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DNA-Replikation und Primer


Warum verlässt sich die Natur auf den RNA-Primer für den Start der DNA-Replikation? Warum nicht einfach DNA-Primer verwenden und das Leben einfacher machen!


Biochemisch hat keine der DNA-abhängigen DNA-Polymerasen, die an der DNA-Replikation beteiligt sind, die Fähigkeit, die Elongation ohne einen 5'-zu-3'-Primer zu beginnen.

Die einzige DNA-Polymerase, die die Verlängerung ohne einen 5'-zu-3'-Primer katalysieren kann, ist die Reverse Transkriptase, jedoch ist die Reverse Transkriptase eine RNA-abhängige DNA-Polymerase, und das erklärt den Unterschied.

Und wenn Ihre nächste Frage lautet, warum, dann lautet die Antwort, dass sich die Systeme so entwickelt haben. Außerdem haben DNA-Polymerasen aufgrund der Fehlerprüfung eine viel höhere Genauigkeit als RNA-Polymerasen, und da die RNA-Primer sowieso entfernt und durch DNA ersetzt werden, spielt ein Fehler hier oder da im Primer keine Rolle.

Der RNA-DNA-Duplex ist auch weniger stabil als der DNA-zu-DNA-Duplex, so dass es für FEN1 einfacher ist, einen RNA-Primer zu entfernen als einen DNA-Primer, vorausgesetzt, der Mechanismus der Primerentfernung und des Primerersatzes nach dem komplementären Leading und Lagging Stränge synthetisiert wurden, blieben an Ort und Stelle.


DNA-Replikation und Primer - Biologie

Die Bildung von Kohlenstoffkopien oder Replikaten von D.N.A aus elterlicher D.N.A wird als Replikation von D.N.A oder Duplikation von D.N.A bezeichnet. Die Replikation findet im Kern von Eukaryoten im S-Phagen des Zellzyklus und im Zytoplasma der prokaryotischen Zelle statt. Watson und Crick schlugen nicht nur das dreidimensionale Modell der DNA vor, sondern schlugen auch den Mechanismus der DNA-Replikation vor. Bei der Replikation entrollen sich beide DNA-Stränge und trennen sich. Jeder Strang fungiert als Matrizenstrang für die Bildung eines neuen und komplementären DNA-Strangs. Die Matrize und der neu synthetisierte Strang bilden einen neuen Doppelstrang, der mit dem Stamm-DNA-Molekül identisch ist.

Methoden der Replikation:

Del Bruck schlug drei theoretische Methoden zur Replikation des Watson- und Crick-Modells von D.N.A. Sie sind wie folgt :

1) Konservativer Replikationsmodus:-

Bei dieser Art der Replikation synthetisiert die doppelsträngige Eltern-DNS Replika oder neue DNS und bleibt dann so, wie sie ist, konserviert.

2) Dispersionsmodus der Replikation:-

Bei dieser Art der Replikation synthetisiert die elterliche DNA die DNA von zwei Töchtern, wonach sie (die elterliche DNA) zerfällt.

3) Halbkonservativer Replikationsmodus:-

Meselson und Stahl unter Verwendung der Stickstoffisotope N 14 und N 15 bestätigten, dass die Replikation von D.N.A inE coli Bakterium ist halbkonservativ.

Bei diesem Verfahren werden zwei Stränge durch Aufbrechen von Wasserstoffbrückenbindungen ihrer Stickstoffbasen getrennt. Beide DNA-Stränge fungieren als Master- oder Template-Strang, die neue oder komplementäre Stränge aus dem Medium synthetisieren. Als Ergebnis werden zwei neue DNA-Moleküle synthetisiert, bei denen ein Strang ursprünglich ist und ein anderer Strang und der andere Strang neu zusammengesetzt wird. Daher wird eine neu synthetisierte DNA auch als Hybrid-DNA bezeichnet.

Grundvoraussetzungen für die DNA-Replikation:

Der Mechanismus der DNA-Replikation ist komplex und umfasst viele Schritte. Für diesen Prozess werden mehrere Enzyme, Proteinfaktoren und Metallionen benötigt.

A) DNA-Helikase: Es ist ein Enzym, das das H . bricht2 bindet und trennt die DNA-Stränge. Somit wird an der als Replikationsgabel bezeichneten Verbindungsstelle eine Gabelung gebildet.

B)Single-Stranded Binding (SSB) Proteine:Dies sind die Proteinmoleküle, die sich fest an die exponierte einzelsträngige DNA anlagern, um die einzelsträngige DNA lange genug für die Replikation zu stabilisieren.

C) Primase:Es ist ein Enzym, das für die Synthese kurzer RNA-Primer verantwortlich ist. AnRNA-Primer ist ein kleiner RNA-Strang, der die Replikation steuert.

D)DNA-Polymerase:Es ist ein Enzym, das für die Katalyse der DNA-Synthese verantwortlich ist. Es kann der Template-DNA Nukleotide hinzufügen,

E) Topoisomerase:Es ist ein Enzym, das dafür verantwortlich ist, im DNA-Strang einen Nick (Schnitt) zu verursachen, um die Spannung zu lösen, die beim Abwickeln der DNA entsteht.

F)RNAse:Es ist ein Enzym, das die RNA-Primer verdaut, nachdem die DNA-Synthese beendet ist.

G)DNA-Ligase:Es ist ein Enzym, das die Lücken im synthetisierten DNA-Strang schließt.

H)Substrate:Die vier Desoxyribonukleosidtriphosphate (dNTPs) wie dATPs, dGTPs, dCTPS und dTTPS werden als Substrate für die DNA-Synthese benötigt. Die Spaltung der hochenergetischen Bindung zwischen Phosphaten liefert die Energie für die Addition des Nukleotids.

I) Folsäure:Es ist essentiell für die Synthese von Stickstoffbasen.

J)Mg 2+ und Mn 2+ Ionen:Diese sind essentiell für die DNA-Synthese.

Prozess der semikonservativen Replikation von DNA:

Der Mechanismus der DNA-Replikation ist komplex und umfasst viele Schritte. Die Schritte sind:

1) Initiierung der DNA-Replikation

2) Aktivierung von Desoxyribonukleotiden

3) Freilegen von DNA-Strängen oder Stickstoffbasen und Bildung von Y-förmigen Gabeln

6) Bildung neuer DNA-Stränge

7) Korrekturlesen und DNA-Reparatur

8) Beendigung der DNA-Helix-Bildung.

1)Initiierung der DNA-Replikation-

Der Punkt in der DNA, von dem aus die Replikation beginnt, wird als Initiationspunkt oder Replikationsursprung oder ori-Stelle bezeichnet. Es wird durch das Aufbrechen oder Einschneiden der Phosphodiesterbindung durch das Enzym Endonuklease ohne Entfernung von Nukleotiden gebildet.

In der prokaryontischen Zelle bildet die DNA einen einzigen Replikationsursprung und in der eukaryontischen Zelle hat die DNA viele Ori-Stellen.

2) Aktivierung von Desoxyribonukleotiden-

Vier Arten von inaktiven Desoxyribonukleosidmonophosphaten der DNA, dh deAMP, deGMP, deCMP und deTMP, werden im Nukleoplasma gefunden, reagieren mit ATP-Molekülen in Gegenwart der Enzyme Phosphorylase, um vier Arten von Desoxyribonukleotidtriphosphaten der DNA zu bilden, dh deATP, deGTP, deCTP und deTTP. Dieser Vorgang wird als Phosphorylierung bezeichnet. [ip=anorganisches Phosphat]

Abb: Aktivierung von Desoxyribonukleotiden

3) Exposition von DNA-Strängen und Bildung von Replikationsgabeln-

Enzymhelikase bricht die Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den Stickstoffbasen von zwei DNA-Stämmen an der ori-Stelle. Dadurch werden die beiden DNA-Stränge voneinander getrennt und befinden sich in einem Zustand der Supercoiling-Spannung. Um diese Spannung zu lösen, spielt das Enzym Topo-Isomerase-I oder DNA-Gyrase eine entscheidende Rolle. Die getrennten Stränge werden in der Y-förmigen Struktur etabliert, die als Replikationsgabel bezeichnet wird und von einem einzelsträngigen Bindungsprotein (SSB) gehalten wird.

4) Bildung von RNA-Primer-

Die DNA-Replikation findet immer in 5' nach 3'-Richtung an den Master- oder Template-Strängen statt. Um die DNA-Synthese zu initiieren, ist eine kurze Sequenz von RNA-Primern erforderlich. RNA-Primer wird von einem Enzym DNA-Polymerase synthetisiert, das Primase genannt wird. RNA-Primer wird am freien Ende eines DNA-Strangs (3'-Ende) und ein anderer am Gabelende eines anderen DNA-Masterstrangs gebildet.

5) Basenpaarung-

Die getrennten DNA-Stränge werden als Matrizen bezeichnet. Die im Nukleoplasma vorhandenen aktiven Desoxyribonukleotide liegen den spezifischen Stickstoffbasen beider DNA-Strange gegenüber und binden sich gemäß der Basenpaarungsregel, d. Mit Hilfe des Enzyms Pyrophosphatase werden zwei zusätzliche Phosphate, die im Desoxyribonukleotidtriphosphat vorhanden sind, getrennt und Energie freigesetzt. Diese Energie wird bei der Bildung von Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den freien Nukleotiden des Nukleoplasmas und den Nukleotiden der Masterstränge verwendet.

Desoxyribonukleotidtriphosphat (in Gegenwart von Pyrophosphatase-Enzym) &rarr Desoxyribonukleosidmonophosphat +2ip

deATP (in Gegenwart von Pyrophosphatase-Enzym)&rarr deAMP + 2ip + Energie

6) Bildung neuer DNA-Stränge-

DNA-Polymerase-Enzym, das energiereiche Molekül ATP zusammen mit Mangan- und Magnesiumionen sind für die Bildung neuer DNA-Stränge verantwortlich. Ein neuer DNA-Strang wird kontinuierlich in 5' bis 3'-Richtung am 3' bis 5'-Masterstrang synthetisiert, der als Leitstrang bezeichnet wird.

Andererseits werden auch diskontinuierliche DNA-Fragmente in 5'-3'-Richtung des anderen Masterstrangs gebildet, der als nacheilender Strang bezeichnet wird. Die diskontinuierlichen Fragmente, die von jedem RNA-Primer gebildet werden, werden Okazaki-Fragmente genannt.

7) Korrekturlesen und DNA-Reparatur-

Während der Replikation ist die Genauigkeit der Basenpaarung wesentlich. Manchmal gelangen falsche Basen in den neuen Strang. Die Häufigkeit dieser Einführung einer Basis liegt bei 100.000. Diese werden durch die Exonukleus-Aktivität des DNA-Polymerase-I-Enzyms (Korrekturleser) festgestellt und entfernt. Die neu gebildete DNA-Struktur wird durch das DNA-Ligase-Enzym repariert.

8) Beendigung der DNA-Helix-Bildung-

Im Allgemeinen stoppt die DNA-Replikation, wenn sich zwei replizierende Gabeln treffen. Aber in Prokaryoten verhindert ein terminierendes Protein namens "Tus" die Bewegung der Helikase und zeigt den Abschluss des Replikationsprozesses an.

Somit ist die DNA-Replikation ein halbkonservativer Prozess, da sich die Eltern-DNA repliziert und zwei Tochter-DNAs bildet, von denen ein Strang elterlich ist und ein anderer neu gebildet wird.

Quelle: www.rothamsted.ac.uk Abb: Semikonservativer Modus der DNA-Replikation.

Keshari, Arvind K. und Kamal K. Adhikari. Ein Lehrbuch der höheren Sekundarstufe Biologie (Klasse XII). 1. Kathmandu: Vidyarthi Pustak Bhandar, 2015.

Mehta, Krishna Ram. Prinzip der Biologie. 2. Auflage. Kathmandu: Asmita, 2068,2069.


RNA-Primer:

Zunächst ist der RNA-Primer für die PCR-Amplifikation nicht signifikant. Es ist jedoch für den Replikationsprozess erforderlich.

Der RNA-Primer ist ein kurzer Nukleinsäureabschnitt, der aus dem einzelsträngigen RNA-Molekül besteht.

Eine RNA-Polymerase, DNA-Primase genannt, synthetisiert einen kurzen Abschnitt eines einzelsträngigen RNA-Moleküls, um die Replikation zu starten.

Es ist ganz wesentlich, dass eine DNA-Polymerase ihre katalytische Aktivität beginnt.

Der einzelsträngige RNA-Primer bietet eine freie 3’-OH-Gruppe, die für die DNA-Polymerase benötigt wird. Siehe das Bild,

Die RNA-Primer sind von zwei Typen, die bei der Replikation verwendet werden. Einer, der DNA-Replikationen startet und am führenden Strang ungefähr 10 bis 18 Nukleotide lang ist.

Während andere für die Synthese von Okazaki-Fragmenten verwendet werden und diese 8 bis 10 Nukleotide lang sind, am nacheilenden Strang.

Warum ist die Replikation von einem RNA-Primer anstelle eines DNA-Primers abhängig?

Die einzige RNA-Polymerase ist verfügbar, um die ssRNA zu synthetisieren, daher wird nicht DNA, sondern die RNA bei der Replikation verwendet.

Und am Ende werden aufgrund der Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase die RNA-Primer entfernt, gleichzeitig wird die Lücke von der Polymerase mit den komplementären Nukleotiden gefüllt und mit DNA-Ligase verschlossen.

Dazu verfolgt die DNA-Polymerase den RNA-Primer, der eigentlich nicht Teil unseres DNA-Strangs ist.

(DNA-Ligase füllt die Lücke zwischen benachbarten Nukleotiden, indem sie die Phosphodiesterbindung bildet.)

Die 3’ bis 5’-Exonuklease-Aktivität der DNA-Polymerase entfernt sie.

Notiz: nur ein einziger RNA-Primertyp wird für die DNA-Replikation verwendet.

Interessante Tatsache:

Die DNA-Polymerase kann den Polynukleotidstrang verlängern, aber nicht direkt synthetisieren (sie benötigt ein freies 3’-Ende).

Nur die RNA-Polymerase kann dies tun, daher wird der RNA-Primer bei der Replikation verwendet.

Es gibt einen Unterschied zwischen der Synthese und Verlängerung von Nukleotidketten, siehe das Bild unten,


Initiierung der DNA-Replikation: Vorbereitender Schritt

Schritt 1: Bildung von Replikationsgabeln.

Bevor DNA repliziert werden kann, muss das doppelsträngige Molekül in zwei Einzelstränge „entpackt“ werden. Wie wir wissen, hat DNA vier Basen namens Adenin (A), Thymin (T), Cytosin (C) und Guanin (G), die Paare zwischen den beiden Strängen bilden. Adenin paart sich nur mit Thymin und Cytosin bindet nur an Guanin.

Um DNA aufzuwickeln, müssen diese Basenpaar-Wechselwirkungen aufgebrochen werden. Dies geschieht durch ein Enzym, das als DNA-Helikase bekannt ist.

Es gibt jedoch ein spezielles Initiatorprotein, das benötigt wird, um die DNA-Replikation auszulösen, nämlich DnaA. Es bindet Regionen an der oriC-Stelle während des gesamten Zellzyklus. Um die Replikation zu initiieren, muss das DnaA-Protein jedoch an einige wenige spezifische oriC-Sequenzen binden, die fünf Wiederholungen der 9 bp-Sequenz aufweisen (auch als R-Stelle bekannt).

Wenn DnaA an die oriC-Stelle bindet, rekrutiert es ein Helikase-Enzym (DnaB-Helikase). Jetzt bricht die DNA-Helikase die Wasserstoffbrücke, die komplementäre DNA-Basen zusammenhält.

Die Trennung der beiden DNA-Einzelstränge erzeugt eine zwei Y-förmige Struktur, die als Replikationsgabel bezeichnet wird. zusammen bilden sie eine blasenartige Struktur, die als Replikationsblase bezeichnet wird. Diese beiden getrennten Stränge dienen als Matrize für die Produktion der neuen DNA-Stränge.

Wie funktioniert die Replikation eigentlich auf den Replikationsgabeln?

Helicase ist das erste Replikationsenzym, das am Replikationsursprung geladen wird. Die Aufgabe von Helicase besteht darin, die Replikationsgabeln einfach vorwärts zu bewegen, indem die DNA „abgewickelt“ wird. Wie wir wissen, ist DNA in Form eines Einzelstrangs sehr instabil. Auf diese Weise können Zellen verhindern, dass sie wieder in einer Doppelhelix zusammenkommen.

Um dies zu tun, umhüllt ein spezifisches Protein, das als einzelsträngige DNA-Bindungsproteine ​​(SSBs) bezeichnet wird, die getrennten DNA-Stränge und hält sie in der Nähe der Replikationsgabel.

Wenn die Helikase schnell die Doppelhelix abwickelt. Es erhöht die Spannung auf das verbleibende DNA-Molekül. Topoisomerase spielt eine wichtige Erhaltungsrolle während der DNA-Replikation. Dieses Enzym verhindert, dass die DNA-Doppelhelix vor der Replikationsgabel beim Öffnen der DNA zu eng wird. Dies geschieht durch temporäre Kerben in der Helix, um Spannungen zu lösen, und dann die Kerben zu versiegeln, um dauerhafte Schäden zu verhindern.


POLRMT reguliert den Wechsel zwischen der Bildung von Replikationsprimern und der Genexpression der mtDNA von Säugetieren

Mitochondrien sind entscheidend für die Bereitstellung von zellulärer Energie über ihr oxidatives Phosphorylierungssystem, das die koordinierte Expression von Genen erfordert, die sowohl vom nuklearen als auch vom mitochondrialen Genom (mtDNA) kodiert werden. Die Transkription der zirkulären Säuger-mtDNA hängt von einer einzelnen mitochondrialen RNA-Polymerase (POLRMT) ab. Obwohl der Transkriptionsinitiationsprozess gut verstanden ist, wird diskutiert, ob POLRMT auch als Primase für die Initiation der mtDNA-Replikation dient. Im Zellkern spielen die für die Genexpression benötigten RNA-Polymerasen keine solche Rolle. Bedingter Knockout von Polrmt im Herzen führt zu einer schweren mitochondrialen Dysfunktion, die bei jungen Mäusen eine dilatative Kardiomyopathie verursacht. Wir untersuchten weiter die molekularen Konsequenzen verschiedener Expressionsniveaus von POLRMT und fanden heraus, dass POLRMT für die Primersynthese essentiell ist, um die mtDNA-Replikation in vivo zu initiieren. Darüber hinaus hat die Transkriptionsinitiation für die Primerbildung Priorität gegenüber der Genexpression. Überraschenderweise existiert der mitochondriale Transkriptionsfaktor A (TFAM) in einem mtDNA-freien Pool in den Polrmt-Knockout-Mäusen. Die TFAM-Spiegel bleiben trotz starker mtDNA-Depletion unverändert, und TFAM ist somit in Abwesenheit von POLRMT vor dem Abbau der AAA(+)-Lon-Protease geschützt. Schließlich berichten wir, dass der mitochondriale Transkriptionselongationsfaktor eine partielle Depletion von POLRMT in heterozygoten Polrmt-Knockout-Mäusen kompensieren kann, was auf eine direkte regulatorische Rolle dieses Faktors bei der Transkription hinweist. Zusammenfassend präsentieren wir in-vivo-Beweise, dass POLRMT eine wichtige regulatorische Rolle bei der Replikation von Säugetier-mtDNA spielt und Teil eines Transkriptionsmechanismus ist, der einen Wechsel zwischen der Primerbildung für die mtDNA-Replikation und der mitochondrialen Genexpression ermöglicht.

Schlüsselwörter: 7S-RNA-Mitochondrien POLRMT-Knockout-Maus-Light-Strang-Promotor mitochondriale RNA-Polymerase mitochondriale Genexpression mtDNA mtDNA-Replikation mtDNA-freier TFAM-Pool-Twinkle.

Figuren

Abb. 1. Knockout von Polrmt in der Keimbahn…

Abb. 1. Knockout von Polrmt in Keimbahn und Herz.

( EIN ) RT-PCR-Analyse von…

Abb. 2. Reduzierte OXPHOS-Kapazität in Polm…

Abb. 2. Reduzierte OXPHOS-Kapazität in Polrmt KO-Mausherz.

( EIN ) Transmissionselektron…

Abb. 3. Verminderte mtDNA-Replikation in Polm…

Abb. 3. Verminderte mtDNA-Replikation in Polrmt Knockout-Mäuse.

Abb. 4. Der Verlust von POLRMT führt zu…

Abb. 4. Der Verlust von POLRMT führt zu einem erhöhten mtDNA-freien Pool von TFAM.

Abb. 5. LSP und HSP zeigen unterschiedliche…

Abb. 5. LSP und HSP zeigen bei niedrigen POLRMT-Konzentrationen unterschiedliche Sensitivitäten.

Abb. 6. Charakterisierung von heterozygoten Polrmt schlagen…

Abb. 6. Charakterisierung von heterozygoten Polrmt Knockout-Mäuse.

( EIN ) POLRMT Steady-State-Proteinspiegel…

Abb. 7. Modell von POLRMT, das die Replikation reguliert…

Abb. 7. Modell von POLRMT, das die Bildung von Replikationsprimern und die Expression von mtDNA reguliert.


Primas

Abstrakt

Primase ist das Enzym, das RNA-Primer synthetisiert, Oligonukleotide, die komplementär an ein Nukleinsäurepolymer gebunden sind. Primase ist erforderlich, da DNA-Polymerasen die Polymersynthese auf einzelsträngigen DNA-Matrizen nicht initiieren können, sondern nur vom 3'-Hydroxyl eines Primers verlängert werden können. Primasen lassen sich in zwei Hauptsequenz- und Strukturfamilien einteilen: bakterielle und archaeale/eukaryontische Kerne. Bakterielle Primasen sind Monomere, die aus drei Domänen bestehen. Die N-terminale Domäne hat ein Zinkfingermotiv und ist wahrscheinlich für die Initiationsspezifität dieses Enzyms verantwortlich. Die zentrale katalytische Domäne bindet einzelsträngige DNA und katalysiert die dazu komplementäre RNA-Polymer-Initiation und -Elongation. Die C-terminale Domäne interagiert mit anderen Proteinen, einschließlich der DnaB-Helikase, so dass ihre Aktivität an der Replikationsgabel stattfindet. Das bakterielle Primase-Gen, dnaG, ist das zentrale Gen des makromolekularen Syntheseoperons, das die Gene für die Initiationsphasen der Translation, Replikation und Transkription trägt. Von den drei Genen dnaG unter den meisten Kontrollen und wird in der niedrigsten Menge ausgedrückt. Archaeale/eukaryotische Primase befindet sich in einem Heterotetramer, das aus einer kleinen Primase-Untereinheit, einer großen Primase-Untereinheit, einem regulatorischen Phosphoprotein und DNA-Polymerase alpha besteht. Die kleine Untereinheit hat eine Primer-Synthese-Aktivität, die durch die anderen drei Proteine ​​im Komplex sowie durch das Replikationsprotein A, ein einzelsträngiges DNA-bindendes Protein, das für die DNA-Synthese des verzögerten Strangs erforderlich ist, und den GINS-Komplex, den zentralen Knotenpunkt, moduliert wird die sich die DNA-Replikasen des führenden und des nachlaufenden Strangs zusammensetzen, um das Fortschreiten der Replikationsgabel zu kontrollieren. GINS interagiert mit der MCM-Helikase, die auf der Leitstrang-Matrize transloziert und auch mit dem DNA-Polymerase-Alpha/Primase-Komplex auf dem nacheilenden Strang interagiert.


DNA-Replikation: Einführung

DNA Replikation ist der Prozess der Herstellung zweier identischer Replikate aus einem ursprünglichen DNA-Molekül. Dieser biologische Prozess findet in allen lebenden Organismen statt und ist die Grundlage für die biologische Vererbung. DNA besteht aus zwei Strängen und jeder Strang des ursprünglichen DNA-Moleküls dient als Vorlage für die Herstellung des komplementären Strangs, ein Prozess, der als bezeichnet wird halbkonservativ Reproduzieren. Zelluläre Korrekturlese- und Fehlerüberprüfungsmechanismen sorgen für eine nahezu perfekte Wiedergabetreue der DNA-Replikation.

Für die DNA-Synthese werden zwei Schlüsselsubstrate benötigt.

Substrat: Als Substrate für die DNA-Synthese werden die vier Desoxynukleosidtriphosphate (dNTPs) – Desoxyadenosintriphosphat (dATP), Desoxyguanosintriphosphat (dGTP), Desoxycytidintriphosphat (dCTP) und Desoxythymidintriphosphat (dTTP) benötigt.

Primer: Schablonenverbindung: Zweites Substrat für die DNA-Synthese ist eine besondere Anordnung von ssDNA und dsDNA, die Primer:Template-Verbindung genannt wird.

  • Vorlage. Ohne Matrize kann die DNA-Replikation nicht stattfinden. Eine Matrize ist erforderlich, um die Addition des geeigneten komplementären Desoxynukleotids an den neu synthetisierten DNA-Strang zu steuern. Bei der semikonservativen Replikation dient jeder Strang der elterlichen DNA als Matrize. Dann dienen jeder Matrizenstrang und sein neu synthetisierter komplementärer Strang als DNA in Tochterzellen.
  • Grundierung. Ohne einen Primer, der den Matrizenstrang für die Anlagerung von Nukleotiden vorbereitet, kann die DNA-Synthese nicht starten. Der Primer muss auch ein exponiertes 3’OH aufweisen, da neue Nukleotide an das 3′-Ende eines Primers hinzugefügt werden, der ordnungsgemäß mit dem DNA-Matrizenstrang gepaart ist. 8242 Richtung.

Die DNA-Synthese, die während des Replikationsprozesses stattfindet, wird durch Enzyme katalysiert, die als DNA-abhängige DNA-Polymerasen bezeichnet werden. Diese Enzyme sind insofern von DNA abhängig, als sie eine DNA-Matrize benötigen. Sie werden häufiger als DNA-Polymerasen bezeichnet.


DNA-Replikation und Primer - Biologie

Die DNA-Replikation ist ein semi-konservativer Prozess, der während der S-Phase der Interphase stattfindet. Es ist der Prozess, bei dem die DNA eines Organismus repliziert wird, um zwei identische Kopien zu erzeugen.

Es beginnt am Ursprung der Replikation. Prokaryoten haben einen Replikationsstartpunkt, während Eukaryoten mehrere haben. An jedem Replikationsstartpunkt gibt es eine Replikationsblase, die zwei Replikationsgabeln enthält. An jeder Replikationsgabel befindet sich das Enzym DNA-Helikase, das die Doppelhelix-Struktur der DNA entwickelt. Dies geschieht durch Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen stickstoffhaltigen Basen, wodurch die beiden DNA-Stränge getrennt werden. Einzelstrang-Bindungsproteine ​​verhindern, dass sich getrennte Stränge an der Replikationsgabel wieder anlagern. Die beiden getrennten DNA-Stränge werden jetzt als Template-Stränge bezeichnet.

DNA-Polymerase III ist das Enzym, das verwendet wird, um einen komplementären DNA-Strang unter Verwendung eines Matrizenstrangs aufzubauen. Es tut dies, indem es Nukleosidtriphosphate an das 3'-Ende eines Nukleotids anfügt. DNA-Polymerase III stellt auch sicher, dass die angehängten Nukleotide komplementäre Basen zum Matrizenstrang aufweisen. DNA-Polymerase III kann jedoch dem Matrizenstrang keine Nukleotide hinzufügen. Die RNA-Primase erzeugt also RNA-Primer: kurze RNA-Sequenzen, die komplementär zum DNA-Matrizenstrang sind. Die DNA-Polymerase III verfügt dann über verfügbare 3'-Enden, an die Nukleotide angefügt werden können. DNA-Polymerase III kann dies jedoch nur in 5’-3’-Richtung tun.

DNA ist antiparallel, dh jeder Strang verläuft in die entgegengesetzte Richtung (wie in der Abbildung unten zu sehen).

Aus diesem Grund liegen die beiden Matrizenstränge auch in unterschiedliche Richtungen. Im obigen Diagramm wäre der rechte Strang der führende Strang. Dies bedeutet, dass die DNA-Polymerase, nachdem ein RNA-Primer am 3’-Ende dieses Strangs platziert wurde, ihren komplementären Strang kontinuierlich in 5’ bis 3’-Richtung aufbauen kann.

Der Strang rechts im Diagramm ist der nacheilende Strang. Der nachlaufende Strang scheint in einer 3' bis 5'-Richtung zu wachsen, aber dies ist nicht der Fall. Der nacheilende Strang ist in Segmente unterteilt, die als Okazaki-Fragmente bezeichnet werden und von der DNA-Polymerase III einzeln in 5' bis 3'-Richtung gebaut werden. Jedes Fragment beginnt mit einem RNA-Primer. Während die Helikase die DNA-Doppelhelix entpackt, werden immer mehr Primer hinzugefügt.

Auch andere Enzyme sind an der DNA-Replikation beteiligt. DNA-Polymerase I entfernt RNA-Primer und ersetzt sie durch DNA-Nukleotide. DNA-Ligase bildet Phosphodiester-Bindungen zwischen den DNA-Nukleotiden, die die DNA-Polymerase I hinzufügt, und den Enden von Okazaki-Fragmenten. Schließlich lesen Enzyme die DNA-Stränge Korrektur, um sie auf Fehler zu überprüfen und Mutationen zu verhindern.

7.1.1 Nukleosomen helfen beim Supercoiling der DNA.

Nukleosomen helfen auch, die Genexpression zu regulieren. Ein Teil der DNA ist im Nukleosom um die Histone gewickelt und ist für die RNA-Polymerase nicht zugänglich, sodass sie nicht transkribiert werden kann

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7.1.2 DNA-Struktur legt einen Mechanismus für die DNA-Replikation nahe.

DNA ist doppelsträngig und die beiden Stränge sind durch komplementäre Basenpaarung miteinander verbunden. Daher liegt es nahe, dass sich die beiden Stränge während der Replikation trennen und dann durch komplementäre Basenpaarung Nukleotide die getrennten Stränge verbinden. Und dies würde 2 neue, identische DNA-Stränge ergeben.

7.1.3 DNA-Polymerasen können Nukleotide nur an das 3’-Ende eines Primers anhängen.

DNA-Polymerase kann dem Phosphat am 5'-Ende der DNA keine Bindungen hinzufügen, daher schafft sie Bindungen am 3'-Ende.

7.1.4 Die DNA-Replikation ist auf dem führenden Strang kontinuierlich und auf dem nacheilenden Strang diskontinuierlich.

Die DNA-Replikation findet auf beiden Strängen der DNA statt, ein Strang wird als führender Strang und der andere als nachlaufender Strang bezeichnet. Der führende Strang ist derjenige, der sich auf die gleiche Weise wie die Helikase in 3' bis 5'-Richtung bewegt.

7.1.5 Die DNA-Replikation erfolgt durch ein komplexes System von Enzymen.

DNA-Polymerase III - Katalysiert die Reaktion, die frei schwebende Nukleotide bindet, um einen neuen DNA-Strang zu bilden

Helicase - Trennt die ursprünglichen DNA-Stränge

Gyrase/Topoisomerase - Hilft beim Entwickeln der DNA-Helix

DNA-Primase - Bietet eine Stelle namens Primase für die DNA-Polymerase III, um mit dem Hinzufügen von Nukleotiden zu beginnen.

DNA Polymerase I - Ersetzt den RNA-Primer durch DNA

Einzelstrang-bindende Proteine ​​- Verhindert, dass die DNA erneut anlagert

Ligase - Fügt die Okazaki-Fragmente zusammen

7.1.6 Einige DNA-Regionen kodieren nicht für Proteine, haben aber andere wichtige Funktionen.

DNA, die nicht für ein Protein kodiert, wird als nicht-kodierende Sequenz bezeichnet. Einige nicht-kodierende Sequenzen haben wichtige Funktionen wie die Regulierung der Genexpression durch Förderung und Unterdrückung der Transkription von Genen neben dem.

Darüber hinaus werden viele DNA-kodierende Sequenzen durch nicht-kodierende Sequenzen, die Introns genannt werden, unterbrochen. Die Introns werden vor der Translation entfernt, sind aber für die mRNA-Verarbeitung wichtig

An den Enden der Chromosomen befinden sich nicht-kodierende Sequenzen, die als Telomere bezeichnet werden. Während der DNA-Replikation kann das Ende des Moleküls nicht repliziert werden, so dass Telomere Teile der DNA davor schützen, während der Replikation verloren zu gehen

Schließlich kodieren einige nicht-kodierende Sequenzen für tRNA-Moleküle anstelle eines Proteins.


7.1.7 Rosalind Franklins und Maurice Wilkins’ Untersuchung der DNA-Struktur durch Röntgenbeugung.

1950 entwickelte Marice Wilkins ein Verfahren zur Herstellung einer Methode zur Abbildung von DNA-Molekülen durch Röntgenbeugung. Rosalind Franklin arbeitete im selben Labor wie Wilkins und entwickelte einen hochauflösenden Detektor, der sehr klare DNA-Bilder aufnahm. Ihre Erkenntnisse waren entscheidend für die Entdeckung der Doppelhelix durch Crick und Watson

7.1.8 Verwendung von Didesoxyribonukleinsäure enthaltenden Nukleotiden zum Stoppen der DNA-Replikation bei der Vorbereitung von Proben für die Basensequenzierung.

DNA-Sequenzierung ist ein Verfahren, mit dem die Reihenfolge der Nukleotide in der DNA gefunden werden kann. Einer der vorbereitenden Schritte für die DNA-Sequenzierung ist das Fragmentieren der DNA in Stücke. Dazu wird ddNA (Didesoxyribonukleinsäure) zugegeben, die am 3'-Ende des Ribose-Zuckers kein OH-Molekül aufweist, dh wenn die DNA-Polymerase die ddNA erreicht, kann sie nicht weiter replizieren.

Gelelektrophorese ist der Prozess, bei dem die Sequenz der DNA gefunden wird. Die fragmentierte DNA wird in ein Gel gegeben und von elektrischem Strom durchflossen. DNA ist ein polares Molekül und wird durch den elektrischen Strom beeinflusst und bewegt sich das Gel hinunter. Leichtere/kleinere Fragmente der DNA bewegen sich weiter, während schwerere/längere Fragmente sich sehr wenig bewegen. Das Ergebnis ist ein Bandenmuster, mit dem man die Sequenz der DNA herausfinden kann. Denken Sie jedoch daran, dass die Sequenz des ursprünglichen Strangs komplementär zu der Sequenz ist, die durch die Bandenmuster gezeigt wird, da die DNA repliziert wurde.


7.1.9 Tandem-Wiederholungen werden beim DNA-Profiling verwendet.

Eine Tandemwiederholung mit variabler Anzahl (VNTR) ist eine kurze Sequenz von Nukleotiden, die verwendet werden kann, um ein Profil einer Person basierend darauf zu erstellen, wie oft die Sequenz wiederholt wird. Der VNTR wird bei verschiedenen Personen am selben Locus (Ort auf dem Chromosom) gefunden, was es relativ einfach macht, ihn zu finden. DNA-Profiling kann unter anderem verwendet werden, um Kriminalfälle zu lösen und elterliche Streitigkeiten zu lösen


7.1.10 Analyse der Ergebnisse des Hershey- und Chase-Experiments, die belegen, dass DNA das genetische Material ist.

Hershey und Chase führten ein Experiment durch, um herauszufinden, ob Proteine ​​oder DNA das genetische Material der Zelle sind. Dazu infizierten sie ein E.coli-Bakterium mit dem T2-Phage-Virus. Viren bestehen nur aus DNA innerhalb einer Proteinhülle, daher gab es keine anderen Variablen in der Mischung.

DNA enthält Phosphor, aber keinen Schwefel, und Proteine ​​können Schwefel, aber keinen Phosphor enthalten. Diese Unterscheidung wurde im Experiment mit Isotopen (verschiedene Formen) von Schwefel und Phosphor verwendet. Sie stellten zwei Stämme der T2-Phagenbakterien her, einen mit einem schwereren Phosphorisotop in der DNA und einen mit einem schwereren Schwefelisotop in den Proteinen. Sie taten dies, indem sie den T2-Phagen in eine Lösung mit allem Notwendigen zur Replikation und nur der schwereren Version des Schwefels oder der schwereren Version des Phosphors steckten. Nachdem sich der T2-Phage ein paar Mal repliziert hatte, bestand er hauptsächlich aus dem schwereren Isotop

Hershey und Chase veranlassten das T2-Phagenvirus, sein genetisches Material in die E. Coli-Bakterien zu injizieren. Und dann steckten sie dieses E. Coli in ein Reagenzglas und steckten dieses Reagenzglas in eine Zentrifuge, um es sehr schnell im Kreis zu drehen. Aufgrund der schnellen, kreisenden Bewegung wanderten die schwereren Teile des E. Coli an den Boden des Reagenzglases, während die leichteren Isotope oben waren.

Als der Schwefelstamm sein genetisches Material injizierte, war der Prozentsatz schwerer Isotope gegenüber leichten Isotopen vernachlässigbar. Als jedoch der Phosphorstamm des Virus sein genetisches Material in die Bakterien injizierte, waren 65 % der DNA in E. Coli laut den Zentrifugenergebnissen von dem schweren Isotop.


Schritt 2: Primerbindung

Der führende Strang ist am einfachsten zu replizieren. Sobald die DNA-Stränge getrennt wurden, bindet ein kurzes Stück RNA, ein sogenannter Primer, an das 3'-Ende des Strangs. Der Primer bindet immer als Startpunkt für die Replikation. Primer werden durch das Enzym DNA-Primase erzeugt.

Enzyme, die als DNA-Polymerasen bekannt sind, sind dafür verantwortlich, den neuen Strang durch einen Prozess namens Elongation zu erzeugen. Es gibt fünf verschiedene bekannte Typen von DNA-Polymerasen in Bakterien und menschlichen Zellen. In Bakterien wie E. coli ist Polymerase III das wichtigste Replikationsenzym, während Polymerase I, II, IV und V für die Fehlerprüfung und Reparatur verantwortlich sind. DNA-Polymerase III bindet an den Strang an der Stelle des Primers und beginnt, während der Replikation neue Basenpaare hinzuzufügen, die zum Strang komplementär sind. In eukaryotischen Zellen sind die Polymerasen Alpha, Delta und Epsilon die primären Polymerasen, die an der DNA-Replikation beteiligt sind. Da die Replikation am führenden Strang in 5'- nach 3'-Richtung verläuft, ist der neu gebildete Strang kontinuierlich. Der nachlaufende Strang beginnt mit der Replikation, indem er an mehrere Primer bindet. Jeder Primer ist nur einige Basen voneinander entfernt. DNA-Polymerase fügt dann DNA-Stücke, sogenannte Okazaki-Fragmente, zu dem Strang zwischen den Primern hinzu. Dieser Replikationsprozess ist diskontinuierlich, da die neu erstellten Fragmente unzusammenhängend sind.

Sobald sowohl der kontinuierliche als auch der diskontinuierliche Strang gebildet sind, entfernt ein Enzym namens Exonuklease alle RNA-Primer von den ursprünglichen Strängen. Diese Primer werden dann durch geeignete Basen ersetzt. Eine andere Exonuklease „korrigiert“ die neu gebildete DNA, um Fehler zu überprüfen, zu entfernen und zu ersetzen. Ein weiteres Enzym namens DNA-Ligase verbindet Okazaki-Fragmente zu einem einzigen einheitlichen Strang. Die Enden der linearen DNA stellen ein Problem dar, da die DNA-Polymerase Nukleotide nur in der 5'- bis 3'-Richtung hinzufügen kann. Die Enden der Elternstränge bestehen aus wiederholten DNA-Sequenzen, die als Telomere bezeichnet werden. Telomere fungieren als Schutzkappen am Ende der Chromosomen, um die Verschmelzung benachbarter Chromosomen zu verhindern. Eine spezielle Art von DNA-Polymerase-Enzym namens Telomerase katalysiert die Synthese von Telomersequenzen an den Enden der DNA. Nach der Fertigstellung winden sich der Elternstrang und sein komplementärer DNA-Strang in die bekannte Doppelhelixform. In the end, replication produces two DNA molecules , each with one strand from the parent molecule and one new strand.


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