso wie die Langmuir-Gleichung verwendet werden kann, um die generische Adsorption biomolekularer Spezies zu modellieren. [12] Wenn eine empirische Gleichung dieser Form auf das mikrobielle Wachstum angewendet wird, wird sie manchmal als Monod-Gleichung bezeichnet.

Parameterwerte variieren stark zwischen Enzymen: [13]

Enzym K M >> (M) k cat >> (s −1 ) k cat / K M >/K_ >> (M −1 s −1 )
Chymotrypsin 1.5 × 10 −2 0.14 9.3
Pepsin 3.0 × 10 −4 0.50 1.7 × 10 3
T-RNA-Synthetase 9.0 × 10 −4 7.6 8.4 × 10 3
Ribonuklease 7.9 × 10 −3 7.9 × 10 2 1.0 × 10 5
Carboanhydrase 2.6 × 10 −2 4.0 × 10 5 1.5 × 10 7
Fumarase 5.0 × 10 −6 8.0 × 10 2 1.6 × 10 8

Die Konstante k cat / K M >/K_ >> (katalytische Effizienz) ist ein Maß dafür, wie effizient ein Enzym ein Substrat in ein Produkt umwandelt. Diffusionsbegrenzte Enzyme wie Fumarase arbeiten an der theoretischen Obergrenze von 10 8 – 10 10 M −1 s −1 , begrenzt durch die Diffusion des Substrats in das aktive Zentrum. [14]

Die Michaelis-Menten-Kinetik wurde auch auf eine Vielzahl von Bereichen außerhalb biochemischer Reaktionen angewendet, [7] einschließlich der alveolären Clearance von Stäuben, [15] dem Reichtum an Artenpools, [16] der Clearance von Blutalkohol, [17] der Photosynthese- Strahlungsbeziehung und bakterielle Phageninfektion. [18]

Die Gleichung kann auch verwendet werden, um die Beziehung zwischen der Ionenkanalleitfähigkeit und der Ligandenkonzentration zu beschreiben. [19]

Die Anwendung des Massenwirkungsgesetzes, das besagt, dass die Reaktionsgeschwindigkeit proportional zum Produkt der Konzentrationen der Reaktanten ist (dh [ E ] [ S ] ), ergibt ein System von vier nichtlineare gewöhnliche Differentialgleichungen, die die Änderungsgeschwindigkeit von Reaktanten mit der Zeit t definieren[20]

Gleichgewichts-Approximation Bearbeiten

In ihrer ursprünglichen Analyse gingen Michaelis und Menten davon aus, dass sich das Substrat in einem momentanen chemischen Gleichgewicht mit dem Komplex befindet, was impliziert [6] [21]

Aus dem Enzymerhaltungsgesetz erhalten wir [21]

Die Kombination der beiden obigen Ausdrücke ergibt

Vereinfacht erhalten wir

Quasi-Steady-State-Approximation Bearbeiten

Eine alternative Analyse des Systems wurde 1925 vom britischen Botaniker GE Briggs und dem britischen Genetiker JBS Haldane durchgeführt. [22] [23] Sie nahmen an, dass sich die Konzentration des Zwischenkomplexes auf der Zeitskala der Produktbildung – bekannt als die Quasi-Steady-State-Annahme oder Pseudo-Steady-State-Hypothese. Mathematisch bedeutet diese Annahme: k f [ E ] [ S ] = k r [ ES ] + k c a t [ ES ] = ( k r + k c a t ) [ ES ] [>][>]=k_[>]+k_ >>[>]=(k_+k_ >)[>>]> . Dies ist mathematisch die gleiche wie die vorherige Gleichung, mit k r > ersetzt durch k r + k c a t +k_ >> . Daher beträgt die Geschwindigkeit v der Reaktion nach den gleichen Schritten wie oben [21] [23]

ist als Michaelis-Konstante bekannt.

Annahmen und Einschränkungen Bearbeiten

Der erste Schritt der Herleitung wendet das Massenwirkungsgesetz an, das auf freier Diffusion beruht. In der Umgebung einer lebenden Zelle mit hoher Proteinkonzentration verhält sich das Zytoplasma jedoch oft eher wie ein viskoses Gel als wie eine frei fließende Flüssigkeit, wodurch die molekularen Bewegungen durch Diffusion eingeschränkt und die Reaktionsgeschwindigkeiten verändert werden. [24] Obwohl das Massenwirkungsgesetz in heterogenen Umgebungen gültig sein kann, [25] ist es angemessener, das Zytoplasma als Fraktal zu modellieren, um seine eingeschränkte Bewegungskinetik zu erfassen. [26]

Im Gegensatz dazu ist die quasistationäre Briggs-Haldane-Analyse gültig, wenn [20] [27]

Es gilt also, wenn die Enzymkonzentration viel kleiner ist als die Substratkonzentration oder K M >> oder beides.

Es ist auch wichtig, sich daran zu erinnern, dass die Irreversibilität zwar eine notwendige Vereinfachung ist, um eine handhabbare analytische Lösung zu erhalten, im allgemeinen Fall jedoch die Produktbildung nicht irreversibel ist. Die Enzymreaktion wird korrekter beschrieben als

Im Allgemeinen ist die Annahme der Irreversibilität in Situationen sinnvoll, in denen eine der folgenden Bedingungen zutrifft:

1. Die Konzentration von Substrat(en) ist sehr viel größer als die Konzentration von Produkten: [ S ] ≫ [ P ] ⋅ >>

Dies gilt unter Standard in vitro Testbedingungen und gilt für viele in vivo biologische Reaktionen, insbesondere wenn das Produkt durch eine Folgereaktion kontinuierlich entfernt wird.

2. Die bei der Reaktion freigesetzte Energie ist sehr groß, also Δ G ≪ 0. ll 0.>

In Situationen, in denen keine dieser beiden Bedingungen zutrifft (d. h. die Reaktion ist niederenergetisch und es existiert ein beträchtlicher Pool von Produkten), bricht die Michaelis-Menten-Gleichung zusammen und komplexere Modellierungsansätze nehmen explizit die Hin- und Rückreaktionen berücksichtigt werden, um die Enzymbiologie zu verstehen.

Bevor Rechenmöglichkeiten zur Durchführung nichtlinearer Regressionen zur Verfügung standen, wurden graphische Verfahren verwendet, die eine Linearisierung der Gleichung beinhalteten. Eine Reihe von diesen wurden vorgeschlagen, darunter das Eadie-Hofstee-Diagramm, das Hanes-Woolf-Diagramm und das Lineweaver-Burk-Diagramm, von denen das Hanes-Woolf-Diagramm am genauesten ist. [28] Obwohl sie für die Visualisierung nützlich sind, verzerren alle drei Methoden die Fehlerstruktur der Daten und sind der nichtlinearen Regression unterlegen. [29] Unter der Annahme eines ähnlichen Fehlers dv 0 > auf v 0 > führt eine inverse Darstellung zu einem Fehler von dv 0 / v 0 2 /v_<0>^<2>> on 1 / v 0 > (Ausbreitung von Unsicherheit). Ohne geeignete Schätzung der d v 0 >-Werte sollte eine Linearisierung vermieden werden. Darüber hinaus geht die Regressionsanalyse mit Hilfe der kleinsten Quadrate davon aus, dass Fehler normalverteilt sind, was nach einer Transformation von v 0 >-Werten nicht gültig ist. Dennoch findet sich ihre Verwendung noch in der modernen Literatur. [30]

1997 schlugen Santiago Schnell und Claudio Mendoza eine geschlossene Lösung für die Zeitverlaufskinetikanalyse der Michaelis-Menten-Kinetik basierend auf der Lösung der Lambert-W-Funktion vor. [31] Nämlich,

wo W ist die Lambert-W-Funktion und

Die Michaelis-Menten-Gleichung wird seit mehr als einem Jahrhundert verwendet, um die Geschwindigkeit der Produktbildung bei enzymatischen Reaktionen vorherzusagen. Insbesondere heißt es, dass die Geschwindigkeit einer enzymatischen Reaktion mit zunehmender Substratkonzentration zunimmt, und dass eine verstärkte Ablösung von Enzym-Substrat-Komplexen die Reaktionsgeschwindigkeit verringert. Während die erste Vorhersage gut etabliert ist, ist die zweite schwer fassbar. Die mathematische Analyse der Wirkung der Enzym-Substrat-Entbindung auf enzymatische Reaktionen auf Einzelmolekülebene hat gezeigt, dass die Entbindung eines Enzyms von einem Substrat unter bestimmten Bedingungen die Geschwindigkeit der Produktbildung verringern kann, aber auch den gegenteiligen Effekt haben kann. Wenn die Substratkonzentrationen ansteigen, kann ein Kipppunkt erreicht werden, an dem eine Erhöhung der Ablösegeschwindigkeit zu einer Erhöhung und nicht zu einer Verringerung der Reaktionsgeschwindigkeit führt. Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass sich enzymatische Reaktionen so verhalten können, dass die klassische Michaelis-Menten-Gleichung verletzt wird, und dass die Rolle der Aufhebung der Bindung in der enzymatischen Katalyse noch experimentell bestimmt werden muss. [34]


E2. Grundprinzipien der Metabolic Control Analysis (MCA)

  • Beigetragen von Henry Jakubowski
  • Professor (Chemie) am College of St. Benedict/St. Johns Universität

Für solche rechnerischen Analysen sind verschiedene Eingaben erforderlich:

A. Definierte Wege. Diese sind in vielen Datenbanken verfügbar. Ein Beispiel von KEGG-Wegen für die Hefe-Glykolyse ist unten gezeigt

B. Ein computergestütztes Modellierungsprogramm zur Eingabe aller Parameter, Gleichungen, Modelle und Berechnung von Konzentrationen für alle Spezies als Funktion der Zeit. Kostenlose herunterladbare Programme, die dies tun, umfassen COPASI, Virtual Cell und Cell Designer. Ein Beispiel für ein kartiertes Modell von Cell Designer für die Hefe-Glykolyse mit mehreren zusätzlichen Reaktionen, die vom klassischen glykolytischen Weg abzweigen, ist unten gezeigt.

Die rechnerischen Ergebnisse der Analysen zur Hefe-Glykolyse konnten nur dann an experimentelle Daten angepasst werden, wenn sie durch Zugabe mehrerer Verzweigungsreaktionen korrigiert wurden (in den Abbildungen oben und unten gezeigt):

C. Eine Liste aller am Stoffwechselweg beteiligten Spezies (in der Abbildung unten für Glykolyse und Verzweigungsreaktionen gezeigt).

D. Eine Liste aller Reaktionen (siehe unten für Glykolyse und Verzweigungsreaktionen, entnommen aus COPASI)

e. Parameter aller Arten. Ein Beispiel ist unten für Hexokinase (von COPASI entnommen) gezeigt.

F. Gleichungen, die verwendet werden können, um die Konzentrationsänderung aller Spezies mit der Zeit zu berechnen. Dies sind normalerweise gewöhnliche Differentialgleichungen (ODE), wie in Kapitel 6B - Kinetik einfacher und enzymkatalysierter Reaktionen, Abschnitt B1: Einschrittreaktionen beschrieben.) ODEs sind einfach zu schreiben, erfordern jedoch einen Computer, um sie zu lösen, wenn die Zahl der interagierenden Spezies zunimmt .

Eine beispielhafte chemische Reaktion und eine Reihe von ODEs für jede Spezies sind unten gezeigt.

Wenn eine Reaktion Spezies X entfernt, hat die rechte Seite der ODE für das Verschwinden dieser Spezies ein &ndash-Zeichen für diesen Begriff. Ebenso, wenn eine Reaktion die Spezies X erhöht, hat die rechte Seite ein +-Zeichen. Die obigen Beispiele zeigen unimolekulare (C nach D, C nach A + B) und bimolekulare (A+B nach C) Reaktionen.

Ein Beispiel einer aus COPASI entnommenen ODE ist unten für die Konzentrationsänderung von Glucose-6-Phosphat gezeigt.

Für viele Pfade wurden Datenbanken entwickelt, die kuratierte Modelle mit allen oben genannten Informationen enthalten. Das oben beschriebene Hefe-Glykolyse-Modell ist in der Biomodels Database zu finden. Das Modell BIOMD0000000064 kann als Systembiologie-Markup-Sprachen-Datei (SBML) heruntergeladen und in jedes der oben beschriebenen Programme importiert werden.
Die folgenden Grafiken zeigen die Konzentrationen für ausgewählte und alle Spezies als Funktion der Zeit für die Hefe-Glykolyse unter Verwendung von COPASI.


1 Kinetische Analyse von Enzymreaktionswegen in transienten Zuständen

Dieses Kapitel liefert eine Begründung für das Design und die Interpretation von transienten kinetischen Experimenten zur Etablierung von Enzymwegen durch direkte Analyse einzelner Reaktionsschritte. In vielerlei Hinsicht ist die transiente Kinetik unkompliziert und experimentelle Ergebnisse können anhand einfacher Prinzipien verstanden werden, die aus der Kinetik erster Ordnung abgeleitet wurden. Die Anwendung dieser Methoden auf die Enzymkinetik wird durch eine Reihe von Beispielen veranschaulicht. Dies ist besonders nützlich für die Fälle, in denen die kinetischen Daten an ein einzelnes, vollständiges Modell angepasst werden könnten, am bemerkenswertesten ist die 5-Enolpyruvylshikimat-3-phosphat (EPSP)-Synthase, DNA-Polymerase und Tryptophan-Synthase. Die Anwendung transienter kinetischer Methoden zur Lösung von Enzymmechanismen hat aufgrund der jüngsten Fortschritte bei der Instrumentierung und bei der Überexpression und Reinigung neuer Enzyme zugenommen. Die transiente Kinetik wird zur Methode der Wahl für die Evaluierung von ortsgerichteten Enzymmutanten und für Detailfragen zu den Zusammenhängen zwischen Proteinstruktur und beobachtbarer Funktion. In Verbindung mit den Fortschritten bei den Methoden der Struktur- und genetischen Analyse bildet die kinetische Analyse des transienten Zustands die Grundlage für das, was man die „neue Enzymologie“ nennen könnte. Die Gefahr bei der Interpretation kinetischer Daten rührt von der Tendenz her, einen zusätzlichen Reaktionsschritt einzubeziehen, um ein ungewöhnliches kinetisches Ergebnis zu erklären, wenn das neue Ergebnis oft durch ein einfacheres Modell hätte erklärt werden können, das auf einem tieferen Verständnis der Feinheiten der Kinetik basiert .


Diskussion

Die indirekt durch Temperaturerhöhung gemessene Enzymaktivität folgte wie erwartet einem Standardmuster der Enzymkinetik. Wir glauben, dass die hier vorgestellten Laborverfahren mehrere Herausforderungen für die Lehre der Enzymkinetik im einführenden Biologielabor lösen. Erstens sind die Verfahren einfach und kostengünstig. Die erforderlichen Geräte und Verbrauchsmaterialien können leicht beschafft werden, und es ist keine spezielle Schulung für deren Verwendung erforderlich. Daher können diese Übungen mit Lernenden auf vielen verschiedenen Niveaus und an verschiedenen Arten von Institutionen verwendet werden. Zweitens werden bei diesen Verfahren keine gefährlichen Materialien verwendet, wodurch Risiken für die Schüler und die Notwendigkeit spezieller Entsorgungspraktiken vermieden werden. Schließlich liefern diese Verfahren robuste und hoch replizierbare quantitative Daten, die die Schüler für die grafische Analyse verwenden können.

Diagramme können je nach akademischem Niveau der Schüler im Unterricht unter Anleitung des Lehrers initiiert oder als Hausaufgabe gegeben werden. Wir kommen zu dem Schluss, dass diese Verfahren mit der aktuellen Betonung der Entwicklung quantitativer Fähigkeiten im Biologieunterricht übereinstimmen (AAMC-HHMI Committee, 2009 Labov et al., 2010 Woodin et al., 2010).

An die hier vorgeschlagenen Aktivitäten kann eine angeleitete Untersuchungsübung angeschlossen werden, in der den Schülern das Basisverfahren vermittelt wird und sie dann eine Untersuchung entwerfen, um die Veränderung der Enzymaktivität durch Variationen der untersuchten Faktoren in der ersten Woche zu messen. Das Verständnis der Schüler für das grundlegende Verfahren kann mit einem kurzen Quiz oder einer Klassendiskussion überprüft werden, sodass der Lehrer alle Unklarheiten klären kann. Studententeams können dann damit beauftragt werden, Verfahren zu entwickeln, um die Auswirkungen verschiedener Manipulationen auf die Aktivität dieses Enzyms zu untersuchen. Zum Beispiel können die Schüler wählen, ob sie die Wirkung von 10x Substrat oder 0,25x Enzymkonzentration oder pH 9 bewerten möchten. In dieser Situation dient das Basisverfahren als Ausgangspunkt, und die Schüler müssen ihr Verständnis sowohl der Enzymkinetik als auch der wissenschaftlichen Praxis anwenden um das Problem zu lösen.

Für jüngere Studierende oder solche mit begrenzter Erfahrung mit experimentellem Design kann es erforderlich sein, dass der Dozent den Gruppen das Design bestimmter Verfahren vorschlägt oder direkt zuweist. Beispielsweise könnte eine Gruppe damit beauftragt werden, den Effekt einer pH-Änderung zu untersuchen, und eine andere mit der Untersuchung der Wirkung einer Änderung der Substratkonzentration. Älteren Studierenden kann mehr Freiraum geboten werden, Verfahren nach ihren eigenen Kenntnissen und Interessen zu gestalten. Darüber hinaus können fortgeschrittene Schüler auch neue Faktoren untersuchen, wie z. B. kompetitive oder nicht-kompetitive Inhibitoren. Der Lehrer steht während der Unterrichtszeit für Anleitungen zur Verfügung, aber die Schüler sind selbst für die Auswahl geeigneter experimenteller Parameter verantwortlich, einschließlich Zeit, Temperatur, pH, Probenanzahl und Kontrollen. Sobald ihr experimentelles Design vom Lehrer genehmigt wurde, können die Schüler ihre Verfahren tatsächlich durchführen und ihr experimentelles Design und die erhaltenen Daten mit anderen Gruppen in der Klasse teilen. Dies bietet eine Möglichkeit zum Peer-Teaching und damit ein Instrument zur Einbindung der Studierenden. Da die Ergebnisse quantitativ sind, können sie ihre Ergebnisse grafisch analysieren. Als Abschlussprüfung können die Studierenden eine schriftliche Hausarbeit, wie beispielsweise einen Laborbericht, anfertigen. Rissing und Cogan (2009) berichteten von signifikanten Lernzuwächsen bei Schülern, die an einem ähnlichen Labormodul mit geführter Untersuchung teilgenommen hatten, im Vergleich zu Schülern, die an einer Standard-Laborübung im Stil eines „Kochbuchs“ teilgenommen hatten.

Zusammenfassend lässt sich sagen, dass ein budgetfreundliches, ungefährliches Verfahren verwendet werden kann, um die Enzymkinetik quantitativ zu untersuchen. Darüber hinaus kann dieser Prozess erweitert werden, um die Investitionen der Studierenden zu erhöhen, wenn den Studierenden die Möglichkeit gegeben wird, ihre eigenen Experimente zu entwerfen und Parameter zu bewerten, die über die von einem Laborhandbuch vorgegebenen hinausgehen. Die Aktivität dient als erfahrungsorientierte Lernaktivität, da die Studierenden lernen, indem sie das Versuchsdesign bearbeiten, eigene Experimente durchführen und die Ergebnisse in grafischer Form präsentieren. Damit diese teambasierte Aktivität erfolgreich durchgeführt werden kann, müssen die Schüler kritisch denken, Probleme mit dem Experiment lösen und offen für das Feedback des leitenden Lehrers sein und dieses nutzen.


Prinzip:


Das Enzym α-Amylase kann die Hydrolyse der in Stärke vorhandenen internen &alpha-1,4-glykosidischen Bindung unter Bildung von reduzierenden Zuckern katalysieren. Bei der Untersuchung der Substratkonzentration auf die Enzymkinetik wird das Enzym konstant gehalten, wobei die Stärkekonzentration in aufsteigender Reihenfolge gemessen wird. Mit steigender Substratkonzentration nimmt auch die Menge der in jedem nachfolgenden Röhrchen produzierten Produkte zu. This was explained by Michealis and others that an enzyme catalyzed reaction at varying substrate concentrations is diphasic i.e. at low substrate concentration the active sites on molecules (enzyme) are not occupied by substrate and the enzyme rate varies with substrate molecules concentration (phase1). As the number of substrate molecules increases, the enzyme attains the saturation level, since there is no more reaction sites remaining for binding. So the enzyme can work with full capacity and its reaction rate is independent of substrate concentration. (Phase II).


This Enzyme &ndash substrate reaction can be determined by measuring the increase in reducing sugars using the 3, 5 Dinitro salycilic acid reagent. In an alkaline condition, the pale yellow colored the 3, 5- dinitro salicylic acid undergo reduction to yield orange colored 3- amino -5-nitrosalicylic acid. The absorbance of resultant solutions is read at 540nm. The intensity of color depends on the concentration of reducing sugars produced.


&alpha Amylase
Starch Maltose + glucose


Schau das Video: Enzymkinetik og Michaelis-Menten Modellen (November 2021).