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Könnten Plasmide und Konjugationsmechanismen gegen antibiotikaresistente Bakterien eingesetzt werden?


Ich bin überrascht, dass niemand so etwas erwähnt hat.

Plasmide werden oft zwischen Bakterien ausgetauscht, manchmal durch Konjugation. Insbesondere könnte die Konjugation als Schwachstelle "offener Ports" angesehen werden.

Intuitiv gibt es mehrere Schemata, die Plasmide und bakterielle Konjugation nutzen, die Alternativen zu Antibiotika bilden könnten:

1: Pwnage durch Konjugation

Eine speziell konstruierte nanoskalige Kapsel oder eine speziell manipulierte Bakterienzelle ist so programmiert, dass sie gezielt Bakterien zur Konjugation aufruft. Wenn der Konjugationstunnel geöffnet wird, überflutet die Kapsel oder die manipulierte Bakterienzelle das Zielbakterium mit Toxinen oder schädlicher RNA, die es sabotieren soll.

2: Gefälschte Konjugation

Ein speziell entwickeltes neuartiges Antibiotikum enthält eine Konjugations-Signalstruktur. Wenn ein Bakterium an das Antibiotikum-Molekül andockt, rastet das Antibiotikum irreversibel ein und reißt von innen ein massives Loch in das Bakterium.

3: Hintertür-Plasmide

Aus natürlich vorkommenden Bakterien werden Plasmide isoliert, die signifikante Vorteile bieten, und den Plasmiden wird ein spezielles "Crash-Gen" hinzugefügt. Die modifizierten Plasmide werden wieder in Bakterien implantiert, von denen bekannt ist, dass sie sie verbreiten.

Der Promotor des Crash-Gens lauscht auf eine kleine Reihe chemischer Hinweise. Wenn es eine bestimmte Schwelle von 1 dieser Hinweise erkennt, wird es aktiv und sabotiert das Bakterium. Das Gen könnte für ein Toxin kodieren, das Bakterien spezifisch schädigt. Alternativ könnte der Promotor spezifisch entworfen werden, so dass er niemals den chemischen Hinweis freisetzt und das Bakterium zwingt, wiederholt ein Müllprodukt zu produzieren und seine Ressourcen zu verschwenden.

4: Bad Neighbor Plasmid

Dies könnte schwieriger zu bauen sein. Ein synthetisches Plasmid kodiert für 2 Produkte: Das erste bietet einen signifikanten Vorteil, um zu verhindern, dass Bakterien es durch natürliche Selektion absetzen. Das andere Produkt wird periodisch ("zufällig") transkribiert und zerstört andere Plasmide, was eine große Anzahl von Nonsense-Mutationen verursacht. Ein Satz spezieller Marker auf dem synthetischen Plasmid schützt es vor Vandalismus durch sein eigenes Produkt. Dies könnte die Antibiotikaresistenz von Bakterienpopulationen stillschweigend entfernen, und die Bakterien haben keine Möglichkeit zu "wissen", dass sie sabotiert wurden, bis es zu spät ist.


Wenn wir davon ausgehen, dass all diese Dinge zumindest irgendwann in der Zukunft praktisch umgesetzt werden könnten, sind hier die Probleme, die ich bei den Vorschlägen sehe, und warum sie möglicherweise nicht funktionieren (andere werden möglicherweise zusätzliche erkennen).

1 Translokation eines Sabotage-„Mittels“ über den Konjugationsapparat.

Diese gibt es im Grunde schon, schauen Sie sich die verschiedenen Sekretionssysteme von Bakterien an. Insbesondere das Typ 6 Sekretionssystem tut genau dies (wenn auch mit einem etwas eingeschränkten Zielbereich).

Der erste Absatz im Wiki fasst zusammen:

Das Sekretionssystem vom Typ VI (T6SS) ist eine molekulare Maschine, die von einer Vielzahl gramnegativer Bakterienarten verwendet wird, um Proteine ​​aus dem Inneren (Zytoplasma oder Zytosol) einer Bakterienzelle durch die Zellhülle in eine benachbarte Zielzelle zu transportieren.

Der Grund, warum dies nicht funktionieren würde, ist, dass sich Bakterien bereits entwickelt haben, um mit solchen Mechanismen umzugehen, und einem, den wir entwickeln, wird es wahrscheinlich nicht viel anders gehen.

Sie können mir entnehmen (da meine Doktorarbeit genau das betrifft!), dass es möglich ist, zu ändern, was die Sekretionssysteme translozieren sehr schwierig.

2 Falsche Konjugation

Antibiotika sind in der Regel kleine Moleküle. Sie binden und docken an Enzyme oder Substrate an, um typischerweise irgendeine Art von Aktivität zu hemmen, z. Zellwandsynthese bei Beta-Lactam-Antibiotika wie Penicillin. Ich bin mir nicht sicher, wie Sie sich wirklich vorstellen, dass es "ein Loch in das Bakterium reißen" würde?

Mit dem T6SS verwandt sind R-Typ-Pyocine, bei denen es sich um kooptierte Bakteriophagen handelt, die irgendwie mach das. Es erfordert keine Konjugation, und der derzeit vorgeschlagene Mechanismus besteht darin, dass sie entweder eine Ladung von Toxinen oder Molekülen in die Zelle einbringen, indem sie das Äußere durchstechen, oder sie erzeugen einfach eine Pore in der Membran, die zelluläre Depolarisation und den Tod verursacht. Wie bei Phagen und Antibiotika können diese Mechanismen jedoch Resistenzen gegen sie entwickeln.


Als zusätzlicher Punkt, es sei denn, Sie könnten irgendwie garantieren, dass die Konjugationen in irgendeiner Weise sabotiert oder ineffektiv waren, wird die künstliche Förderung der Konjugation mit ziemlicher Sicherheit Hilfe die Ausbreitung von Resistenz- und Virulenzdeterminanten, was die Situation sogar verschlimmert.


3 Ein Selbstmordplasmid

Es ist nicht trivial, einer Zelle „erhebliche Vorteile zu verleihen“. Die meisten Plasmide werden aufrechterhalten, indem ein signifikanter Nachteil die oft künstlich zugeführt wird, z.B. Auxotrophie oder Antibiotikaselektion. Angesichts der „Wahl“ neigen Bakterien dazu, die Plasmide zu vertreiben, es sei denn, sie können es sich einfach nicht leisten, ohne sie zu leben. Die Aufrechterhaltung des Replikons ist hinsichtlich des Zellstoffwechsels und der Ressourcennutzung ein teurer Prozess.

„In freier Wildbahn“ würde das waffenfähige Plasmid wahrscheinlich nicht lange genug bestehen bleiben, um in einem ausreichenden Anteil in ein beliebiges Ziel von Interesse transloziert zu werden, um eine wirkliche Wirkung zu haben. Der Schlüssel ist, dass und von diesen genannten Ideen nicht einfach eine einzelne Zielzelle getötet werden kann, da sie keine nennenswerten Auswirkungen auf die Population haben. Die Bakterien rekombinieren oder entfernen das Plasmid, wenn es in irgendeiner Weise schädlich oder sogar neutral für sie ist, bis sie das Problem "korrigiert" haben.

Suchtmodule und Toxin-Antitoxin-Systeme sind, wie bei den anderen genannten Ideen, in natürlichen Plasmiden üblich. Bakterien können jedoch das "Gift" rekombinieren und schließlich im Laufe der Zeit die Plasmide verlieren. Wenn das Toxin auf dem Chromosom kodiert ist, ist es etwas robuster.

4 Schlechte Plasmide

Siehe Suchtmodule und Toxin-Antitoxin-Systeme oben.

Ich fürchte im Allgemeinen, ich glaube, Sie unterschätzen die Evolution!


Könnten Plasmide und Konjugationsmechanismen gegen antibiotikaresistente Bakterien eingesetzt werden?

Anscheinend ja. Zumindest ist es plausibel. Die Studie ist sehr neu und obwohl sie durchgeführt wurde in vivo, es war noch unter künstlichen Bedingungen. Wir müssen sehen, was dabei herauskommt.

Die wichtigsten modernen Antibiotikaresistenzgene breiten sich zwischen solchen Spezies auf selbstübertragbaren (konjugativen) Plasmiden aus. Diese Plasmide werden traditionell auf der Grundlage der Replikon-Inkompatibilität (Inc) gruppiert, was die Koexistenz verwandter Plasmide in derselben Zelle verhindert. Diese Plasmide verwenden auch Post-Segregation-Tötungs-(„Sucht“)-Systeme, die alle Bakterienzellen vergiften, die das süchtig machende Plasmid verlieren, um ihr eigenes Überleben zu garantieren. Diese Studie zeigt, dass Plasmid-Inkompatibilitäten und Suchtsysteme ausgenutzt werden können, um eine sichere und vollständige Ausrottung der Antibiotikaresistenz von Bakterien in vitro und im Mausdarm zu erreichen. Konjugative "Interferenzplasmide" wurden konstruiert, indem Toxin- und Antibiotikaresistenzgene spezifisch aus Zielplasmiden entfernt wurden. Diese Interferenzplasmide heilten effizient das entsprechende antibiotikaresistente Zielplasmid aus verschiedenen Enterobakterien in vitro und wiederhergestellte Antibiotika-Empfindlichkeit in vivo auf alle Bakterienpopulationen, in die sich die Plasmid-vermittelte Resistenz ausgebreitet hatte. Dieser Ansatz könnte die Ausrottung neu auftretender oder etablierter Populationen von Resistenzplasmiden bei Personen mit dem Risiko einer schweren Sepsis ermöglichen, was die anschließende Verwendung weniger toxischer und/oder wirksamerer Antibiotika ermöglicht, als dies sonst möglich wäre, wenn sich eine Sepsis entwickelt. Die Verallgemeinerbarkeit dieses Ansatzes und seine möglichen Anwendungen bei der biologischen Sanierung von Tier- und Umweltmikrobiomen sollten nun systematisch untersucht werden.

Die Idee ist, dass ein natürliches, süchtig machendes Plasmid, das Antibiotikaresistenz verleiht, aus einer Bakteriengemeinschaft durch ein inkompatibles Plasmid verdrängt wird, das das geeignete Antitoxin für das Suchtsystem und Tetracyclinresistenz exprimiert.

Replikon (durchgezogener Kreis), Antitoxin- und Toxin-Gene (Pfeilspitze, Pfeil) und Antibiotikaresistenzgene (CTXR, orange und TETR, schwarze durchgezogene Blöcke). Interferenzplasmid, das durch das Eintrittsausschlusssystem (EES) nicht ausgeschlossen ist, ist mit dem residenten CTXR-Plasmid inkompatibel (INC) und wird durch TET selektiert.

Im oberen Weg hat keine Konjugation stattgefunden und das Bakterium behält das ursprüngliche Plasmid. Tetracyclin tötet diese Population. Im unteren Weg ist Konjugation aufgetreten, und wegen der Inkompatibilität zwischen dem natürlichen Plasmid und dem interferierenden Plasmid führt die binäre Spaltung zu einer asymmetrischen Segregation derselben. Auch hier wird das natürliche Suchtsystem umgangen, da das störende Plasmid das Antitoxin exprimiert. Die Population, die das ursprüngliche Plasmid enthält, wird durch Tetracyclin abgetötet, aber die Population, die das interferierende Plasmid enthält, ist resistent. Da dieses Plasmid jedoch nicht das vollständige Suchtsystem besitzt, geht es ohne Selektion mit der Zeit verloren. Somit ist die resultierende Bakterienpopulation antibiotikaempfindlich.

Sie werden sich vielleicht fragen, warum nicht von vornherein Tetracyclin verwendet wird, um alle Zellen abzutöten. Das ist nicht der Punkt! Dies ist ein Proof of Concept.

Eine aufreinigende Selektion mit Antibiotika ist nicht ideal, sowohl wegen der Wirkung des Medikaments auf andere Zellen als auch weil wirksame Antibiotika für diesen Zweck in Zukunft immer schwieriger zu identifizieren sein werden. TETR-Bakterien sind im menschlichen Darm keine Seltenheit, aber TETR-(oder FOSR-)Populationen, die durch Plasmiderwerb entstehen, verlieren nicht nur spontan ihre TETR- oder FOSR-Plasmide, sondern werden dabei sofort anfällig für andere häufig verwendete Antibiotika (z. B. GEN, CTX) . Ein Zielplasmid, das FOSR durch Rekombination mit dem Interferenzplasmid erhält, wird wahrscheinlich das unmittelbar benachbarte Antitoxin erwerben. Eine wichtige zukünftige Herausforderung ist die Entwicklung von Interferenzplasmiden mit nicht-antibiotischer Selektion die Aufnahme von fosA3 bedeutet jedoch auch, dass die Plasmid-Eradikation mit der bestehenden Anwendung von Fosfomycin als „Rettungstherapie“ als letztes Mittel vereinbar ist.


Ihre Ideen sind nicht schlecht, aber in jedem Fall gibt es einige Gründe, die sie in einer realen (medizinischen) Anwendung so gut wie unbrauchbar machen. Auch löst keiner Ihrer Ansätze das Problem der Resistenz: Bakterien können gegen diese neue Art der Behandlung einfach resistent werden (die Bakterien, die etwas andere Konjugationsmethoden verwenden, sind immun und haben einen evolutionären Vorteil).

1) Das könnte funktionieren - aber nicht heute. Sie brauchen entweder eine Art Nanobot oder eine sehr fortschrittliche Gentechnik, um dies zu erreichen. Während die Technologie zur Herstellung solcher fortschrittlicher „Killermaschinen“ innerhalb der nächsten Jahrhunderte verfügbar sein sollte, wird die ethische Frage, sie in einen menschlichen Körper oder die Umwelt „freizugeben“, immer sehr knifflig bleiben.

2) Ich denke, das ist zu kompliziert. Antibiotika sind sehr kleine chemische Moleküle, während die bakterielle Konjugationsmaschinerie ein sehr großer biologischer Komplex ist. Der Versuch, etwas dazu zu bringen, die Maschinerie zu binden und sie dann in die Lage zu versetzen, die Bakterien abzutöten, ist überflüssig - Sie könnten einfach erst Antikörper gegen die Bakterien herstellen (sie können auch mit Effektoren gekoppelt werden). Außerdem löst es jetzt das Problem des sich entwickelnden Widerstands

3/4) Die zusätzliche Komplexität hilft nicht. Der Versuch, Bakterien mit 'trojanischen Pferden'-Plasmiden auszutricksen, wird nicht funktionieren. Zuallererst wird die Evolution gegen das gesamte Plasmid arbeiten und nur weil es ein günstiges Gen hat, können Bakterien es nicht einfach loswerden, wenn es sie sonst töten würde. Zweitens können Mutationen unanständig auf die Gene des Plasmids einwirken, sodass die Bakterien einfach den Teil ausschalten können, der sie töten soll, und den Rest behalten.


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Wie das CRISPR-Cas-System zur Bekämpfung der antimikrobiellen Resistenz eingesetzt werden könnte

Zur Veröffentlichung angenommen 31. März 2020

Veröffentlicht 20. April 2020 Band 2020:13 Seiten 1111&mdash1121

Auf Plagiate geprüft Jawohl

Kommentare von Peer-Reviewern 2

Herausgeber, der die Veröffentlichung genehmigt hat: Professor Suresh Antony

1

1 Student Research Committee, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran 2 Biotechnology Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran 3 Department of Infectious Diseases and Clinical Microbiology, University of Health Sciences, Tepecik Training and Research Hospital, İzmir, Türkei 4 Faculté de Médecine, de Pharmacie et d&rsquoOdonto-Stomatologie (FMPOS), University of Bamako, Bamako, Mali 5 Department of Microbiology, Baku State University, Baku, Republic of Aserbaidschan 6 Department of Basic Sciences, Maragheh University of Medical Sciences, Maragheh , Iran 7 Department of Clinical Microbiology, Fakultät für Medizin, Ankara Yildirim Beyazit University, Ankara, Türkei 8 Immunology Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran 9 Drug Applied Research Center, Tabriz University of Medical Sciences, Tabriz, Iran

Korrespondenz: Hossein Samadi Kafil
Zentrum für angewandte Arzneimittelforschung, Täbriz Universität für Medizinische Wissenschaften, Täbris, Iran
Tel +98 9127184735
Fax +98 4133364661
E-Mail [E-Mail geschützt]

Abstrakt: Das schnelle Auftauchen antibiotikaresistenter Bakterien hat es uns erschwert, Infektionskrankheiten zu bekämpfen und neue Antibiotika zu entwickeln. Das geclusterte, regelmäßig angeordnete, kurze palindromische Wiederholungen &ndash CRISPR-assoziierte (CRISPR-Cas)-System gilt als bakterielles adaptives Immunsystem als eine der neuen Strategien zur Bekämpfung antibiotikaresistenter Stämme. Die programmierbare Cas-Nuklease dieses Systems, die gegen bakterielle Genomsequenzen verwendet wird, könnte tödlich sein oder dazu beitragen, die Resistenz von Bakterien gegen Antibiotika zu verringern. Daher zielt diese Studie darauf ab, die Verwendung des CRISPR-Cas-Systems zu überprüfen, um sensibilisierende Bakterien für Antibiotika zu fördern. Wir stellen uns vor, dass CRISPR-Cas-Ansätze neue Wege für die Entwicklung intelligenter Antibiotika eröffnen könnten, die multiresistente (MDR) Pathogene eliminieren und zwischen nützlichen und pathogenen Mikroorganismen unterscheiden könnten. Diese Systeme können genutzt werden, um einzelne Bakterienstämme auf sequenzspezifische Weise quantitativ und selektiv zu eliminieren, was Möglichkeiten bei der Behandlung von MDR-Infektionen, der Untersuchung mikrobieller Konsortien und der Kontrolle der industriellen Fermentation eröffnet.

Schlüsselwörter: antibiotikaresistente Bakterien, CRISPR-Cas-System, sequenzspezifisch, Resensibilisierung, Genome Editing


Eine neue bakterientötende Waffe im Kampf gegen Antibiotikaresistenzen

Kredit: CC0 Public Domain

Als Anfang des 20. Jahrhunderts die ersten Antibiotika entdeckt wurden, ging die Sterberate durch Infektionskrankheiten dramatisch zurück. Doch das Aufkommen multiresistenter Bakterien durch Antibiotika-Missbrauch lässt befürchten, dass diese Krankheiten bis 2050 wieder weltweit die häufigste Todesursache sein werden. Um das zur Bekämpfung dieser Bedrohung verfügbare Arsenal zu stärken, haben Wissenschaftler des Institut Pasteur, des CNRS und der Universidad Politécnica de Madrid erfolgreich eine bakterielle genetische Struktur programmiert, die es ermöglicht, mehrere antibiotikaresistente Bakterien gezielt abzutöten, ohne auch Bakterien zu zerstören, die sind wohltuend für den Körper. Im Gegensatz zu anderen in Entwicklung befindlichen Ansätzen ist dieses neuartige Werkzeug mit einer minimalen Rate des Auftretens neuer Resistenzen verbunden. Die Ergebnisse wurden in der Zeitschrift veröffentlicht Natur Biotechnologie am 15.04.2019.

Die Entdeckung von Antibiotika in den 1930er Jahren ebnete den Weg für beispiellose medizinische und gesellschaftliche Fortschritte. Aber in den letzten 20 Jahren sind bakterielle Resistenzmechanismen aufgetreten, die sich über den ganzen Planeten ausbreiten. Es werden nur wenige neue Antibiotika entwickelt und die Zeit von der Einführung einer Therapie bis zum anschließenden Resistenzerwerb wird immer kürzer. Resistenzen gefährden unsere Fähigkeit, Infektionskrankheiten zu behandeln, was zu Behinderung und Tod führt.

Bei einer antibiotischen Behandlung greifen die therapeutischen Moleküle alle Bakterien der Mikrobiota an. Diese nicht gezielte Zerstörung führt zu einer Dysbiose, also einer Störung des Gleichgewichts des bakteriellen Ökosystems, die zur Entstehung opportunistischer Bakterien oder Resistenzen gegen das eingesetzte Antibiotikum führen kann. Die schädlichen Auswirkungen der Dysbiose können durch die Entwicklung hochspezifischer antimikrobieller Strategien verhindert werden. Das CRISPR-Cas9-Tool kann beispielsweise verwendet werden, um die Resistenzgene in pathogenen Bakterien zu bekämpfen, aber die mit dieser Technik verbundene Fluchtrate (wenn es dem Pathogen gelingt, den verschiedenen Abwehrmechanismen des infizierten Organismus zu entkommen) ist relativ hoch.

In dieser Studie entwickelte ein wissenschaftliches Team unter der Leitung von Didier Mazel, Professor am Institut Pasteur, eine alternative Strategie, die auf der spezifischen Expression extrem starker Toxine basiert, die durch Konjugation abgegeben werden. Konjugation ist ein Verfahren, das von Bakterien verwendet wird, um Gene über Plasmide auszutauschen, DNA-Moleküle, die spezifisch für bakterielle Genome sind. Bei dieser neuen Strategie befindet sich das für das Toxin kodierende Gen innerhalb des Plasmids. „Die Verwendung von Toxinen aus dem Typ-II-Toxin-Antitoxin-System schien eine gute Idee zu sein, da Bakterien anscheinend keine Resistenz gegen dieses Arsenal entwickeln. Aber eine der Herausforderungen dieser Methode besteht darin, die schiere Kraft dieser Toxine zu kontrollieren. Dazu haben wir ihre Gene in zwei Fragmente zerlegt, um sicherzustellen, dass sie nur wirksam sind, wenn die beiden Teile rekombiniert werden könnten“, erklärt Didier Mazel, Erstautor der Studie.

Die Wissenschaftler bestätigten die spezifische Natur dieses Toxins in Vibrio cholerae, einem marinen Bakterium, dessen natürliche Wirte bestimmte Fische und Schalentiere sind. „Wir wollten zunächst die Toxin-Expression in Vibrio cholerae aktivieren, indem wir einen Promotor (eine für die Transkription benötigte DNA-Region) verwenden, der von diesem Bakterium spezifisch erkannt wird und den Toxin-Komplex exprimiert und aktiviert“, sagt Didier Mazel. Diese "Waffe" verfeinerten sie dann weiter, sodass das Toxin nur noch gegen Antibiotika-resistente Stämme von Vibrio cholerae wirken konnte. Dabei wurde ein genetisches Modul geschaffen, das einen hochspezifischen Toxin-Inhibitor, ein Antitoxin, exprimiert, das nicht mehr produziert wird, wenn das Bakterium Resistenzgene enthält. Durch die Kombination dieser beiden Verfahren entwickelten sie eine genetische Struktur, deren Wirksamkeit in den komplexen natürlichen Bakteriengemeinschaften der Zebrafisch- und Artemia-Mikrobiota in vivo nachgewiesen wurde.

„Der Fluchtweg für diese alternative Strategie ist sehr gering. Sie lässt sich leicht an die spezifische Zerstörung mehrerer anderer Krankheitserreger anpassen. Wir müssen nun den Prozess der Genübertragung durch das Plasmid verbessern“, sagt Didier Mazel.


GENETISCHE GRUNDLAGE DER ANTIMIKROBIELLEN BESTÄNDIGKEIT

Bakterien haben eine bemerkenswerte genetische Plastizität, die es ihnen ermöglicht, auf eine Vielzahl von Umweltbedrohungen zu reagieren, einschließlich des Vorhandenseins von antibiotischen Molekülen, die ihre Existenz gefährden können. Wie bereits erwähnt, haben Bakterien, die dieselbe ökologische Nische mit antimikrobiell produzierenden Organismen teilen, uralte Mechanismen entwickelt, um der Wirkung des schädlichen Antibiotikummoleküls zu widerstehen, und folglich erlaubt ihnen ihre intrinsische Resistenz, in seiner Gegenwart zu gedeihen. Aus evolutionärer Sicht verwenden Bakterien zwei wichtige genetische Strategien, um sich an das Antibiotikum 𠇊ttack” anzupassen: ich) Mutationen in Genen, die oft mit dem Wirkmechanismus der Verbindung in Verbindung gebracht werden, und ii) Erwerb fremder DNA, die für Resistenzdeterminanten kodiert, durch horizontalen Gentransfer (HGT).

Mutationsresistenz

In diesem Szenario entwickelt eine Untergruppe von Bakterienzellen, die aus einer anfälligen Population stammen, Mutationen in Genen, die die Aktivität des Arzneimittels beeinflussen, was zu einem konservierten Zellüberleben in Gegenwart des antimikrobiellen Moleküls führt. Sobald eine resistente Mutante auftaucht, eliminiert das Antibiotikum die anfällige Population und die resistenten Bakterien überwiegen. In vielen Fällen sind Mutationsänderungen, die zu Resistenzen führen, für die Zellhomöostase kostspielig (d. h. verminderte Fitness) und werden nur bei Bedarf in Gegenwart des Antibiotikums aufrechterhalten. Im Allgemeinen verändern Mutationen, die zu einer Antibiotikaresistenz führen, die antibiotische Wirkung über einen der folgenden Mechanismen: ich) Modifikationen des antimikrobiellen Ziels (Verringerung der Affinität zum Wirkstoff, siehe unten), ich) eine Abnahme der Medikamentenaufnahme, ii) Aktivierung von Efflux-Mechanismen, um das schädliche Molekül zu extrudieren, oder NS) globale Veränderungen wichtiger Stoffwechselwege durch Modulation regulatorischer Netzwerke. Daher ist die Resistenz, die aufgrund erworbener Mutationsänderungen entsteht, vielfältig und variiert in ihrer Komplexität. In diesem Kapitel werden wir einige Beispiele für antimikrobielle Resistenzen geben, die durch Mutationsänderungen entstehen (siehe unten).

Horizontaler Gentransfer

Der Erwerb von fremdem DNA-Material durch HGT ist einer der wichtigsten Treiber der bakteriellen Evolution und häufig verantwortlich für die Entwicklung antimikrobieller Resistenzen. Die meisten in der klinischen Praxis verwendeten antimikrobiellen Wirkstoffe sind (oder stammen von) Produkten, die natürlicherweise in der Umwelt (meist Boden) vorkommen. Wie bereits erwähnt, beherbergen Bakterien, die die Umgebung mit diesen Molekülen teilen, intrinsische genetische Determinanten der Resistenz, und es gibt belastbare Beweise dafür, dass ein solches ȁumweltresistentes Resistom” eine produktive Quelle für den Erwerb von Antibiotikaresistenzgenen in klinisch relevanten Bakterien ist. Darüber hinaus ist dieser genetische Austausch an der Verbreitung von Resistenzen gegen viele häufig verwendete Antibiotika beteiligt.

Klassischerweise erwerben Bakterien externes genetisches Material durch drei Hauptstrategien: ich) Transformation (Einbau nackter DNA), ii) Transduktion (Phagen-vermittelt) und, iii) Konjugation (bakteriell “sex”). Die Transformation ist vielleicht die einfachste Art von HGT, aber nur eine Handvoll klinisch relevanter Bakterienarten sind in der Lage, “natürlich” nackte DNA einzubauen, um Resistenzen zu entwickeln. Das Auftreten von Resistenzen in der Krankenhausumgebung beinhaltet oft Konjugation, eine sehr effiziente Methode des Gentransfers, die einen Zell-zu-Zell-Kontakt beinhaltet und wahrscheinlich im Magen-Darm-Trakt von Menschen unter Antibiotikabehandlung mit hoher Wahrscheinlichkeit auftritt. In der Regel verwendet die Konjugation mobile genetische Elemente (MGEs) als Vehikel, um wertvolle genetische Informationen auszutauschen, obwohl auch der direkte Transfer von Chromosom zu Chromosom gut charakterisiert wurde (9). Die wichtigsten MGEs sind Plasmide und Transposons, die beide eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung und Verbreitung von Antibiotikaresistenzen bei klinisch relevanten Organismen spielen.

Schließlich wird einer der effizientesten Mechanismen zur Akkumulation antimikrobieller Resistenzgene durch Integrone repräsentiert, bei denen es sich um ortsspezifische Rekombinationssysteme handelt, die in der Lage sind, offene Leserahmen in Form mobiler Genkassetten zu rekrutieren. Integrone bieten einen effizienten und relativ einfachen Mechanismus für das Hinzufügen neuer Gene in bakterielle Chromosomen, zusammen mit der notwendigen Maschinerie, um ihre Expression sicherzustellen, eine robuste Strategie des genetischen Austauschs und einer der Hauptantriebskräfte der bakteriellen Evolution. Für Details zu den Mechanismen der HGT werden die Leser auf eine aktuelle Übersicht über den Stand der Technik verwiesen (10).


Vielzahl von Resistenzmechanismen in Produzentenorganismen

Die meisten Produzentenorganismen enthalten mehrere Mechanismen zur Selbstresistenz. Zum Beispiel, S. peucetius verlässt sich auf DrrAB, um Doxorubicin auszuscheiden (Li et al., 2014, Brown et al., 2017), DrrC, um das Antibiotikum aus seiner Ziel-DNA zu entfernen (Prija und Prasad, 2017), und DrrD wird möglicherweise verwendet, um das Antibiotikum in ein inaktives zu modifizieren (Karuppasamy et al., 2015). Darüber hinaus gibt es auch eine Serinprotease, die Daunorubicin sequestrieren kann, um seinen Wiedereintritt in die Zelle nach dem Efflux zu verhindern (Dubey et al., 2014). Andere Beispiele für Produzenten, die mehrere Mechanismen zur Selbstresistenz aufweisen, sind die folgenden: Mikrobispora ATCC PTA-5024 enthält sowohl eine Effluxpumpe (MlbJYZ) als auch ein Sequestrationsprotein (MlbQ) zum Schutz vor NAI-107 (Pozzi et al., 2016) S. Rimosus hat eine ABC-Multidrug-Efflux-Pumpe (OtrC) (Yu et al., 2012) und eine MFS-Pumpe (OtrB) für den Efflux von Oxytetracyclin (Mak et al., 2014) zusammen mit OtrA zum Schutz des Ribosoms durch Antibiotika-Entfernung (Doyle et al., 1991) S. fradiae enthält mehrere Genprodukte (TlrA, TlrB und TlrD), die das Ribosom modifizieren, um die Tylosin-Bindung zu verhindern, und verwendet TlrC für den Efflux (Mak et al., 2014) und S. chattanogensis L10 enthält mehrere verschiedene Effluxpumpen für die Resistenz gegen Natamycin (Wang et al., 2017).


Transposons

Resistenztransposons sind im Wesentlichen springende Gensysteme, die ein Resistenzgen innerhalb des Elements enthalten. Sie kommen in vielen Formen vor, unterscheiden sich durch Struktur, genetische Verwandtschaft und Transpositionsmechanismus und können eine Vielzahl von Resistenzgenen tragen (Bennett, 2005). Die Abbildungen ( Tabellen 1 und ​ und 2) 2 ) sind nur einige der bekannten. Alle diese Elemente haben die Fähigkeit, sich sowohl intra- als auch intermolekular zu bewegen, d. h. sie können innerhalb eines DNA-Moleküls von einer Stelle zur anderen oder von einem DNA-Molekül zum anderen springen, zum Beispiel von einem Plasmid zum anderen oder von a Plasmid auf ein bakterielles Chromosom und und umgekehrt. Diese Mechanismen erfordern im Allgemeinen keine DNA-Homologie zwischen dem Element und den Insertionsstellen und obwohl es Beispiele gibt, in denen ein bestimmtes Transposon eine starke Präferenz für eine bestimmte Nukleotidsequenz an einer Insertionsstelle hat, zeigen viele andere keine offensichtliche Präferenz und inserieren an neuen Stellen mehr oder weniger zufällig (Craig, 1997).

Tabelle 1

TransposonGröße (kb)AnschlusselementeMarkierung(en)
Gramnegative Elemente
ȃTn55.7IST50 (IR)KmBlSm
ȃTn92.5IST1 (DR)Cm
ȃTn109.3IST10 (IR)Tc
ȃTn9033.1IST903 (IR)km
ȃTn15254.4IST15 (DR)km
ȃTn235010.4IST1 (DR)km
    
Grampositive Elemente
ȃTn40014.7IST256 (IR)GmTbKm
ȃTn40033.6IST257 (DR)Tm

Resistenz-Phänotypen: Bl, Bleomycin Cm, Chloramphenicol Gm, Gentamicin Km, Kanamycin Sm, Streptomycin Tb, Tobramycin Tc, Tetracyclin Tm, Trimethoprim.

Abkürzungen: bp, Basenpaar DR, direkte Wiederholung IR, invertierte Wiederholung kb, Kilobase.

Tabelle 2

TransposonGröße (kb)Terminal-IRs (bp)Markierung(en)
Gramnegative Elemente
ȃTn1538/38Ap
ȃTn3538/38Ap
ȃTn212035/38SmSuHg
ȃTn5018.235/38Hg
ȃTn172111.435/38Tc
ȃTn39267.836/38Hg
    
Grampositive Elemente
ȃTn5515.335Ery
ȃTn9175.338Ery
ȃTn44516.212Cm

Resistenz-Phänotypen: Ap, Ampicillin Cm, Chloramphenicol Ery, Erythromycin Hg, Quecksilberionen Sm, Streptomycin Su, Sulfonamid Tc, Tetracyclin.

Abkürzungen: bp, Basenpaar IR, invertierte Wiederholung kb, Kilobase.

Transposons gehören zu der Gruppe mobiler Elemente, die als transponierbare Elemente bezeichnet werden und die kleine kryptische Elemente, die als Insertionssequenzen (IS-Elemente) bezeichnet werden, Transposons und transponierende Bakteriophagen, wie Bakteriophagen μ, umfassen (Bennett, 2004). Dieser letzte Elementtyp ist ein bakterielles Virus, das zur Replikation eine Transposition verwendet. Ein Transposon unterscheidet sich von einem IS-Element dadurch, dass es mindestens eine Funktion kodiert, die den Phänotyp der Zelle auf vorhersagbare Weise verändert, beispielsweise verleiht ein Resistenztransposon eine Resistenz gegen ein oder mehrere bestimmte Antibiotika.

Transposons sind entweder modulare Systeme, die als zusammengesetzte Transposons bezeichnet werden, aufgebaut aus einem Paar von IS-Elementen und einer zentralen DNA-Sequenz, die von Natur aus nicht in der Lage ist, zu transponieren, deren Expression den Zellphänotyp verändert ( Abbildungen 2 und ​ und 3) 3 ) oder komplexe Systeme, bei denen Transpositions- und Nicht-Transpositionsfunktionen offensichtlich nicht modular aufgebaut sind ( Abbildung 4 ). Für ein IS-Element-abhängiges Resistenz-Transposon werden zwei Kopien desselben IS-Elements als flankierende terminale Strukturen benötigt, entweder als direkte oder invertierte Wiederholungen, zum zentralen Abschnitt, der das/die Gen(e) enthält, das/die Antibiotikaresistenz verleihen. Obwohl die invertierte Anordnung von IS-Elementen genetisch stabiler ist, bietet die direkte Wiederholungsanordnung Möglichkeiten, an eine andere Stelle zu migrieren, an der auch das IS-Element gefunden wird. Dies geschieht durch einen zweistufigen homologen Rekombinationsprozess, bei dem zuerst ein Teil der Kompositstruktur durch einen einzelnen Crossover zwischen den Kopien des IS-Elements aus seiner bestehenden Stelle herausgeschnitten wird, wobei eine zirkuläre, doppelsträngige DNA-Spezies freigesetzt wird, die den zentralen Abschnitt des Komposits umfasst Resistenztransposon und eine Kopie des IS-Elements, die andere verbleibt an der ursprünglichen genetischen Stelle. Die freigesetzte DNA kann dann im Wesentlichen durch Umkehren der ersten Rekombination durch homologe Rekombination mit einem einzigen Crossover unter Verwendung der Kopie der IS-Sequenz auf dem freien Zwischenprodukt und einer weiteren Kopie an der neuen Stelle gerettet werden, die das zusammengesetzte Transposon an der neuen Stelle wieder herstellt Seite? ˅. Da IS-Elemente im Allgemeinen an vielen verschiedenen Stellen, insbesondere auf verschiedenen Plasmiden, gefunden werden können, ist das Potenzial, Resistenzgene mit dieser Methode zu bewegen, beträchtlich. Dementsprechend gibt es Vor- und Nachteile bei beiden Anordnungen. Die Transpositionsmodule, die IS-Elemente, behalten im Allgemeinen die Fähigkeit, sowohl als einzelne Elemente als auch als Teil der Verbundstruktur zu transponieren. Dies ist bei komplexen Elementen nicht der Fall, die bezüglich der Transposition unteilbar sind. Die bekannten Transposons Tn5, kodierend für Resistenz gegen Aminoglykoside wie Kanamycin und Neomycin und Tn10 Resistenz gegen Tetracyclin kodieren, sind zusammengesetzte Elemente, die in einer Reihe von Gram-negativen Bakterien, insbesondere Mitgliedern der Enterobacteriaceae, vorkommen. Solche zusammengesetzten Strukturen werden zufällig erzeugt und werden in einer Zellpopulation durch die auf die Bakterienflora wirkenden selektiven Kräfte, z. Mit der Zeit neigt die Struktur zu Veränderungen, die sie stabilisieren. Viele dieser Elemente können eine relativ junge Genese haben. Im Gegensatz dazu ist Tn3, kodierend für Resistenz gegen eine Reihe von β-Lactam-Antibiotika, einschließlich Ampicillin und Tn21 ( 5 ), die Resistenz gegen Streptomycin, Spectinomycin und Sulfonamide sowie Quecksilberionen kodieren, sind Beispiele für komplexe Transposons und werden auch häufig auf Plasmiden in Mitgliedern der Enterobacteriaceae gefunden. Die Konstruktion dieses Elementtyps ist weniger leicht zu erklären, und es wurde noch kein allgemeines evidenzbasiertes Modell vorgeschlagen, obwohl Aspekte der Konstruktion einiger komplexer Transposons wie Tn21, abgeleitet werden. Tn3, Tn21 and similar elements are likely to be of somewhat greater antiquity than most composite transposons and are probably the results of multiple recombination events, including both insertions and deletions, which first insert non-transposition functions into a cryptic element and then refine the sequence by deletion to eliminate ‘non-essential' functions. This refinement would make the element more compact and hence more readily transposable. It has been demonstrated that increasing the size of a particular transposable element reduces its frequency of transposition.

A diagrammatic representation of the composite resistance transposon Tn5 that confers resistance to kanamycin, bleomycin and streptomycin. O, I, outside and inside boundaries of the terminal inverted IS50 elements accommodating the short terminal inverted repeats (IRs) that define IS50L (left-hand copy of IS50) and IS50R (right-hand copy of IS50) and that are essential for transposition of both IS50 and Tn5 km, kanamycin resistance gene bl, bleomycin resistance gene sm, streptomycin resistance gene tnp, gene encoding the IS50 transposase inh, gene encoding an inhibitor of the IS50 transposase bp, base pairs (for further information see Reznikoff, 2002).

A diagrammatic representation of the composite resistance transposon Tn10 that confers resistance to tetracyclines. Tn10 displays terminal inverted repeats of IS10 IS10L, left-hand copy of IS10, a non-functional copy of IS10 due to multiple mutations in the transposase gene IS10R, right-hand copy of IS10 that encodes a functional transposase and an antisense RNA molecule used for downregulated expression of the transposase gene IR, short inverted repeat sequences found at the extremities of IS10, which are essential for transposition of both IS50 and Tn10 tetA, gene encoding the tetracycline resistance efflux pump tetC,D, genes co-regulated with tetEIN tetR, gene encoding a transcriptional repressor necessary for inducible expression, by tetracycline, of tetracycline efflux pump TetA bp, base pairs (for further information see Haniford, 2002).

A diagrammatic representation of the complex resistance transposon Tn3 that confers resistance to ampicillin and some other β-lactam antibiotics. IR, the short inverted repeated sequences found at the extremities of the transposon, which are essential for Tn3 transposition tnpA, gene encoding element's transposase tnpR, gene encoding a site-specific recombinase that resolves the transposition cointegrate structure generated by transposition blaTEM-1, gene encoding the TEM-1 β-lactamase bp, base pairs kb, kilobase.

A diagrammatic representation of the complex resistance transposon Tn21 that confers resistance to streptomycin, spectinomycin, sulphonamides and mercuric ions. merTPCAD, genes encoding resistance to mercuric ions and some organo-mercurial compounds merR, gene encoding the transcriptional repressor of the inducible mer operon sul1, gene encoding resistance to sulphonamides aadA1, gene encoding resistance to streptomycin and spectinomycin int, integrase gene attI, integron gene cassette insertion site tnpA, gene encoding the Tn21 transposase tnpR, gene encoding a site-specific recombinase responsible for resolution of the transposition cointegrate structure generated by transposition pint, int promoter pC, promoter for integron gene cassettes and sul1.


DISKUSSION

Tools for vor Ort microbiota manipulation are currently in their infancy. Here, we demonstrate the ability of the TAP antibacterial strategy to exert an efficient and strain-specific antibacterial activity within multi-species populations in vitro. TAPs selective-killing activity induces a ∼4-log viability loss of the tested species. TAPs targeting the pOXA-48a carbapenem resistance-plasmids results in a 4- to 5-logs increase of the strain susceptibility to the drug. Most CRISPR delivery methodology currently in development focus on the use of bacteriophages, which have intrinsically narrow host-range ( 35, 36, 7). Besides, several recent studies successfully use the broad host range RK2 conjugation systems to deliver CRISPR system that target E coli ( 7–9, 37) or S. enterica ( 11) in vitro. One key advantage of our strategy over these approaches is the versatility conferred by the CSTB algorithm that enables the robust identification of gRNA that should be used to specifically re-target the TAPs against one or several bacterial strains of interest, without targeting other species. Despite the availability of numerous programs dedicated to the identification of CRISPR motifs, the CSTB has no equivalent so far ( 34). Another advantage is the modular design and the relatively small size of the mobilizable TAPs (compared to autonomous conjugation plasmids) that are easily modifiable. The spacer sequence that directs the TAP against the targeted strain(s), as well as the other constituent biobricks (origin of replication, origin of transfer, Cas9, resistance gene) can be changed in one-step-cloning (see methods), thus enabling the rapid construction of a library of TAPs adapted to the considered applications. Finally, the constitutive expression of the CRISPR system (and the fluorescent reporters) from promoter that are active in a wide range of Enterobacteriaceae avoids the requirement for an external inductor, rendering the TAP approach more suitable for the modification of natural bacterial communities in vivo.

TAPs designed to induce Cas9-mediated double-stranded-breaks (DSBs) to the chromosome of the targeted bacteria trigger significant viability loss. However, we observe the emergence of targeted bacteria that have evolved mutations allowing them to survive despite the acquisition of the TAP. The frequency of these TAP-escape mutants varies from ∼3 × 10 −4 to 6 × 10 −5 depending on the spacer and the recipient strains used (Figures 1D, 3A, 4B and 5B). The phenotypic and sequence analysis of E coli und C. rodentium escape-mutants reveal two main mechanisms to escape TAP activity: (i) The first mechanism is the acquisition of insertions (transposase or Insertion Sequences, IS) or single nucleotide deletions that inactivate the cas9 gene carried by the TAP. These types of mutations allowing bacteria to escape CRISPR activity have been previously reported to occur with comparable frequency ( 7, 38, 39, 11). It has also been reported that mutations or deletions within either tracrRNA or crRNA sequences is another way to inactivate CRISPR systems ( 7, 40, 39, 38). Yet, no such mutations were found in the C. rodentium Noch E coli TAP-escape mutants analysed, potentially due to their lesser frequency of occurrence. (ii) The second mechanism we have identified is the acquisition of point mutations or deletion that modify the targeted locus, thus impeding the recognition by the gRNA. These were also previously described ( 15, 28, 11, 38, 7). When using TAPs that target one chromosome locus in E coli und C. rodentium, escape-mutations occur by cas9-inactivation (first mechanism) in 38.7 and 42.8%, and by modification of the targeted locus (second mechanism) in 61.3% and 57.2%, correspondingly.

We show that the contribution of escape mutations by modification of the chromosome sequence can be dramatically, if not completely reduced by directing the TAPs against multiple chromosome loci. Indeed, the probability of mutating multiple chromosome sites within the same bacterial cell is expected to decrease as the number of targeted sites increases. When using the Cr22 spacer that targets 22 loci of C. rodentium chromosome, all the nineteen escape-mutants tested carry mutations that inactivate the TAP-born cas9 Gen. Consequently, we observe a 2.9-fold decrease in the frequency of TAP-Cas9-Cr22 escapers (8.56 × 10 −5 ) compare to TAP-Cas9-Cr1 (2.47 × 10 −4 ) that targets one single chromosome locus. This decrease is consistent with our estimates of the relative contributions of each escape mechanisms.

The observed frequency of escape mutations by cas9 inactivation is likely related to the intrinsic rate of transposition estimated to oscillate between 10 −5 to 10 −6 in E coli ( 41) and the rate of spontaneous mutations (10 −8 and 10 −10 per base pair and generation). In the case of TAPs, it is also possible that the induction of DSBs results in the increase of the mutation rates through the triggering of SOS-induced hypermutator phenotype. Cui and Bikard demonstrated that one way to improve CRISPR efficiency in E coli host cell is to inhibit RecA activity, which is essential to DSB repair and to the induction of the SOS-response ( 15). Moreb et al. further proposed to inhibit RecA activity by co-expressing the CRISPR system with a dominant negative allele of the recA gene ( 42). These strategies are however less relevant in the case of the TAPs approach, as they would likely alter the recombination proficiency and thus the viability of the untargeted population.

We also addressed the possibility that part of the mutations in TAPs already emerge in the donor cells, thus resulting in the transfer of already inactive TAPs into the recipient target. This possibility is supported by the sequencing analysis of one C. rodentium escape mutant that has received TAP-Cas9-Cr1 from an E coli donor. The sequencing revealed the insertion in cas9 von insAB genes coding for transposase elements present in E coli but absent from C. rodentium Genome. This result indicates that mutation leading to TAPs inactivation can occur in the donor cells prior to transfer, without excluding that they might also emerge in the targeted recipient after plasmid acquisition.

Our work reveals that TAPs efficiency is primarily determined by two main limiting factors. The first limiting factor is the ∼10 −4 –10 −5 frequency of escaper clones that acquire mutations inactivating the plasmid-born cas9 gene, or mutations that modify the targeted sequence. The occurrence of escaper clones due to the acquisition of TAPs that have been inactivated before transfer could be reduced by using a transposon-free E coli donor strain ( 43). As shown in C. rodentium, the emergence of escaper clones by mutation of the targeted sequence can be avoided by targeting multiple sites on the genome. Alternatively, it has been shown that another way to avoid the emergence of escape mutants through the modification of the chromosome is to target essential genes, which mutation is often lethal for the cell ( 40). The second limiting parameter is the efficiency of TAPs transfer towards the targeted strain(s). This efficiency primarily depends on the conjugative system chosen to mobilize the TAPs. Here, we use the F plasmid as a helper plasmid that mediates relatively efficient TAPs transfer (10 −1 –10 −2 ) to closely related Enterobacteriaceae. Therefore, TAPs appear appropriate to target a range of clinically relevant pathogenic or resistant Gram-negative bacteria (E coli, Citrobacter, Enterobakterien, Klebsiella, Salmonellen, Yersinien, Shigella, Serratia,etc.). Recently, the narrow host range pPD1 plasmid has also been used to transfer CRISPR/Cas systems to the Gram-positive Enterococcus faecalis ( 44). Other reported antibacterial ( 7, 11) or anti-drug ( 8–10) methodology using conjugation are mostly based on the incP RK2 conjugative system, which offer broad-host range, but low efficiency of transfer (10 −4 –10 −5 ). Hamilton et al. have shown that transfer efficiency can be artificial increased using glass beads in vitro ( 11). It is also possible to isolate broad-host range conjugation systems with increased transferability. Such superspreader plasmid mutants have been successfully isolated through Tn-seq approach ( 45, 46) and could represent an valuable option to widen the range of bacteria toward which TAPs could be efficiently transferred.

Translating the present in vitro proof of concept to vor Ort settings would represent an important step towards the development of a non-antibiotic strategy for the vor Ort manipulation of microbiota composition, in a directed manner. The efficiency of the TAPs methodology within host-associated bacterial communities would primarily depend on conjugation rates vor Ort, which often differs from rates achieved in vitro ( 47). For instance, it was recently reported that the IncI2 plasmid TP114 and IncX type plasmids are very actively transferred in the mouse intestinal tract ( 47) and in human fecal microbiomes ( 48), respectively, making them good candidate to mobilize TAPs in these given ecosystems. TAPs could be used for the inhibition of harmful pathogenic and resistance strains from an infected host or environments, or as anti-virulence strategy through inhibition of virulence effector genes or genes involved in biofilm formation. The future implementation of the TAPs approach in clinical or environmental settings would require the consideration of the rapidly evolving regulations on GMO, CRISPR and biocontainment ( 49–51).


Genetically engineered plasmid can be used to fight antimicrobial resistance

Researchers have engineered a plasmid to remove an antibiotic resistance gene from the Enterococcus faecalis bacterium, an accomplishment that could lead to new methods for combating antibiotic resistance. The research is published this week in Antimikrobielle Wirkstoffe und Chemotherapie, a journal of the American Society for Microbiology.

In vitro, and in mouse models, the engineered plasmid removed the antibiotic resistance gene from E. faecalis. In mouse models, it reduced the abundance of the resistance gene threefold..

"Our concern with organisms that cause hospital-acquired infections that are resistant to many clinical antibiotic therapies motivated the research," said co-senior author Breck A. Duerkop, PhD, Assistant Professor of Immunology and Microbiology, University of Colorado School of Medicine, Anschutz Medical Center, Aurora.

E. faecalis is part of the normal, benign intestinal flora, but when antibiotics kill off beneficial intestinal flora, E. faecalis can become pathogenic. As such, it can also acquire single or multidrug resistance. Antibiotic resistant E. faecalis infections are a major problem in hospitals.

The mechanism used to remove antibiotic resistance genes is the specialized protein, CRISPR-Cas9. It can make cuts just about anywhere in DNA.

Along with CRISPR-Cas9, RNA sequences homologous to DNA within the antibiotic resistance gene have been added to the engineered plasmid. These RNAs guide the CRISPR-Cas9 to make the cuts in the right places.

Previous work in animal models by co-senior investigator Kelli L. Palmer, PhD, found that CRISPR-Cas9 could prevent intestinal E. faecalis from acquiring resistance genes. Dr. Palmer is Fellow, Cecil H. and Ida Green Chair in Systems Biology Science, Associate Professor of Biological Sciences, University of Texas, Dallas.

The delivery vehicle for the engineered plasmid is a particular strain of E. faecalis, which conjugates with E. faecalis of various different strains. Conjugation is the process whereby bacteria come together to transfer genetic material from one to the other via direct cell to cell contact.

"E. faecalis strains used to deliver these plasmids to drug resistant strains [of E. faecalis] are immune to acquiring drug resistant traits carried by the target cells," said Dr. Duerkop. "The engineered plasmid can significantly reduce the occurrence of antibiotic resistance in the target bacterial population rendering it more susceptible to antibiotics. We envision that this type of system could be used to re-sensitize antibiotic resistant E. faecalis to antibiotics," he said.

Nonetheless, Dr. Duerkop cautioned that it remained possible that E. faecalis could still circumvent the engineered plasmid. Some bacteria have anti-CRISPR systems that can block CRISPR-Cas9 function, and some others have systems that can degrade foreign DNA. "Future studies will need to be done to address such an issue as E. faecalis avoiding the targeting system and under what conditions this may happen," said Dr. Duerkop.


Cholera Disease

SXT Element

Conjugative plasmids and transposons, integrons, bacteriophages, and integrating conjugative elements, better known as bacterial mobile genetic elements (MGEs), are vehicles of acquisition of drug-resistance genes that facilitate transmission of resistance genes in bacteria. Vibrio cholerae O139 apart from novel O antigen carried a conjugative, self-transmissible chromosomally integrating SXT element (100 kb) which conferred resistance to sulfamethoxazole, trimethoprim, chloramphenicol, and streptomycin ( Waldor et al., 1996 ). Variations were noted in recent V. cholerae O139 isolates from India, which contain SXT, although showing varying resistance to streptomycin but sensitive to sulfamethoxazole, trimethoprim ( Mitra et al., 1996 Sinha et al., 2002 Yam et al., 1994 ). Subsequently SXT with or without drug-resistance genes has been detected among V. cholerae O1, O139, and non-O1, non-O139 isolated from India, Bangladesh, Mozambique, Mexico, Laos, Vietnam, South Africa, and China ( Amita et al., 2003 Burrus et al., 2006a , b Dalsgaard et al., 2001 Ehara et al., 2004 Hochhut et al., 2001 Iwanaga et al., 2004 Mohapatra et al., 2008 Mohapatra et al. 2010 Pan et al., 2008 Taviani et al., 2012 ). Interestingly factors promoting the spread of SXT among bacteria have not been clearly established. However, the SOS response has been shown to induce horizontal spread of SXT in a manner similar to the lytic life cycle of the bacteriophage λ ( Beaber et al., 2004 ). SXT elements show considerable variation with respect to drug-resistance genes suggesting genetic rearrangement in these elements. Vibrio cholerae isolated before the emergence of the O139 serogroup rarely possessed SXT, indicating that SXT may have not been an integral part of the V. cholerae Genom. Hence, the origin and acquisition of SXT by V. cholerae may provide insight into the evolution of SXT and acquisition of drug resistance.


Combating antibiotic resistance

Several possible alternatives have been suggested to not only decelerate resistance but to also to change it. A reduction in the number of prescription for antibiotics in small kids is occurring. The rate has been reduced by 23 % from 1995-2000 in children less than 3 yrs old with similar developments being mimicked in teenagers. Large scale general population health education work are now underway to stress the value of concluding prescriptions. Indeed in many places, failure to complete tuberculosis prescriptions can lead to jail time. In addition, several countries including the UK have rules regarding the use of antibiotics in creature feed.

Reversal of level of resistance by removal of antibiotics from use was an idea that was help with. Generally mutation in a bacterial gene to confer amount of resistance often results a lack of fitness resulting in slower growth. Therefore it was thought that removal of antibiotics would cause selection against these bacteria when rivalling with non-resistant, fit bacteria. Unfortunately, for the most part, this has been shown to be inadequate. Bacteria often acquire compensatory mutations that permit them to develop as fast as or even faster than crazy type, non-resistant bacteria. Subsequently, the selective good thing about the non-resistant bacterias and the selection against the level of resistance mutation is eliminated.

The breakthrough of antibiotics was a jump in modern remedies. The task on penicillin by Fleming, Chain and Florey was accompanied by many researchers and pharmaceutical companies in search of new antibiotics with different modes of actions. They have been able to avoid the growth or kill numerous kinds of microorganisms. However, the bacterias in particular have proven to be much more progressive and adaptive than scientists had dreamed. Bad methods and mismanagement have only exacerbated the problem. We're able to soon go back to circumstances of medical health that was as dire as whatever took place prior to antibiotic use. However, with an increase of research, education of the public, and well thought out government regulations, we will be well on our way to slowing down the resistance phenomenon.


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