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Serologische Assays, die keine nativen Proteine ​​erkennen


Gibt es jemanden da draußen, der viel mit serologischen Assays gearbeitet hat? Wir haben Antiserum für ein hergestelltes virales Protein, aber bisher kein Glück, natives Protein zu erkennen (es sei denn, der heutige Versuch hat funktioniert, was wir morgen herausfinden werden).

Was sind allgemeine Probleme oder mögliche Überlegungen, die wir beim Testen berücksichtigen sollten?


SARS-CoV-2 S1- und N-basierte serologische Assays zeigen eine schnelle Serokonversion und Induktion einer spezifischen Antikörperantwort bei COVID-19-Patienten

Da sich die Coronavirus-Krankheit 2019 (COVID-19), die durch das neuartige SARS-CoV-2 verursacht wird, weiterhin rasant weltweit ausbreitet, besteht ein Bedarf an gut validierten serologischen Assays, die den Nachweis viraler spezifischer Antikörperreaktionen ermöglichen COVID-19-Patienten oder genesene Personen. In dieser Studie haben wir mehrere indirekte serologische Assays auf der Grundlage des Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) etabliert und verwendet, um die Antikörperreaktion bei COVID-19-Patienten zu untersuchen. Um die Assays zu validieren, haben wir die Cut-off-Werte, Sensitivität und Spezifität der Assays mit Seren von gesunden Kontrollen vor der Pandemie, COVID-19-Patienten zu verschiedenen Zeitpunkten nach Krankheitsbeginn und seropositiven Seren für andere humane Coronaviren bestimmt ( CoV). Die entwickelte SARS-CoV-2 S1-Untereinheit der Spike-Glykoprotein- und Nukleokapsid (N)-basierten ELISAs zeigte nicht nur eine hohe Spezifität und Sensitivität, sondern zeigte auch keine Kreuzreaktivität mit anderen CoVs. Wir zeigen auch, dass alle RT-PCR-bestätigten COVID-19-Patienten, die in unserer Studie getestet wurden, bereits in der ersten Woche nach Krankheitsbeginn sowohl virusspezifische IgM- als auch IgG-Antikörper entwickelten. Unsere Daten deuten auch darauf hin, dass die Einbeziehung von S1 und N in serologische Tests so viele potenzielle SARS-CoV-2-positive Fälle wie möglich erfassen würde, als wenn nur einer von ihnen verwendet würde. Dies ist besonders wichtig, um Kontakte und Fälle aufzuspüren und groß angelegte epidemiologische Studien durchzuführen, um das wahre Ausmaß der Virusausbreitung in der Bevölkerung zu verstehen.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren erklären keine konkurrierenden Interessen.

Figuren

SARS-CoV-2 rekombinante Proteine ​​und Cut-off…

SARS-CoV-2 rekombinante Proteine ​​und Cut-off-Werte für die entwickelten ELISAs. Rekombinantes SARS-CoV-2 (…

46 kDa für S1 bzw. N). 100 Serumproben von gesunden Kontrollen, die vor der COVID-19-Pandemie gesammelt wurden, wurden verwendet, um die Cut-off-Werte für (C) S1-IgG-ELISA, (D) rS1-IgM-ELISA, (e) N IgG-ELISA und (F) N-IgM-ELISA. Die Werte wurden als Mittelwert + 3SD berechnet. Das Quadrat ist eine serologisch positive Probe eines COVID-19-Patienten. Die gestrichelten Linien stellen den Cut-off jedes Assays dar.

Die Besonderheit der entwickelten…

Die Spezifität der entwickelten ELISAs. ( ein ) Sequenzhomologieanalyse von…

Humorale Immunantwort auf COVID-19.…

Humorale Immunantwort auf COVID-19. Serumproben von gesunden Kontrollen (n = 125)…

Receiver Operating Characteristics (ROC)-Analyse.…

Receiver Operating Characteristics (ROC)-Analyse. Die ROC-Analyse wurde auf positive vs. negative…


Verweise

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Unterschiede in den serologischen IgA-Antworten auf rekombinantes Baculovirus-abgeleitetes humanes Papillomavirus-E2-Protein im natürlichen Verlauf der zervikalen Neoplasie

Eine Infektion mit bestimmten Typen des humanen Papillomavirus (HPV) birgt ein hohes Risiko für die spätere Entwicklung von zervikaler intraepithelialer Neoplasie (CIN) und Zervixkarzinom. Immunologische Mechanismen spielen wahrscheinlich eine Rolle bei der Kontrolle von zervikalen HPV-Läsionen. Das HPV-E2-Protein spielt eine Rolle bei der Virusreplikation und -transkription, und der Verlust von E2-Funktionen kann mit dem Fortschreiten der zervikalen Neoplasie verbunden sein. Dementsprechend ist es von Interesse, Immunantworten auf das E2-Protein zu überwachen, und frühere Studien haben über Zusammenhänge zwischen serologischer Reaktivität gegenüber E2-Peptid-Antigenen und zervikaler Neoplasie berichtet. Um serologische Antworten auf natives E2-Protein in voller Länge zu untersuchen, exprimierten wir HPV-16 E2-Proteine ​​mit und ohne N-terminales Polyhistidin-Tag unter Verwendung des Baculovirus-Systems. Gereinigtes HPV-16 E2-Protein wurde verwendet, um enzymgekoppelte Immunadsorptionsassays zu entwickeln, um serologische IgG- und IgA-Antworten bei zervikalen Neoplasiepatienten und Kontrollen nachzuweisen. Wir fanden, dass die Serum-IgA-Spiegel gegen das E2-Protein bei CIN-Patienten im Vergleich zu normalen Kontrollpersonen erhöht waren, aber bei Patienten mit Gebärmutterhalskrebs nicht erhöht waren. Darüber hinaus schien es innerhalb der zervikalen Neoplasie einen Gradienten der Reaktion zu geben, so dass die höchsten Antikörperspiegel bei niedrigeren Neoplasien bis zu CIN 2 beobachtet wurden, während niedrigere Spiegel bei CIN 3 und noch niedrigere Spiegel bei Zervixkarzinomen beobachtet wurden. Diese Ergebnisse legen nahe, dass die IgA-Antikörperantwort auf E2 mit dem Stadium und der Progression einer zervikalen Neoplasie assoziiert sein kann.


2. MATERIALIEN UND METHODEN

2.1 Zellkulturen und chemische Chaperone

(1)

2.2 Transiente Produktion in HEK- und CHO-Zellen

pCAGGS-Plasmide, die das stabilisierte SARS-CoV-2-Spike-Protein-Trimer in voller Länge codieren (polybasische Furin-Spaltungsstelle neben K986P- und V987P-Substitutionen entfernt, P1213-Addition der Thrombin-Spaltungsstelle, T4-Trimerisierungsdomäne und 6×His-Tag Amanat et al., 2020 ) oder RBD wurden vom Krammer Laboratory (Icahn School of Medicine at Mount Sinai) bereitgestellt. Die Plasmide wurden unter Verwendung des QIAGEN Plasmid Plus Kits (Qiagen) amplifiziert und gereinigt. Für die optimierte Expi293F-Transfektion wurden Zellen auf 1,75 × 10 6 Zellen/ml gezüchtet, zentrifugiert und bei einer Dichte von 3,5 × 10 6 Zellen/ml resuspendiert, gefolgt von der sequentiellen Zugabe von 0,85 µg DNA und 2,55 µl PEI MAX (je vorverdünnt in 10 ul 150 mM NaCl) pro Million Zellen. 24 h nach der Transfektion wurden die Zellen 2x durch Zugabe von frischem Medium verdünnt und gegebenenfalls die Kultur auf 32 °C verschoben. Für die CHO-Transfektion wurden Zellen einen Tag vor der Transfektion ausgesät und auf 1,5 × 10 6 Zellen/ml gezüchtet. Je 1,5 × 10 6 Zellen wurden 1,3 µg DNA und 4,55 µl PEI MAX (jeweils vorverdünnt in 15 µl 150 mM NaCl) vereinigt und 2 min bei Raumtemperatur (RT) inkubiert, bevor sie in die Kultur gegeben wurden. Gegebenenfalls wurde die Kultur 4 h nach der Transfektion auf 32 °C verschoben. Für die Fed-Batch-Produktion wurde an den Tagen 2, 4, 6 und 8 5% v/v CHO CD EfficientFeed B zugegeben.

2.3 Erzeugung stabiler CHO-Pools und Fed-Batch-Produktion

Ein stabiler Vektor, der ein vom SV40-Promotor gesteuertes GS-Gen enthält, wurde von AstraZeneca bereitgestellt. Das Spike-Gen wurde durch PCR kloniert, in den Vektor stromabwärts von 40 oder 100 RPU synthetischem Promotor eingefügt (Brown et al., 2017) und die Plasmidkonstrukte wurden durch DNA-Sequenzierung bestätigt. 10 × 10 6 Zellen pro Küvette wurden mit 7 μg linearisierter DNA unter Verwendung des Cell Line Nucleofector Kit V Systems (Lonza) elektroporiert und nach 48 h in einen TubeSpin mit 10 ml glutaminfreiem Kulturmedium unter Zugabe von 25 oder 50 μM MSX überführt. Die Zellen wurden unter Suspensionsbedingungen erholen gelassen und die gewonnenen Pools wurden kryokonserviert, als die Zelllebensfähigkeit >90% erreichte. Für die Fed-Batch-Produktion wurde an den Tagen 2, 4, 6 und 8 5% v/v CHO CD EfficientFeed B zugegeben.

2.4 Western-Blot-Analyse

Proteine ​​im Kulturüberstand wurden durch TCA/DOC präzipitiert, in LDS-Beladungspuffer mit BME resuspendiert und auf 70 °C erhitzt. SDS-PAGE wurde unter Verwendung von 4-12% NuPAGE Bis-Tris-Gelen durchgeführt und die aufgelösten Proteine ​​wurden durch das iBlot-System (Thermo Fisher Scientific) auf Nitrozellulosemembranen übertragen. Membranen wurden in 5% Milch/Tris-gepufferter Kochsalzlösung mit Tween-20 (TBS-T) blockiert, bevor sie mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugiertem Anti-HisTag-Antikörper (Bio-Rad) inkubiert und durch verstärkte Chemilumineszenz (Thermo Fisher Scientific .) sichtbar gemacht wurden ).

2.5 Aufreinigung und Quantifizierung rekombinanter Proteine

Spike-Protein wurde durch Zentrifugation bei 3000 . geerntetg für 20 min bei 4°C und der Überstand wurde durch einen 0,22 &mgr;m-Filter filtriert. Protein wurde unter Verwendung des ÄKTA Pure-Systems (Cytiva) und einer 5-ml-HisTrap-HP-Säule (Cytiva) gereinigt. Die Säule wurde mit 5 Säulenvolumina (CVs) Puffer B (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 250 mM Imidazol, pH 8,0) gewaschen und mit 5 CVs Puffer A (50 mM Natriumphosphat, 300 mM NaCl, 10 mM Imidazol, pH 8,0). Um die unspezifische Bindung zu reduzieren, wurde der Überstand vor dem Laden der Probe unter Verwendung von Puffer B auf 20 mM Imidazol eingestellt. Nach dem Laden der Probe wurde die Säule in drei Schritten mit 5 CVs von Puffer A, 5 CVs von 4,5 % v/v Puffer B und 10 CVs von 9 % v/v Puffer B gewaschen. Protein wurde mit 100 % v/v . eluiert Puffer B. Eluierte Proteinfraktionen wurden gepoolt und unter Verwendung einer PD-10-Entsalzungssäule (Cytiva) in Lagerpuffer (20 mM Tris, 200 mM NaCl, 10 % Vol./Vol. Glycerin, pH 8,0) gepuffert. Protein wurde unter Verwendung des Pierce Coomassie Plus (Bradford) Assay-Kits und Rinderserumalbumin für die Kalibrierungskurve (Thermo Fisher Scientific) quantifiziert und durch Reduzierung der SDS-PAGE analysiert. Eine orthogonale Quantifizierungsmethode wurde unter Verwendung einer A280-Messung (NanoDrop One C Thermo Fisher Scientific) mit einem Spike-Extinktionskoeffizienten von 428 255 M −1 cm −1 und durchgeführt mW von 412,516 kDa. Eine ergänzende Quantifizierung des Spikes im Kulturüberstand wurde unter Verwendung des CR3022-Antikörper-ELISA (siehe unten) durchgeführt.

2.6 Proteinidentifizierung durch Massenspektrometrie

Alle Materialien wurden von Thermo Fisher Scientific geliefert, sofern nicht anders angegeben. Kurz gesagt wurden Proteinproben in 50 mM Ammoniumbicarbonat (ABC), 5 mM Tris(2-carboxyethyl)phosphin-HCl durch Inkubation bei 37 °C für 30 min reduziert. S-Alkylierung wurde durch Zugabe von 1 ul 100 mM Methylmethanthiosulfonat in Isopropanol durchgeführt. Für den proteolytischen Verdau wurden 1,5 µl 0,2% ProteaseMax-Surfactant in 50 mM ABC und 2 µl 0,2 g/l Trypsin/Endoproteinase Lys-C-Gemisch (Promega) zugegeben, gefolgt von einer Inkubation bei 37ºC für 16 Stunden. Die Proteolyse wurde gestoppt und das Tensid durch Zugabe von 0,5% Trifluoressigsäure (TFA) hydrolysiert. Die Proben wurden mit HyperSep Hypercarb Festphasen-Extraktionsspitzen entsalzt und durch Vakuumzentrifugation getrocknet. Für RPLC-MS wurden Proben in 0,5% TFA, 3% Acetonitril (ACN) injiziert. Peptide wurden unter Verwendung eines RSLCnano-Systems mit einer monolithischen PepSwift PS-DVB-Säule unter Verwendung eines Gradienten von 97% Lösungsmittel A (0,1% Ameisensäure) bis 35% Lösungsmittel B (0,1% Ameisensäure, 80% ACN) getrennt. Massenspektren wurden auf einem Q Exactive HF Quadrupol-Orbitrap-Instrument mit automatisiertem datenabhängigem Umschalten zwischen Voll-MS- und Tandem-MS/MS-Scans aufgenommen. Proteine ​​wurden durch Konvertieren der MS-Daten in Mascot Generic Format (MGF)-Dateien identifiziert und gegen menschliche und chinesische Hamster-Referenzproteom-Datenbanken mit der inserierten Spike-Glykoprotein-Konstruktsequenz (www.uniprot.org) unter Verwendung von Mascot Daemon v.2.5.1 mit Mascot . analysiert Server v.2.5 (Matrix Science).

2.7 CR3022-Antikörper-ELISA zur Spike-Quantifizierung

96-Wells wurden über Nacht mit 100 µl anti-SARS-CoV Spike CR3022 Antikörper (absoluter Antikörper 5 µg/ml in PBS) bei 4 °C beschichtet. Die Beschichtungslösung wurde entfernt und zweimal gewaschen (mit 0,1% TBS-T). 100 ul Blockierungslösung (5% fettfreie Milch in 0,1% TBS-T) wurden 1 Stunde lang zugegeben und zweimal gewaschen. 100 µl der Probe wurden zugegeben und 2 h bei RT inkubiert. Eine Standardkurve (Abbildung S5) wurde aus seriell verdünnten, gereinigten und quantifizierten CHO-Spikes (Abbildung 1d) unter Verwendung von CD-CHO-Medium als Verdünnungsmittel erstellt. Die Platte wurde vor der Inkubation mit 100 &mgr;l HRP-konjugiertem Anti-HisTag-Antikörper (Bio-Rad), 1:500 verdünnt mit 5% Milch/TBS-T, 2 h bei RT zweimal gewaschen. Die Platte wurde dreimal gewaschen und 100 ul SigmaFast OPD-Lösung (Sigma) wurden in jede Vertiefung gegeben. Die Reaktion wurde 10 min bei RT ablaufen gelassen, bevor sie durch die Zugabe von 50 ul 3 M HCl gestoppt wurde. Die Platte wurde bei 492 nm unter Verwendung eines SpectraMax iD5-Plattenlesegeräts (Molecular Devices) gelesen.

2.8 Spike-ELISA für serologische Tests

(2)

Der Cut-off-Wert wurde mit 100 % Spezifität unter Verwendung von ROC-Kurven der berechneten Indexwerte berechnet.


Diskussion

Kreuzreaktivität zwischen verschiedenen Flaviviren war der Hauptnachteil bei den verfügbaren serologischen Assays für die Diagnose von Flavivirus-Infektionen [10, 28]. Viele von ihnen basieren auf dem Nachweis von Antikörpern gegen Hüllproteine, die eine Unterscheidung zwischen Flavivirus-Infektionen schlecht zulassen [29]. Es wurden große Anstrengungen unternommen, um rekombinante Hüllproteine ​​oder virusähnliche Partikel zu generieren, die Mutationen in der Fusionsschleifendomäne enthalten, um den Nachweis kreuzreagierender Antikörper zu reduzieren [30–33], jedoch bleibt das Problem noch ungelöst. Es wurde nachgewiesen, dass die Verwendung von rNS1-Proteinen zum Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern hochspezifisch ist, wie mit kommerziellen Kits oder kommerziell erhältlichen NS1-Proteinen gezeigt wurde [12–14]. Widersprüchliche Ergebnisse beim Nachweis von IgM-Antikörpern von Patienten aus Flavivirus-endemischen Regionen halten jedoch die Nützlichkeit von NS1 als Antigen für den Antikörpernachweis umstritten [34]. In dieser Arbeit haben wir homogen gereinigte rNS1-Antigene bei repräsentativen Mitgliedern der Familie auf Sensitivität und Spezifität verglichen, um die Nützlichkeit des Ansatzes in der Flavivirus-Serologie zu bestimmen.

Es wurde über verschiedene Strategien zur Herstellung und Reinigung von Flavivirus-rNS1-Proteinen und deren Verwendung bei der Entwicklung von NS1-basierten ELISA-Tests berichtet, basierend auf rNS1-Proteinen, die in Systemen produziert werden, die anfällig für Proteinstabilitätsprobleme sind und denen die richtige Faltung und Post- translationale Modifikationen [35–37]. In der vorliegenden Studie berichten wir über eine Strategie zur Herstellung und Reinigung von rNS1-Proteinen von TBEV, WNV, ZIKV und allen DENV-Serotypen aus dem Überstand von transient transfizierten HEK293T-Zellen. Im Überstand vorhandene rekombinante Proteine ​​wurden durch Affinitätschromatographie gereinigt. SDS-PAGE und Western-Blot-Analyse gereinigter Proteine ​​zeigten einen hohen Oligomerenstatus und ein Glykosylierungsprofil, das mit dem von infizierten Zellen sezernierten NS1-Protein vergleichbar war [17, 21]. Gereinigte rNS1-Proteine ​​wurden für den Nachweis spezifischer IgM/IgG-Antikörper unter Verwendung von Seren von immunisierten Mäusen validiert. Die Ergebnisse zeigten eine hohe Spezifität von rNS1-Antigenen für den Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern mit TBEV, WNV und ZIKV. Vergleichbare Ergebnisse, jedoch mit Kreuzreaktivität zu einem zweiten heterologen DENV-rNS1-Antigen, wurden unter Verwendung von Seren von immunisierten Mäusen mit DENV1-4 erhalten, höchstwahrscheinlich aufgrund der hohen Sequenzidentität zwischen den DENV-Serotypen [38]. rNS1-Proteine ​​wurden auch auf den Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern unter Verwendung gut charakterisierter Humanseren getestet. 100 Seren von Patienten mit FSME in verschiedenen Phasen nach Einsetzen der Symptome zeigten eine kombinierte Sensitivität und Spezifität (IgM/IgG) von 96 % im TBEV-rNS1-basierten ELISA. Obwohl in allen Proben aus jeder Phase, die mit kommerziellen ELISA- und TBEV-NS1-basierten ELISA-Assays analysiert wurden, ähnliche Ergebnisse erzielt wurden, waren 7 Proben aus der Rekonvaleszenzphase der TBEV-Infektion IgM-negativ, während sie von kommerziellen Assays als positiv angesehen wurden, vermutlich weil all diese Proben wurden ab zwei Monaten nach Einsetzen der Symptome gesammelt, dh wenn die IgM-Antikörper auf nicht mehr nachweisbare Werte absinken. Im Gegensatz zu den Ergebnissen eines kommerziellen ELISA war nur ein Serum aus der ersten Infektionsphase IgG-positiv im TBEV-rNS1-basierten ELISA, wenn auch mit einem niedrigen Titer.

Der umfangreiche Vergleich durch gleichzeitiges Testen von TBEV-infizierten Seren aus der ersten, zweiten, akuten und rekonvaleszenten Phase mit kommerziellen ELISA- und TBEV-rNS1-basierten ELISA-Assays zeigte eine hohe Korrelation zwischen beiden Assays zum Nachweis von IgM-Antikörpern. Für den Nachweis von IgG-Antikörpern wurde jedoch eine geringe Korrelation erhalten. Obwohl 89/89 IgG-positive und 11/11 IgG-negative TBEV-bestätigte Serenproben aus der ersten, zweiten, akuten und rekonvaleszenten Phase hohe bzw erhalten (Bereich 5,7 bis 883 U/ml). Es wurde bereits über eine hohe Variabilität zwischen kommerziellen ELISA-Assays berichtet [39, 40], jedoch war die Leistung kommerzieller ELISA- und TBEV-rNS1-basierter ELISA-Assays hinsichtlich der Gesamtzahl positiver oder negativer Proben vergleichbar.

Der rNS1-basierte ELISA für den virusspezifischen IgM/IgG-Nachweis schnitt bei WNV, ZIKV und allen DENV-Serotypen gut ab. Mit Ausnahme des Eurimmune ZIKV-Assays auf Basis des NS1-Proteins basieren alle anderen kommerziellen ELISA-Assays auf Hüllproteinen. In fast allen Fällen wurde eine geringe Sensitivität für den IgM-Nachweis beobachtet, wie bereits für mehrere kommerzielle Assays nachgewiesen wurde [40, 41].Eine geringere Sensitivität insbesondere für DENV4 könnte dadurch erklärt werden, dass die meisten kommerziellen Assays zum DENV-IgM-Nachweis nur auf dem Hüllprotein von DENV2, einem der am weitesten verbreiteten DENV-Serotypen, basieren [42]. Dies war nicht der Fall, wenn Proben mit DENV4-rNS1-basierten ELISA analysiert wurden, da alle DENV4-Seren auch IgM-positiv für DENV4 waren.

Die Differenzialdiagnose zwischen geimpften und natürlich infizierten Patienten mit TBEV ist sehr wichtig, um Impfstoff-Durchbruchfälle zu unterscheiden. Die kommerziellen ELISA-Assays, die für die Diagnose von TBEV verfügbar sind, basieren jedoch auf Strukturproteinen, einem Antigen, das auch in TBEV-Impfstoffen vorhanden ist und zwischen Flaviviren hoch kreuzreaktiv ist [29, 43]. Kreuzreaktivität wurde in 3 Serenproben von gegen YFV geimpften Individuen beobachtet. Diese Proben wurden im kommerziellen ELISA auf IgG-positiv getestet, sie waren jedoch im TBEV-rNS1-basierten ELISA negativ. Wir nutzten den rNS1-basierten ELISA zum spezifischen Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern gegen das TBEV-rNS1-Protein aus Serumproben von TBEV-geimpften und Impfstoff-Durchbruch (VBT)-Patienten, einer Gruppe von geimpften Personen über 50 Jahren, die nach Impfversagen mit TBEV infiziert. Wie in der vorliegenden Studie gezeigt, waren alle TBEV-geimpften Proben in kommerziellen Assays IgG-positiv, während sie im TBEV-rNS1-basierten ELISA negativ waren. Wenn VBT-Seren mit kommerziellem ELISA getestet wurden, waren sie durch eine hohe IgG-Antwort mit niedrigen IgM-Spiegeln (in vielen Fällen nicht nachweisbar) gegen Hüllprotein gekennzeichnet. Interessanterweise zeigte der Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern aus dieser Probengruppe gegen das rNS1-Protein von TBEV eine höhere Sensitivität im Vergleich zu kommerziellen ELISA. Zusammen zeigen diese Ergebnisse die Nützlichkeit des TBEV-rNS1-basierten ELISA für die Differentialdiagnose von TBEV.

Zusammenfassend zeigte unsere Studie, dass der rNS1-basierte ELISA ein sensitiver und hochspezifischer Test zum Nachweis von IgM/IgG-Antikörpern ist, was auf seinen möglichen Einsatz in Serodiagnostik- und Überwachungsstudien hinweist. Der rNS1-basierte ELISA könnte auch auf einen Point-of-Care-Test für die syndrombasierte multiparametrische Diagnostik des Flavivirus übertragen werden, ein dringender Test insbesondere in Regionen, in denen mehr als ein Flavivirus zirkuliert [44].


Serologische Tests sind diagnostische Verfahren, die verwendet werden, um Antikörper und Antigene in einer Patientenprobe zu identifizieren. Serologische Tests können durchgeführt werden, um Infektionen und Autoimmunerkrankungen zu diagnostizieren, um zu überprüfen, ob eine Person gegen bestimmte Krankheiten immun ist, und in vielen anderen Situationen, wie z. B. zur Bestimmung der Blutgruppe einer Person. [1] Serologische Tests können auch in der forensischen Serologie verwendet werden, um Beweise am Tatort zu untersuchen. [3] Mehrere Methoden können verwendet werden, um Antikörper und Antigene nachzuweisen, einschließlich ELISA, [4] Agglutination, Präzipitation, Komplementfixierung und fluoreszierende Antikörper und neuerdings Chemilumineszenz. [5]

Anwendungen Bearbeiten

Mikrobiologie Bearbeiten

In der Mikrobiologie werden serologische Tests verwendet, um zu bestimmen, ob eine Person Antikörper gegen einen bestimmten Krankheitserreger hat, oder um Antigene, die mit einem Krankheitserreger assoziiert sind, in einer Probe einer Person nachzuweisen. [6] Serologische Tests sind besonders nützlich für Organismen, die mit routinemäßigen Labormethoden schwer zu kultivieren sind, wie z Treponema pallidum (der Erreger der Syphilis) oder Viren. [7]

Das Vorhandensein von Antikörpern gegen einen Krankheitserreger im Blut einer Person zeigt an, dass sie diesem Krankheitserreger ausgesetzt war. Die meisten serologischen Tests messen eine von zwei Arten von Antikörpern: Immunglobulin M (IgM) und Immunglobulin G (IgG). IgM wird kurz nachdem eine Person dem Erreger ausgesetzt war in großen Mengen produziert, und die Produktion nimmt danach schnell ab. IgG wird auch bei der ersten Exposition produziert, jedoch nicht so schnell wie IgM. Bei nachfolgenden Expositionen handelt es sich bei den produzierten Antikörpern hauptsächlich um IgG, und sie bleiben über einen längeren Zeitraum im Umlauf. [6]

Dies beeinflusst die Interpretation serologischer Ergebnisse: Ein positives Ergebnis für IgM deutet darauf hin, dass eine Person aktuell oder kürzlich infiziert ist, während ein positives Ergebnis für IgG und ein negatives Ergebnis für IgM darauf hindeutet, dass die Person möglicherweise in der Vergangenheit infiziert oder geimpft wurde. Antikörpertests auf Infektionskrankheiten werden häufig in zwei Phasen durchgeführt: während der Ersterkrankung (akute Phase) und nach der Genesung (Rekonvaleszenzphase). Die Antikörpermenge in jeder Probe (Antikörpertiter) wird verglichen, und eine signifikant höhere IgG-Menge in der rekonvaleszenten Probe weist im Gegensatz zu einer früheren Exposition auf eine Infektion hin. [8] Falsch negative Ergebnisse bei Antikörpertests können bei immunsupprimierten Personen auftreten, da sie geringere Mengen an Antikörpern produzieren, und bei Personen, die zu Beginn der Infektion antimikrobielle Medikamente erhalten. [7]

Transfusionsmedizin Bearbeiten

Die Blutgruppenbestimmung wird typischerweise mit serologischen Methoden durchgeführt. Die Antigene auf den roten Blutkörperchen einer Person, die ihre Blutgruppe bestimmen, werden mit Reagenzien identifiziert, die Antikörper enthalten, die als Antiseren bezeichnet werden. Wenn die Antikörper an rote Blutkörperchen binden, die das entsprechende Antigen exprimieren, verursachen sie eine Verklumpung der roten Blutkörperchen (Agglutination), die visuell identifiziert werden kann. Die Blutgruppenantikörper der Person können auch identifiziert werden, indem man Zellen, die das entsprechende Antigen exprimieren, Plasma zusetzt und die Agglutinationsreaktionen beobachtet. [9] [6]

Andere serologische Methoden in der Transfusionsmedizin sind das Crossmatching sowie die direkten und indirekten Antiglobulintests. Ein Crossmatching wird vor einer Bluttransfusion durchgeführt, um sicherzustellen, dass das Spenderblut kompatibel ist. Es beinhaltet die Zugabe des Plasmas des Empfängers zu den Blutzellen des Spenders und die Beobachtung von Agglutinationsreaktionen. [9] Der direkte Antiglobulintest wird durchgeführt, um festzustellen, ob Antikörper an rote Blutkörperchen im Körper der Person gebunden sind, was abnormal ist und bei Erkrankungen wie autoimmunhämolytischer Anämie, hämolytischer Erkrankung des Neugeborenen und Transfusionsreaktionen auftreten kann. [10] Der indirekte Antiglobulintest wird verwendet, um nach Antikörpern zu suchen, die Transfusionsreaktionen auslösen könnten, und um bestimmte Blutgruppenantigene zu identifizieren. [11]


Labor 17: Serologie, direkte und indirekte serologische Tests

Die adaptiven Immunantworten beziehen sich auf die Fähigkeit des Körpers (Selbst), spezifische fremde Antigene (Nicht-Selbst) zu erkennen die seine biologische Integrität gefährden. Es gibt zwei Hauptzweige der adaptiven Immunantwort:

1. humorale Immunität: humorale Immunität umfasst die Produktion von Antikörpermolekülen als Reaktion auf ein Antigen und wird durch B-Lymphozyten vermittelt.

2. zellvermittelte Immunität: Zellvermittelte Immunität umfasst die Produktion von zytotoxischen T-Lymphozyten, aktivierten Makrophagen, aktivierten NK-Zellen und Zytokinen als Reaktion auf ein Antigen und wird durch T-Lymphozyten vermittelt.

Um die Immunantworten zu verstehen, müssen wir zunächst verstehen, was mit dem Begriff Antigen gemeint ist. Technisch ein Antigen ist definiert als eine Substanz, die mit Antikörpermolekülen und Antigenrezeptoren auf Lymphozyten reagiert. Ein Immunogen ist ein Antigen, das vom Körper als körperfremd erkannt wird und eine adaptive Immunantwort stimuliert. Der Einfachheit halber werden sowohl Antigene als auch Immunogene üblicherweise als Antigene bezeichnet.

Chemisch, Antigene haben ein hohes Molekulargewicht Proteine (einschließlich konjugierter Proteine ​​wie Glykoproteine, Lipoproteine ​​und Nukleoproteine) und Polysaccharide (einschließlich Lipopolysaccharide). Diese Protein- und Polysaccharid-Antigene finden sich auf den Oberflächen von Viren und Zellen, einschließlich mikrobieller Zellen (Bakterien, Pilze, Protozoen) und menschlichen Zellen.

Wie oben erwähnt, sind die B-Lymphozyten und T-Lymphozyten die Zellen, die adaptive Immunantworten ausführen. Der Körper erkennt ein Antigen als fremd, wenn dieses Antigen über antigenspezifische Rezeptoren mit einer Form, die der des Antigens entspricht, an die Oberflächen von B-Lymphozyten und T-Lymphozyten bindet, ähnlich wie ineinander greifende Teile eines Puzzles. Die Antigenrezeptoren auf den Oberflächen von B-Lymphozyten sind Antikörpermoleküle, die als B-Zell-Rezeptoren oder sIg bezeichnet werden. Die Rezeptoren auf den Oberflächen von T-Lymphozyten werden als T-Zell-Rezeptoren (TCRs) bezeichnet.

Die tatsächliche Teile oder Fragmente eines Antigens, die mit Rezeptoren auf B-Lymphozyten und T-Lymphozyten sowie mit freien Antikörpermolekülen reagieren, werden genannt Epitope. Die Größe eines Epitops wird allgemein als äquivalent zu . angenommen 5-15 Aminosäuren oder 3-4 Zuckerreste. Einige Antigene, wie Polysaccharide, haben normalerweise viele Epitope, aber alle die gleiche Spezifität. Dies liegt daran, dass Polysaccharide aus Hunderten von Zuckern mit verzweigten Zuckerseitenketten bestehen können, aber normalerweise nur einen oder zwei verschiedene Zucker enthalten. Als Ergebnis sind die meisten "Formen" entlang des Polysaccharids gleich (siehe Fig. 1). Andere Antigene wie Proteine ​​haben normalerweise viele Epitope mit unterschiedlichen Spezifitäten. Dies liegt daran, dass Proteine ​​normalerweise Hunderte von Aminosäuren lang sind und aus 20 verschiedenen Aminosäuren bestehen. Bestimmte Aminosäuren können mit anderen Aminosäuren in der Proteinkette interagieren, wodurch sich das Protein um sich selbst faltet und eine komplexe dreidimensionale Form annimmt. Als Ergebnis gibt es viele verschiedene "Formen" des Proteins (siehe Fig. 2). Deshalb sind Proteine ​​immunogener als Polysaccharide, sie sind chemisch komplexer.

Eine Mikrobe, wie beispielsweise ein einzelnes Bakterium, hat viele verschiedene Proteine ​​(und Polysaccharide) auf ihrer Oberfläche, die gemeinsam ihre verschiedenen Strukturen bilden, und jedes verschiedene Protein kann viele verschiedene Epitope aufweisen. Deswegen, Immunantworten richten sich gegen viele verschiedene Teile oder Epitope derselben Mikrobe.

In Bezug auf Infektionskrankheiten, können als Antigene wirken:

1.mmikrobielle Strukturen (Zellwände, Kapseln, Flagellen, Pili, virale Kapside, Hüll-assoziierte Glykoproteine ​​usw.) und

2. Mikrobielle Toxine

Sicher nicht infektiöse Materialien können auch als Antigene wirken, wenn sie vom Körper als "nicht selbst" erkannt werden. Diese beinhalten:

1. Allergene (Staub, Pollen, Haare, Nahrungsmittel, Hautschuppen, Bienengift, Medikamente und andere Stoffe, die allergische Reaktionen auslösen)

2. Fremdgewebe und Zellen (von Transplantationen und Transfusionen) und

3. Die körpereigenen Zellen, die der Körper nicht als "normales Selbst" erkennt (Krebszellen, infizierte Zellen, an Autoimmunerkrankungen beteiligte Zellen).

Antikörper oder Immunglobuline sind spezifische Proteinkonfigurationen, die von B-Lymphozyten und Plasmazellen produziert werden als Reaktion auf ein spezifisches Antigen und in der Lage, mit diesem Antigen zu reagieren. Antikörper werden in der Lymphgewebe und einmal produziert, finden sich hauptsächlich in den Plasma Teil des Blutes (der flüssige Anteil des Blutes vor der Gerinnung). Serum ist der flüssige Anteil des Blutes nach der Gerinnung.

Es gibt 5 Klassen von menschlichen Antikörpern: IgG, IgM, IgA, IgD und IgE. Die einfachsten Antikörper wie IgG, IgD und IgE sind "Y"-förmige Makromoleküle, die als Monomere bezeichnet werden und aus vier Glykoproteinketten. Es gibt zwei identische schwere Ketten mit einem hohen Molekulargewicht, das mit der Antikörperklasse variiert. Außerdem gibt es zwei identische Lichterketten einer von zwei Sorten: Kappa oder Gamma. Die leichten Ketten haben ein niedrigeres Molekulargewicht. Die vier Glykoproteinketten sind durch Disulfid-(S-S)-Bindungen und nicht-kovalente Bindungen miteinander verbunden (siehe Fig. 3A). Zusätzliche S-S-Bindungen falten die einzelnen Glykoproteinketten in eine Reihe von unterschiedlichen globulären Domänen. Der Bereich, in dem die Oberseite des "Y" auf die Unterseite trifft, wird als Scharnier bezeichnet. Dieser Bereich ist flexibel, damit der Antikörper an Epitoppaare mit unterschiedlichen Abständen auf einem Antigen binden kann.

Die beiden Spitzen des "Y" Monomers werden als die Tolle Portionen des Antikörpers (siehe Fig. 3A). Die ersten 110 Aminosäuren oder die erste Domäne sowohl der schweren als auch der leichten Kette der Fab-Region des Antikörpers Spezifität für die Bindung eines Epitops bereitstellen auf einem Antigen. Die Fab Portionen bieten Spezifität für die Bindung eines Epitops an ein Antigen. Der untere Teil des "Y" wird als bezeichnet FC-Anteil und dieser Teil ist verantwortlich für die biologische Aktivität des Antikörpers (siehe Diagramm von IgG Abb. 3A). Abhängig von der Antikörperklasse umfassen die biologischen Aktivitäten des Fc-Teils von Antikörpern die Fähigkeit, den Komplementweg (IgG & IgM) zu aktivieren, an Phagozyten (IgG, IgA) zu binden oder an Mastzellen und Basophile (IgE) zu binden.

Zwei Klassen von Antikörpern sind komplexer. IgM ist ein Pentamer (siehe Fig. 3B), bestehend aus 5 "Y"-ähnlichen Molekülen, die an ihren Fc-Abschnitten verbunden sind, und sekretorisches IgA ist ein Dimer, das aus 2 "Y"-ähnlichen Molekülen besteht (siehe Fig. 3C).

Weitere Informationen zu Antigenen, Antikörpern und Antikörperproduktion finden Sie in den folgenden Lernobjekten in Ihrem Vorlesungsverzeichnis:

Serologie bezieht sich auf die Verwendung von Antigen-Antikörper-Reaktionen im Labor für Diagnosezwecke. Sein Name kommt daher, dass Serum, der flüssige Teil des Blutes, in dem Antikörper gefunden werden wird beim Testen verwendet. Serologische Tests kann im klinischen Labor auf zwei verschiedene Arten verwendet werden:

A. Um unbekannte Antigene zu identifizieren (wie Mikroorganismen). Das nennt man direkte serologische Untersuchung . Direkte serologische Untersuchung verwendet ein Präparat bekannter Antikörper, genannt Antiserum, zu identifizieren unbekanntes Antigen wie ein Mikroorganismus.

B. Zum Nachweis von Antikörpern gegen ein bestimmtes Antigen im Serum des Patienten. Das nennt man indirekte serologische Testung . Indirekte serologische Testung ist das Verfahren, mit dem Antikörper im Serum einer Person die von diesem Individuum gegen ein mit einer bestimmten Krankheit assoziiertes Antigen hergestellt werden, werden unter Verwendung von a . nachgewiesen bekanntes Antigen.

EIN Antigen-Antikörper-Reaktionen können im Labor mit einer Vielzahl von Techniken nachgewiesen werden. Einige der üblicherweise verwendeten Techniken zum Beobachten von in vitro-Antigen-Antikörper-Reaktionen werden unten kurz beschrieben.

A. Agglutination

Bekanntes Antiserum bewirkt, dass Bakterien oder andere partikuläre Antigene verklumpen oder agglutinieren. Molekulare Antigene können nachgewiesen werden, indem die bekannten Antikörper an größere, unlösliche Partikel wie Latexpartikel oder rote Blutkörperchen angeheftet werden, um die Agglutination mit bloßem Auge sichtbar zu machen.

B. Niederschlag

Bekanntes Antiserum wird mit löslichem Testantigen vermischt und ein trüber Niederschlag bildet sich im Bereich des optimalen Antigen-Antikörper-Verhältnisses.

C. Komplement-Fixierung

Ein bekanntes Antiserum wird mit dem Testantigen gemischt und Komplement hinzugefügt. Dann werden rote Blutkörperchen von Schafen und Hämolysine (Antikörper, die die roten Blutkörperchen von Schafen in Gegenwart von freiem Komplement lysieren) zugegeben. Wird das Komplement bei der ersten Antigen-Antikörper-Reaktion gebunden, steht es für die Schaf-Erythrozyten-Hämolysin-Reaktion nicht zur Verfügung und es findet keine Hämolyse statt. Ein negativer Test würde zu einer Hämolyse führen.

D. Enzyme-linked Immunosorbant Assay oder ELISA (auch bekannt als Enzymimmunoassay oder EIA)

Testantigene von Proben werden durch ein Röhrchen (oder eine Membran) geleitet, das mit den entsprechenden spezifischen bekannten Antikörpern beschichtet ist, und werden an den Wänden des Röhrchens (oder auf der Membran) gefangen. Bekannte Antikörper, an die ein Enzym chemisch gebunden wurde, werden dann durch das Röhrchen (oder die Membran) geleitet, wo sie sich mit den eingefangenen Antigenen verbinden. Substrat für das angelagerte Enzym wird dann zugegeben und die Menge des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ist proportional zur Menge der Enzym-Substrat-Reaktion, wie durch eine Farbänderung angezeigt.

e. Radioaktive Bindungstechniken

Testantigene von Proben werden durch ein Röhrchen geleitet, das mit den entsprechenden spezifischen bekannten Antikörpern beschichtet ist, und werden an den Wänden des Röhrchens gefangen. Bekannte Antikörper, an die ein radioaktives Isotop chemisch gebunden wurde, werden dann durch das Röhrchen geleitet, wo sie sich mit den eingefangenen Antigenen verbinden. Die Menge des gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexes ist proportional zum Grad der Radioaktivität.

F. Fluoreszenz-Antikörper-Technik

An die bekannten Antikörper ist ein Fluoreszenzfarbstoff chemisch gebunden. Wenn der fluoreszierende Antikörper mit dem Antigen reagiert, fluoresziert das Antigen bei Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop.

B. DIREKTE SEROLOGISCHE TESTS: VERWENDUNG VON ANTIGEN-ANTIKÖRPER-REAKTIONEN IM LABOR, UM UNBEKANNTE ANTIGENE WIE MIKROORGANISMEN ZU IDENTIFIZIEREN.

Diese Art der serologischen Untersuchung verwendet bekanntes Antiserum (Serum, das spezifische bekannte Antikörper enthält). Die Herstellung bekannter Antikörper erfolgt auf eine von zwei Wegen: in Tieren oder durch Hybridomzellen.

1. Herstellung bekannter Antiseren bei Tieren.

Die Herstellung eines bekannten Antiserums bei Tieren beinhaltet das Beimpfen von Tieren mit spezifischen bekannten Antigenen, wie einem spezifischen Stamm eines Bakteriums. Nachdem die Immunantworten des Tieres Zeit hatten, Antikörper gegen dieses Antigen zu produzieren, wird dem Tier Blut abgenommen und das Blut kann gerinnen. Der resultierende flüssige Teil des Blutes ist das Serum und enthält Antikörper, die für das injizierte Antigen spezifisch sind.

Eines der Probleme bei der Verwendung von Antikörpern, die in Tieren hergestellt werden (durch Injektion eines spezifischen Antigens in das Tier und Sammeln des Serums nach der Antikörperproduktion), besteht jedoch darin, dass bis zu 90 % der Antikörper im Tierserum Antikörper sein können, die das Tier hergestellt hat "von sich aus" gegen Umweltantigene und nicht gegen solche, die gegen das injizierte Antigen hergestellt wurden. Die Entwicklung der monoklonalen Antikörpertechnik hat dieses Problem weitgehend gelöst.

2. Herstellung bekannter Antikörper durch monoklonale Antikörpertechnik.

Einer der wichtigsten Durchbrüche in der Immunologie war die Entwicklung der monoklonalen Antikörpertechnik. Monoklonale Antikörper sind Antikörper eines einzigen spezifischen Typs. Bei dieser Technik wird einem Tier das spezifische Antigen (siehe Fig. 4, Schritt 1) ​​für den gewünschten Antikörper injiziert. Nach einer angemessenen Zeit für die Antikörperproduktion wird die Milz des Tieres entfernt. Die Milz ist reich an Plasmazellen und jede Plasmazelle produziert nur einen spezifischen Antikörpertyp. Plasmazellen wachsen jedoch nicht künstlich in Zellkulturen. Daher wird eine Plasmazelle, die den gewünschten Antikörper produziert, mit einer Myelomzelle fusioniert, einer Krebszelle aus dem Knochenmark, die in Zellkultur schnell wächst, um ein Hybridomzelle (siehe Abb. 4, Schritt 2). Die Hybridomzelle weist die Eigenschaften beider Elternzellen auf. Es wird produzieren die spezifischen Antikörper wie die Plasmazelle und wachsen auch leicht in Zellkulturen wie die Myelomzelle. Die Hybridomzellen werden in riesigen Bottichen künstlich gezüchtet, wo sie große Mengen des spezifischen Antikörpers produzieren (siehe Abb. 4, Schritt 3).

Monoklonale Antikörper werden heute routinemäßig in der medizinischen Forschung und diagnostischen Serologie verwendet und werden experimentell bei der Behandlung bestimmter Krebsarten und einiger anderer Krankheiten verwendet.

3. Das Konzept und das allgemeine Verfahren für die direkte serologische Testung.

Das Konzept und das allgemeine Verfahren zur Verwendung von Antigen-Antikörper-Reaktionen zur Identifizierung unbekannter Antigene sind wie folgt:

Diese Prüfung basiert auf der Tatsache, dass Antigen-Antikörper-Reaktionen sind sehr spezifisch. Antikörper reagieren normalerweise nur mit dem Antigen, das ihre Produktion überhaupt stimuliert hat, und sind ebenso spezifisch wie eine Enzym-Substrat-Reaktion. Aus diesem Grund kann man bekanntes Antiserum (hergestellt durch Tierimpfung oder monoklonale Antikörpertechnik wie oben beschrieben) zur Identifizierung unbekannte Antigene wie ein Mikroorganismus.

Eine Aussetzung von das unbekannte Antigen zu identifizieren ist vermischt mit bekanntes Antiserum für dieses Antigen. Dann sucht man nach einer Antigen-Antikörper-Reaktion.

Beispiele für serologische Tests, die verwendet werden, um unbekannte Mikroorganismen zu identifizieren, umfassen die serologische Typisierung von Shigella und Salmonellen (Lab 13), die Lancefield-Typisierung von Beta-Streptokokken (Lab 14) und die serologische Identifizierung von Neisseria gonorrhoeae und Meningokokken (Labor 16). Serologische Tests, die verwendet werden, um Antigene zu identifizieren, die keine Mikroorganismen sind, umfassen Blutgruppenbestimmung, Gewebetypisierung und Schwangerschaftstests.

4. Beispiele für direkte serologische Tests zur Identifizierung unbekannter Antigene

Wie oben erwähnt, verwendet diese Art von serologischen Tests bekanntes Antiserum (Antikörper) zur Identifizierung unbekannter Antigene. Vier solcher Tests werden heute im Labor untersucht.

A . Serologische Typisierung von Shigella

Es gibt vier verschiedene serologische Untergruppen von Shigella, die jeweils einer anderen Art entsprechen:

  • Untergruppe A = Shigella-Dysenteriae
  • Untergruppe B = Shigella flexneri
  • Untergruppe C = Shigella boydii
  • Untergruppe D = Shigella sonnei

Für jede der 4 Untergruppen von ist ein bekanntes Antiserum verfügbar Shigella oben aufgeführt und enthält Antikörper gegen die Zellwand ("O" Antigene) von Shigella. Der Verdächtige Shigella (das unbekannte Antigen) wird in jeden der 4 Kreise auf einem Objektträger gegeben und dann wird jedem Kreis ein anderes bekanntes Antiserum (A, B, C oder D) hinzugefügt. Eine positive Antigen-Antikörper-Reaktion zeigt sich als Verklumpung oder Agglutination der Shigella (siehe Abb. 5).

B . Serologische Typisierung von Streptokokken

Die Clearview® Strep A Exact II Messstab ist ein qualitativer serologischer Test für Nachweis von Streptokokken-Antigenen der Gruppe A (das unbekannte Antigen) direkt aus Rachenabstrichen und wird als Hilfsmittel bei Diagnose von Streptokokken-Pharyngitis verursacht durch Streptococcus pyogenes (Gruppe A Beta-Streptokokken).

Der Test besteht aus einem Membranstreifen, der mit Kaninchen-Anti-Strep-A-Antikörper-rotes Latex-Konjugat (bekannter Antikörper mit angelagerten roten Latexpartikeln) in einem Pad am Anfang des Streifens. Es ist auch vorbeschichtet mit Kaninchen-Anti-Strep-A-Antikörper (bekannter Antikörper ohne angelagerten roten Latex), der an der Testlinie immobilisiert wird, wo die Testergebnisse abgelesen werden (siehe Abb. 6A). Die rote Latexpartikel an den Kaninchen-Anti-Strep-A-Antikörper gebunden ist, was letztendlich die „positive&rdquo rote Bande verursacht.

Wenn der Teststreifen in die entnommene Probe eingetaucht wird, Gruppe A Streptokokken-Antigen extrahiert aus dem Streptococcus pyogenes auf dem Rachenabstrich einer Person mit Streptokokken beginnt sich chromatographisch die Membran nach oben zu bewegen und bindet an das rot gefärbte bekannte Antikörper-Latex-Konjugat im Pad befindet sich am Anfang des Streifens und bildet einen Strep-A-Antigen-Antikörper-Komplex (siehe Fig. 6B). Dieser Strep-A-Antigen-Antikörper-Komplex bewegt sich weiter die Membran hinauf zum Testlinienbereich, wo sich die immobilisierten Kaninchen-Anti-Strep-A-Antikörper befinden.

Wenn ein Streptokokken-Antigen der Gruppe A im Rachenabstrich vorhanden ist, a rotes Sandwich aus Antikörper/Strep-A-Antigen/rotem Latex-Konjugat-Antikörper bildet sich in der Testlinienregion des Streifens (siehe Abb. 6C). Die rote Farbe im Bereich der Kontrolllinie erscheint, wenn genügend Reagenz den Kontrollbereich erreicht hat und zeigt an, dass der Test beendet ist. Als Ergebnis, ein positiver Test auf Strep-Antigen der Gruppe A erscheint als rotes Band im Testergebnisbereich und als rotes Band im Kontrollbereich (siehe Abb. 6C).

Wenn kein Streptokokken-Antigen der Gruppe A im Rachenabstrich vorhanden ist im Testergebnisbereich erscheint kein rotes Band des Streifens und ein einzelnes rotes Band erscheint im Kontrolllinienbereich, zeigt einen negativen Test auf Strep-Antigen der Gruppe A an (siehe Abb. 6D).

C . Serologische Tests zur Diagnose einer Schwangerschaft

Die Alere® hCG Messstab ist ein qualitativer serologischer Test für Frühschwangerschaft erkennen. Das Hormon humanes Choriongonadotropin (hCG), das von der Plazenta produziert wird, kommt im Serum und Urin von schwangeren Frauen vor. Das hCG besteht aus zwei Untereinheiten - Alpha und Beta. Der Alere® hCG Dipstick ist ein einstufiger Schwangerschaftstest, der hCG-Spiegel von nur 25 mlU/ml erkennt. Humanes Choriongonadotropin (hCG), das unbekannte Antigen, auf das getestet wird, wird im Urin mit Hilfe von bekannte monoklonale Maus-Antikörper gegen die Beta-Untereinheit von hCG, gebunden an kolloidales Gold, was rot ist. Es verwendet auch bekannte polyklonale Ziegen-Antikörper gegen die Alpha-Untereinheit von hCG, die an die Testergebnisregion des Teststreifens gebunden ist.

Wie der oben erwähnte Strep-A-Test verwendet dieser Test einen farbimmunchromatographischen Assay, um die Antigen-Antikörper-Reaktion nachzuweisen. Der Test besteht aus einem Membranstreifen, der mit bekanntes Maus-Anti-Beta-hCG-Antikörper-kolloidales Gold-Konjugat (bekannter Antikörper mit angelagerten roten kolloidalen Goldpartikeln) in einem Pad am Anfang des Streifens. Es ist auch vorbeschichtet mit bekannter Ziegen-Anti-Alpha-hCG-Antikörper (bekannter Antikörper ohne angelagertes kolloidales Rotgold), der an der Testlinie immobilisiert wird, an der die Testergebnisse abgelesen werden (siehe Abb. 7B1). Die roten kolloidalen Goldpartikel, die an den Maus-Anti-Alpha-hCG-Antikörper gebunden sind, verursachen letztendlich die „positive&rdquo rote Bande.

Wenn der Teststreifen in die Urinprobe eingetaucht wird, hCG beginnt sich chromatographisch die Membran nach oben zu bewegen und bindet an das rot gefärbte bekannte Anti-Beta-hCG-Antikörper-Gold-Konjugat im Pad befindet sich am Anfang des Streifens und bildet einen hCG-Antigen-Antikörper-Komplex (siehe Abb. 7B2). Dieser hCG-Antigen-Antikörper-Komplex bewegt sich weiter die Membran hinauf zum Testlinienbereich, wo die immobilisierten bekannten Ziegen-anti-beta-hCG-Antikörper gebunden sind.

Wenn hCG im Urin vorhanden ist, a rot gefärbtes Sandwich aus Anti-Beta-Antikörper/hCG-Antigen/Rotgold-Konjugat Anti-Alpha-Antikörper bildet sich in der Testlinienregion des Streifens (siehe Abb. 7B3). Die rote Farbe im Bereich der Kontrolllinie erscheint, wenn genügend Reagenz den Kontrollbereich erreicht hat und zeigt an, dass der Test beendet ist. Als Ergebnis, ein positiver Test auf hCG-Antigen erscheint als rotes Band im Testergebnisbereich und als rotes Band im Kontrollbereich (siehe Abb. 7B3).

Wenn da ist kein nachweisbares hCG-Antigen im Urin vorhanden im Testergebnisbereich erscheint kein rotes Band des Streifens und ein einzelnes rotes Band erscheint im Kontrolllinienbereich, Hinweis auf einen negativen Test auf hCG-Antigen (siehe Abb. 7B4).

D . Identifizierung von Mikroorganismen mit der Direct Fluorescent Antibody-Technik

Sicher Fluoreszenzfarbstoffe kann chemisch sein an die bekannten Antikörpermoleküle gebunden im Antiserum. Der bekannte fluoreszierende Antikörper wird dann mit dem unbekannten Antigen, beispielsweise einem Mikroorganismus, vermischt und auf einem Objektträger fixiert. Um nach dem Waschen alle nicht an das Antigen gebundenen fluoreszierenden Antikörper zu entfernen, wird der Objektträger mit a . betrachtet Fluoreszenzmikroskop.

Wenn der fluoreszierende Antikörper mit dem unbekannten Antigen reagiert hat, leuchtet oder fluoresziert das Antigen unter dem Fluoreszenzmikroskop. Wenn der Antikörper nicht mit dem Antigen reagiert hat, werden die Antikörper vom Objektträger gewaschen und das Antigen fluoresziert nicht.

Zum Beispiel in der Direktfluoreszenz Antikörpertest für Neisseria gonorrhoeae, kurz erwähnt in Labor 16, das unbekannte Antigen, vermutet Neisseria gonorrhoeae, ist auf einem Objektträger befestigt. Bekannte fluoreszierende Antikörper gegen N. gonorrhoeae werden dann zugegeben (siehe Abb. 8, Schritt 1) ​​und der Objektträger wird dann gewaschen, um alle nicht an das Antigen gebundenen fluoreszierenden Antikörper zu entfernen. Der Objektträger wird dann unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet.

Wenn das unbekannte Antigen Neisseria gonorrhoeae, die bekannten Antikörper gegen N. gonorrhoeae mit angelagertem Fluoreszenzfarbstoff bindet sich an das Bakterium und wird nicht abgewaschen. Die Bakterien fluoreszieren, wenn sie unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden (siehe Abb. 8, Schritt 2 und Abb. 10). Wenn das unbekannte Antigen nicht N. gonorrhoeae, werden die bekannten fluoreszierenden Antikörper gegen den Objektträger abgewaschen und die Bakterien fluoreszieren nicht, wenn sie unter einem Fluoreszenzmikroskop betrachtet werden.

Viele Bakterien, Viren und Pilze können mit dieser Technik identifiziert werden.

Medscape-Artikel über Infektionen im Zusammenhang mit Organismen, die in dieser Laborübung erwähnt werden. Die Registrierung für den Zugriff auf diese Website ist kostenlos.

C. INDIREKTE SEROLOGISCHE TESTS: VERWENDUNG VON ANTIGEN-ANTIKÖRPER-REAKTIONEN IM LABOR ZUR INDIREKTEN DIAGNOSE VON KRANKHEITEN DURCH NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN IM SERUM EINER PERSON, DIE GEGEN EIN KRANKHEITSANIGEN HERGESTELLT WURDEN

Indirekte serologische Testung ist das Verfahren, bei dem Antikörper im Serum einer Person die von diesem Individuum gegen ein mit einer bestimmten Krankheit assoziiertes Antigen hergestellt werden, werden unter Verwendung von a . nachgewiesen bekanntes Antigen.

1. Konzept und allgemeine Vorgehensweise bei der indirekten serologischen Untersuchung.

Das Konzept und die allgemeine Vorgehensweise für diese Art der serologischen Untersuchung sind wie folgt:

Diese Art der Prüfung basiert auf der Tatsache, dass Antikörper werden nur als Reaktion auf ein bestimmtes Antigen gebildet. Mit anderen Worten, eine Person produziert keine Antikörper gegen ein Krankheitsantigen, es sei denn, dieses Antigen befindet sich im Körper und stimuliert die Antikörperproduktion.

Eine Probe der Patientenserum (der flüssige Teil des Blutes nach der Gerinnung, der Antikörper gegen das Krankheitsantigen enthält, wenn die Person die Krankheit hat oder hatte) wird mit dem bekanntes Antigen für diese vermutete Krankheit. Dann sucht man nach einer Antigen-Antikörper-Reaktion.

Beispiele für serologische Tests zur Diagnose von Krankheiten durch den Nachweis von Antikörpern im Serum des Patienten sind die verschiedenen serologischen Tests auf Syphilis oder STS (wie der RPR-, der VDRL- und der FTA-ABS-Test), die Tests auf infektiöse Mononukleose, die Tests für das Humane Immundefizienz-Virus (HIV), die Tests auf systemischen Lupus erythematodes und Tests auf verschiedene andere Virusinfektionen.

2. Qualitative und quantitative serologische Tests.

Indirekte serologische Tests können qualitativ oder quantitativ sein. EIN qualitativ Der Test weist nur das Vorhandensein oder Fehlen spezifischer Antikörper im Serum des Patienten nach und wird häufig für Screening-Zwecke verwendet. EIN quantitativ Test gibt den Titer oder die Menge dieses Antikörpers im Serum an. Titer gibt an, wie weit Sie das Serum des Patienten verdünnen können und es noch genügend Antikörper enthält, um eine nachweisbare Antigen-Antikörper-Reaktion auszulösen. Mit anderen Worten, je mehr Antikörper der Körper produziert, desto mehr können Sie das Serum der Person verdünnen und trotzdem eine Reaktion sehen. Quantitative serologische Tests werden häufig verwendet, um das Fortschreiten einer Krankheit zu verfolgen, indem nach einem Anstieg und anschließendem Abfall des Antikörpertiters gesucht wird.

3. Beispiele für indirekte serologische Tests zum Nachweis von Antikörpern im Patientenserum

A. Der RPR-Test für Syphilis

Syphilis ist eine sexuell übertragbare Krankheit, die durch Spirochäten verursacht wird Treponema pallidum. Die RPR (Rapid Plasma Reagin) Card®-Test ist a präsumtiver serologischer Screening-Test für Syphilis. Das Serum einer Person mit Syphilis enthält a unspezifischer Anti-Lipid-Antikörper (traditionell bezeichnet reagin), die in normalem Serum nicht vorkommt. Die genaue Natur des Anti-Lipid-(Reagin-)Antikörpers ist nicht bekannt, aber es wird angenommen, dass eine Syphilis-Infektion den Abbau der eigenen Gewebezellen des Patienten auslöst. Fettstoffe, die freigesetzt werden, verbinden sich dann mit Protein aus Treponema pallidum um ein Antigen zu bilden, das den Körper zur Produktion anregt Antikörper sowohl gegen die körpereigenen Gewebelipide (unspezifisch oder nicht-treponemal) als auch gegen die T. pallidum Protein (spezifisch oder treponemal). Der RPR Card®-Test weist den unspezifischen Antilipid-Antikörper nach und wird als a . bezeichnet nicht-treponemaler Test auf Syphilis.

- rasterelektronenmikroskopische Aufnahme der Spirochäte Treponema pallidum mit freundlicher Genehmigung von CDC.

Es muss daran erinnert werden, dass Tests auf das Vorhandensein dieser unspezifischen Antilipid-Antikörper als präsumtiver Screening-Test für Syphilis gedacht sind. Ähnliche Reagin-ähnliche Antikörper können auch als Folge anderer Krankheiten wie Malaria, Lepra, infektiöser Mononukleose, systemischer Lupus erythematodes, viraler Lungenentzündung, Masern und Kollagenkrankheiten vorhanden sein und zu biologisch falsch positiven Ergebnissen (BFP) führen. Es sollten Bestätigungstests auf das Vorhandensein spezifischer Antikörper gegen die T. pallidum selbst. Der bestätigende Test für Syphilis ist der FTA-ABS unten besprochenen Test. Jeder serologische Test auf Syphilis wird allgemein als an . bezeichnet STS (Serologischer Test auf Syphilis).

Die bekanntes RPR-Antigen besteht aus Cardiolipin, Lecithin und Cholesterin an Kohlepartikel gebunden um die Reaktion mit bloßem Auge sichtbar zu machen. Wenn der Patient Syphilis hat, kreuzreagieren die Antilipid-Antikörper in seinem Serum mit den bekannten RPR-Lipid-Antigenen, was zu einer sichtbaren Verklumpung der Aktivkohlepartikel führt (siehe Abb. 1).

Wir werden a quantitativ RPR Card® Test heute im Labor. Denken Sie daran, dass ein quantitativer Test es ermöglicht, die Titer oder Menge eines bestimmten Antikörpers im Serum. Bei diesem Test wird den Verdünnungen des Patientenserums eine konstante Menge an RPR-Antigen zugesetzt. Die am stärksten verdünnte Probe des Patientenserums, die noch genügend Antikörper enthält, um eine sichtbare Antigen-Antikörper-Reaktion hervorzurufen, wird als Titer angegeben.

B. Serologische Tests auf infektiöse Mononukleose

Im Verlauf einer infektiösen Mononukleose, ausgelöst durch das Epstein-Barr-Virus (EBV), produziert der Körper unspezifische heterophile Antikörper die in normalem Serum nicht vorkommen. Wie sich herausstellt, sind diese heterophile Antikörper kreuzreagieren mit Glykoprotein-Antigenen, die sich auf der Oberfläche der roten Blutkörperchen (RBCs) verschiedener Tiere befinden, einschließlich Pferden, Schafen und Kühen, wodurch die Erythrozyten agglutinieren. Diese kreuzreagierenden Glykoprotein-Antigene werden oft als Paul-Bunnell-Antigene nach ihren Entdeckern.

Der heute demonstrierte serologische Test auf infektiöse Mononukleose ist ein Schnelltest qualitativ Test auf infektiöse Mononukleose, der verwendet An mikroskopisch kleinen weißen Latexpartikeln adsorbierte Paul-Bunnell-Antigene als "bekanntes Antigen". Diese Antigene binden spezifisch an die heterophilen Antikörper, die im Serum von Menschen mit infektiöser Mononukleose vorkommen die Latexpartikel verklumpen oder verklumpen (siehe Abb. 2). Quantitative Tests können dann durchgeführt werden, um den Titer von heterophilen Antikörpern zu bestimmen und das Fortschreiten der Krankheit zu verfolgen.

C. Serologische Tests auf systemischen Lupus erythematodes (SLE)

Systemischer Lupus erythematodes oder SLE ist eine systemische Autoimmunerkrankung. Immunkomplexe lagern sich zwischen Dermis und Epidermis sowie in Gelenken, Blutgefäßen, Glomeruli der Nieren und im Zentralnervensystem ab. Es ist bei Frauen viermal häufiger als bei Männern. Beim SLE werden Autoantikörper gegen Bestandteile der DNA gebildet. Dieser Test ist spezifisch für das Serum Anti-Desoxyribonukleoprotein-Antikörper mit SLE verbunden. Die bekanntes Antigen ist an Latexpartikeln adsorbiertes Desoxyribonukleoprotein um die Reaktion für das Auge sichtbarer zu machen (siehe Abb. 3). Das ist ein qualitativ Test zum Screening auf das Vorhandensein der Krankheit und zur Überwachung ihres Verlaufs.

D. Nachweis von Antikörpern mit der indirekten Fluoreszenz-Antikörper-Technik: Der FTA-ABS-Test auf Syphilis

Die indirekt Die Fluoreszenz-Antikörper-Technik umfasst drei verschiedene Reagenzien:

A. Die Patientenserum (enthält Antikörper gegen das Krankheitsantigen, wenn die Krankheit vorliegt)

B. Bekanntes Antigen für die vermutete Krankheit

C. Fluoreszierende Anti-Human-Gammaglobulin-Antikörper (Antikörper, die in einem anderen Tier gegen den Fc-Anteil von menschlichen Antikörpern hergestellt wurden (siehe Fig. 9), indem einem Tier menschliches Serum injiziert wird. Ein Fluoreszenzfarbstoff wird dann chemisch an die Anti-Human-Gammaglobulin-(Anti-HGG)-Antikörper gebunden.

Die FTA-ABS-Test (Fluoreszierender Treponemal-Antikörper-Absorptionstest) für Syphilis ist ein Beispiel für ein indirektes Fluoreszenz-Antikörper-Verfahren. Das ist ein Bestätigungstest für Syphilis, da es speziell auf getestet wird Antikörper im Serum des Patienten, die als Reaktion auf die Syphilis-Spirochäte gebildet werden, Treponema pallidum.

In diesem Test getötet T. pallidum,(das bekannte Antigen) wird auf einem Objektträger fixiert (siehe Abb. 4, Schritt 1). Das Serum des Patienten wird auf den Objektträger gegeben. Wenn der Patient Syphilis hat, Antikörper gegen die T. pallidum reagiert mit dem Antigen auf dem Objektträger (Abb. 4, Schritt 2). Der Objektträger wird dann gewaschen, um alle Antikörper zu entfernen, die nicht an die Spirochäte gebunden sind.

Um diese Reaktion sichtbar zu machen, wird ein zweiter tierischer Antikörper gegen humane Antikörper hinzugefügt und mit einem Fluoreszenzfarbstoff markiert (fluoreszierendes Anti-Human-Gammaglobulin). Diese fluoreszierenden Anti-HGG-Antikörper reagieren mit den Antikörpern des Patienten, die mit dem T. pallidum auf der Folie (Abb. 4, Schritt 3). Der Objektträger wird gewaschen, um alle ungebundenen fluoreszierenden Anti-HGG-Antikörper zu entfernen, und mit einem Fluoreszenzmikroskop beobachtet. Leuchten oder fluoreszieren die Spirochäten (siehe Abb. 5), hat der Patient Antikörper gegen . gebildet T. pallidum und hat Syphilis.

Ein weiteres Beispiel für den indirekten fluoreszierenden Antikörpertest ist der Test auf Antikörper gegen das Masernvirus. Inaktivierte Masernvirus-infizierte Zellen (das bekannte Antigen) werden auf einem Objektträger fixiert. Anschließend wird das Serum des Patienten zugegeben. Wenn die Person Masern hat, werden Antikörper des Isotyps IgG gegen das Masernvirus gebildet und binden an virale Epitope auf den bekannten Masernvirus-infizierten Zellen. Nach dem Waschen des Objektträgers, um ungebundenes IgG zu entfernen, wird fluoreszierendes Anti-Human-IgG hinzugefügt. Das fluoreszierende Anti-Human-IgG bindet dann an das IgG des Patienten, das an die infizierten Zellen gebunden ist. Bei Betrachtung mit einem Fluoreszenzmikroskop fluoreszieren die infizierten Zellen grün.

e. Die serologischen EIA- und Western-Blot-Tests auf Antikörper gegen das Humane Immunschwächevirus (HIV)

Bei den aktuellen HIV-Antikörpertests ist die Patientenserum wird gemischt mit verschiedene HIV-Antigene, die durch rekombinante DNA-Technologie hergestellt werden. Wenn die Person seropositiv ist (wiederholte positive Antigen-Antikörper-Tests hat), muss sich HIV im Körper dieser Person befinden und die Antikörperproduktion stimulieren. Mit anderen Worten, die Person muss mit HIV infiziert sein. Die beiden am häufigsten verwendeten Tests zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV sind die Enzymimmunoassay oder EIA (auch bekannt als Enzyme-Linked Immunosorbant Assay oder ELISA) und die Westernblot oder WB. Eine Person gilt nur dann als seropositiv für eine HIV-Infektion, wenn ein EIA-Screening-Test wiederholt reaktiv ist und ein anderer Test wie der WB durchgeführt wurde, um die Ergebnisse zu bestätigen.

Die UVP ist kostengünstiger, schneller und technisch weniger kompliziert als die WB und wird zunächst als Screening-Test für eine HIV-Infektion durchgeführt. Die verschiedenen EIA-Tests liefern eine spektrophotometrische Ablesung der Menge der Antikörper, die an bekannte HIV-Antigene binden.

Das UVP-Testkit enthält Plastiknäpfe, an denen verschiedene HIV-Antigene adsorbiert wurden (siehe Abb. 6, Schritt 1). Die Patientenserum wird in die Wells gegeben und alle im Serum vorhandenen Antikörper gegen HIV-Antigene binden an die entsprechenden Antigene in den Wells (Abb. 6, Schritt 2). Die Vertiefungen werden dann gewaschen, um alle Antikörper im Serum zu entfernen, außer denen, die an HIV-Antigene gebunden sind. Enzymgebundene Anti-Human-Gammaglobulin-(Anti-HGG)-Antikörper werden dann in die Vertiefungen gegeben. Diese Antikörper, die in einem anderen Tier gegen den Fc-Anteil menschlicher Antikörper durch Injektion von menschlichem Serum in das Tier hergestellt werden, weisen ein chemisch angelagertes Enzym auf. Sie reagieren mit den menschlichen Antikörpern, die an die bekannten HIV-Antigene gebunden sind (Abb. 6, Schritt 3). Die Wells werden dann gewaschen, um jegliches Anti-HGG zu entfernen, das nicht an Serumantikörper gebunden hat. EIN Substratspezifisch für das Enzym wird dann zugegeben und die resultierende Enzym-Substrat-Reaktion verursacht a Farbwechsel in den Wells (Abb. 6, Schritt 4). Wenn im Serum des Patienten keine Antikörper gegen HIV vorhanden sind, kann sich das enzymgekoppelte Anti-HGG nicht daran binden und es wird aus den Vertiefungen gewaschen. Wenn das Substrat hinzugefügt wird, ist kein Enzym in den Vertiefungen vorhanden, was zu einer Farbänderung führt.

Wenn die anfängliche UVP reaktiv ist, ist es automatisch wiederholt um die Möglichkeit zu verringern, dass ein technischer Laborfehler das reaktive Ergebnis verursacht hat. Wenn die UVP immer noch reaktiv ist, ist sie es dann bestätigt durch den Western-Blot-Test.

Die Westernblot WB ist der Test, der am häufigsten als Bestätigungstest verwendet wird, wenn der EIA wiederholt positiv ist. Der WB ist technisch komplexer durchzuführen und zu interpretieren, ist zeitaufwendiger und teurer als die UVP.

Beim WB werden die verschiedenen Protein- und Glykoprotein-Antigene von HIV nach ihrem Molekulargewicht durch Gelelektrophorese getrennt (ein Verfahren, bei dem geladene Proteine ​​in einem Gel durch Anlegen eines elektrischen Feldes getrennt werden). Nach der Trennung werden die verschiedenen HIV-Antigene auf einen Nitrozellulosestreifen übertragen (siehe Abb. 7, Schritt 1 und Abb. 7, Schritt 2). Das Serum des Patienten wird dann mit dem Streifen inkubiert und alle vorhandenen HIV-Antikörper binden an die entsprechenden bekannten HIV-Antigene auf dem Streifen (Abb. 7, Schritt 3). Enzymgebundene Anti-Human-Gammaglobulin-(Anti-HGG)-Antikörper werden dann dem Streifen hinzugefügt. Diese Antikörper, die in einem anderen Tier gegen den Fc-Anteil menschlicher Antikörper durch Injektion von menschlichem Serum in das Tier hergestellt werden, weisen ein chemisch angelagertes Enzym auf. Sie reagieren mit den an die bekannten HIV-Antigene gebundenen humanen Antikörpern (Abb. 7, Schritt 4). Der Streifen wird dann gewaschen, um jegliches Anti-HGG zu entfernen, das nicht an Serumantikörper gebunden hat. EIN enzymspezifisches Substrat wird dann zugegeben und die resultierende Enzym-Substrat-Reaktion verursacht a Farbwechsel auf dem Streifen (Abb. 7, Schritt 5). Wenn im Serum des Patienten keine Antikörper gegen HIV vorhanden sind, kann sich das enzymgekoppelte Anti-HGG nicht daran binden und es wird vom Streifen gewaschen. Wenn das Substrat hinzugefügt wird, ist auf dem Streifen kein Enzym vorhanden, das zu einer Farbänderung führt.

Es sollte erwähnt werden, dass alle serologischen Tests in der Lage sind, gelegentliche falsch positive und falsch negative Ergebnisse. Die häufigste Ursache für einen falsch-negativen HIV-Antikörpertest ist, wenn eine Person wurde erst vor kurzem mit HIV infiziert und sein Körper hat noch nicht genügend Antikörper gebildet, um einen sichtbar positiven serologischen Test zu ergeben. Es dauert im Allgemeinen zwischen 2 Wochen und 3 Monaten, nachdem eine Person erstmalig mit HIV infiziert wurde, um auf einen positiven HIV-Antikörpertest umzustellen.

Eine Reihe von kommerziellen HIV-Schnelltests wurde auch zum Nachweis von Antikörpern gegen HIV verbessert. Sie beinhalten:

  • OraQuick Advance HIV1/2®: verwendet entweder eine Blutprobe aus der Fingerbeere oder eine orale Probe.
  • Uni-Gold Recombigen®: verwendet entweder eine Fingerbeere oder eine Vollblutprobe.
  • Reveal G2®: Verwendet Serum oder Plasma.
  • Multispot HIV-1/HIV-2®: Verwendet Serum oder Plasma.

Weitere Informationen zu HIV und AIDS finden Sie in den folgenden Lernobjekten in Ihrem Vorlesungsverzeichnis:

Medscape-Artikel über Infektionen im Zusammenhang mit Organismen/Krankheiten, die in dieser Laborübung erwähnt werden. Die Registrierung für den Zugriff auf diese Website ist kostenlos.

VERFAHREN FÜR DIREKTE SEROLOGISCHE TESTS ZUM NACHWEIS UNBEKANNTER ANTIGENE

A. Serologische Typisierung von Shigella

1. Zeichnen Sie mit einem Wachsmarker zwei Kreise (ungefähr so ​​groß wie ein Nickel) auf jedem von zwei sauberen Glasobjektträgern . Beschrifte die Kreise A, B, C und D.

2. Hinzufügen ein Tropfen des vermutlich Shigella(unbekanntes Antigen) zu jedem Kreis. (Die Shigella wurde mit Formalin behandelt, um es nicht infektiös, aber immer noch antigen zu machen.)

3. Jetzt hinzufügen ein Tropfen der bekannten Shigella-Untergruppe EIN Antiserum gegen den "A"-Kreis, ein Tropfen von bekannt Shigella Untergruppe B Antiserum gegen den "B"-Kreis, ein Tropfen von bekannt Shigella Untergruppe C Antiserum gegen den "C"-Kreis und ein Tropfen von bekannt Shigella Untergruppe D Antiserum zum "D"-Kreis.

4. Drehen die Folie vorsichtig für 30-60 Sekunden.

Agglutination der Bakterien, weist auf eine positive Reaktion hin.

Keine Agglutination ist negativ.

5. Entsorgen Sie alle Pipetten und Objektträger im Desinfektionsmittelbehälter.

B. Serologische Typisierung von Streptokokken: Die Clearview® Strep A Exact II Peilstab-Test

1. Hinzufügen 4 Tropfen Extraktionsreagenz #1 zum Absaugrohr. Dieses Reagenz enthält 2 M Natriumnitrit und sollte eine rosa bis violette Farbe haben.

2. Hinzufügen 4 Tropfen Extraktionsreagenz #2 zum Absaugrohr. Dieses Reagenz enthält 0,3 M Essigsäure. Die Lösung muss sich gelb verfärben.

3. Platzieren Sie die Rachenabstrich im Entnahmeröhrchen und rollen ihn mit kreisenden Bewegungen im Röhrchen. Mindestens stehen lassen 1 Minute.

4. Drücken Sie den Tupfer fest gegen das Extraktionsröhrchen, um so viel Flüssigkeit wie möglich aus dem Tupfer zu entfernen, und entsorgen Sie den Tupfer im Bioabfallbehälter.

5. Tauchen Sie den Teststreifen in das Extraktionsröhrchen wobei die Pfeile auf die extrahierte Probenlösung zeigen. Lassen Sie den Streifen im Röhrchen und beginnen Sie mit der Zeitmessung.

6. Ergebnisse in 5 Minuten lesen. Ein rotes Band im Kontrollbereich und ein rotes Band im Testbereich zeigen einen positiven Test an (Siehe Abb. 6C). Ein einzelnes rotes Band in der Kontrollregion zeigt nur einen negativen Test an (Siehe Abb. 6D). Keine farbige Bande im Kontrollbereich weist auf einen ungültigen Test hin.

C. Serologische Tests zum Nachweis einer Schwangerschaft: Der Alere hCG-Messstab ®

1. Tauchen Sie den hCG-Messstab in den Urin bis zur maximalen Linie auf dem Streifen für 5 Sekunden.

2. Legen Sie den Teststreifen auf eine ebene, nicht saugfähige Oberfläche und Lesen Sie die Ergebnisse nach 3-4 Minuten ab. Interpretieren Sie nicht nach der entsprechenden Lesezeit.

3. Wenn hCG in einer Konzentration von 25 ml U/ml oder höher im Urin vorhanden ist, a positiver Test, eine rosa-rote Testlinie erscheint zusammen mit einer roten Kontrolllinie im Ergebnisfenster (siehe Abb. 7B3). Wenn hCG fehlt oder in sehr niedrigen Konzentrationen vorhanden ist, ein negativer Test, nur eine rote Kontrolllinie erscheint im Ergebnisfenster (siehe Abb. 7B4).

D. Die Direktfluoreszenz-Antikörper-Technik

Beobachten Sie den Nachweis eines positiven direkten Fluoreszenz-Antikörpertests für Neisseria gonorrhoeae .

VERFAHREN FÜR INDIREKTE SEROLOGISCHE TESTS ZUM NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN IM PATIENTENSERUM

A. Der RPR®-Kartentest für Syphilis (Demonstration)

1. Beschriften Sie 6 Reagenzgläser wie folgt: 1:1, 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 und 1:32.

2. Mit einer 1,0 ml Pipette hinzufügen 0,5 ml 0,9% Kochsalzlösung in Rohre 1:2, 1:4, 1:8, 1:16 und 1:32.

3. Hinzufügen 0,5 ml des Patientenserums zum 1:1 Röhrchen (unverdünntes Serum).

4. Weiteres hinzufügen 0,5 ml Serum zur Kochsalzlösung im 1:2 röhrchen und mischen. Entfernen 0,5 ml aus dem 1:2-Röhrchen und füge es hinzu 1:4 röhrchen und mischen. Entfernen 0,5 ml aus dem 1:4 Röhrchen, ergänzen Sie die 1:8 röhrchen und mischen. Entfernen 0,5 ml aus dem 1:8 Röhrchen, ergänzen Sie die 1:16 röhrchen und mischen. Entfernen 0,5 ml aus der 1:16 Tube, ergänzen Sie die 1:32 röhrchen und mischen. Entfernen 0,5 ml aus dem 1:32 Röhrchen und verwerfen. Die Verdünnung des Serums ist in Abb. 8 zusammengefasst.

5. Mit den mit dem Kit gelieferten Kapillarpipetten ein Tropfen jeder Serumverdünnung Kreise der RPR-Karte zu trennen. Verteilen Sie das Serum mit der Pipettenspitze über die gesamte Innenfläche des Kreises, wobei Sie für jede Serumverdünnung eine neue Pipette verwenden.

6. Geben Sie mit dem RPR-Antigenspender ein Tropfen bekanntes RPR-Antigen zu jedem Kreis. Lassen Sie die Nadel des Spenders nicht das Serum berühren. Mischen Sie in jedem Kreis das bekannte RPR-Antigen mit Einwegrührern mit dem Serum.

7. Legen Sie den Objektträger auf einen Schüttler und maximal 4 Minuten drehen.

8. Lesen Sie die Ergebnisse wie folgt ab:

  • Ein deutliches Verklumpen der Holzkohlepartikel wird berichtet als reaktiv (R).
  • Es wird keine Verklumpung gemeldet als nicht reaktiv (N).

Die größte Serumverdünnung, die a reaktiv Ergebnis ist das Titer. Wenn die Verdünnungen beispielsweise wie folgt ausfallen, wird der Titer als 1:4 oder 4 dil angegeben.

B. Die serologischen Tests für infektiöse Mononukleose (Demonstration)

1. Platz je ein Tropfen des Patientenserums in Kreisen auf dem Testobjektträger.

2. Hinzufügen ein Tropfen der behandelten Latexpartikel, die Paul-Bunnell-Antigene auf ihrer Oberfläche enthalten (das bekannte Antigen) in jeden Kreis geben und mit Einweg-Applikatorstäbchen mischen.

3. Rock die Karte sanft für 3 Minutenund beobachte auf Agglutination der Latexpartikel. Agglutination zeigt das Vorhandensein von heterophile Antikörper (siehe Abb. 2).

C. Die serologischen Tests für systemischen Lupus erythematodes (SLE) (Demonstration)

1. Hinzufügen je ein Tropfen des Patientenserums Kreise auf dem Testobjektträger zu trennen.

2. Hinzufügen ein Tropfen Latex-Desoxyribonukleoprotein-Reagenz (das bekannte Antigen, an Latexpartikel adsorbiertes Desoxyribonukleoprotein) zu jeder Serumprobe geben und mit Einweg-Applikatorstäbchen mischen.

3. Schaukel die Rutsche sanft für 3 Minuten und suchen Sie nach einer Agglutination der Latexpartikel. Agglutination zeigt das Vorhandensein von antinukleäre Antikörper mit SLE verbunden (siehe Abb. 3).

D. Der FTA-ABS-Test für Syphilis (Indirect Fluorescent Antibody Technique .)

Beobachten Sie den 35-mm-Objektträger eines positiven FTA-ABS-Tests (siehe Abb. 5).

E. Die EIA- und WB-Tests für HIV-Antikörper

Beachten Sie die Abbildungen der EIA- und WB-Tests auf Antikörper gegen HIV.

ERGEBNISSE FÜR DIREKTE SEROLOGISCHE TESTS ZUM NACHWEIS UNBEKANNTER ANTIGENE

A. Serologische Typisierung von Shigella

Machen Sie eine Zeichnung von Ihren Ergebnissen.

B. Serologische Typisierung von Streptokokken: Clearview® Strep A Exact II Messstab

Machen Sie eine Zeichnung von Ihren Ergebnissen.

C. Serologische Tests zur Diagnose einer Schwangerschaft: Alere® hCG Messstab

Zeichnen Sie einen positiven Schwangerschaftstest.

D. Die Direktfluoreszenz-Antikörper-Technik

Mache eine Zeichnung und beschreibe einen positiven direkten fluoreszierenden Antikörpertest.

ERGEBNISSE FÜR INDIREKTE SEROLOGISCHE TESTS ZUM NACHWEIS VON ANTIKÖRPERN IM PATIENTENSERUM

A. RPR Card®-Test auf Syphilis (quantitativ)

Erkennt nicht-treponemale Antilipid-Antikörper (Reagin)

Tragen Sie Ihre Ergebnisse in die Tabelle ein.

R = reaktiv (deutliche Klumpen)
N = nicht reaktiv (keine Klumpen)

B. MONO-TEST auf infektiöse Mononukleose (qualitativ)

Erkennt heterophile Antikörper.

Zeichnen Sie die Ergebnisse eines positiven und eines negativen Tests.

Testobjektträger für infektiöse Mononukleose
+ = Agglutination von Latexpartikeln
- = Keine Verklumpung von Latexpartikeln

C. Serologischer Test auf SLE (qualitativ)

Erkennt Anti-Desoxyribonukleoprotein-Antikörper.

Zeichnen Sie die Ergebnisse eines positiven und eines negativen Tests.

SLE-Testfolie
+ = Agglutination
- = Keine Agglutination

D. FTA-ABS-Test auf Syphilis (Bestätigung)

Erkennt Antikörper gegen Treponema pallidum

Zeichnen Sie die Ergebnisse eines positiven FTA-ABS-Tests.


Validierung eines SARS-CoV-2 Spike Protein ELISA für den Einsatz in Kontaktuntersuchungen und Sero-Überwachung

Seit dem Aufkommen von SARS-CoV-2 Ende 2019 besteht ein entscheidender Bedarf, die Prävalenz und die Übertragungsmuster zu verstehen, um die Krankheitslast und die Sterblichkeitsrate zu berechnen. Die Molekulardiagnostik, der Goldstandard zur Erkennung von Viruserkrankungen, ist nicht ideal, um die tatsächlichen Fallzahlen und die Rate asymptomatischer Infektionen zu bestimmen. Der serologische Nachweis von SARS-CoV-2-spezifischen Antikörpern kann dazu beitragen, diese Wissenslücken zu schließen. In dieser Studie beschreiben wir die Optimierung und Validierung eines SARS-CoV-2-spezifischen Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) unter Verwendung der präfusionsstabilisierten Form des Spike-Proteins [1]. Wir führten Receiver Operator Characteristic (ROC)-Analysen durch, um die Spezifitäten und Sensitivitäten des optimierten Assays zu definieren, und untersuchten die Kreuzreaktivität mit Immunseren von Personen, bei denen eine Infektion mit anderen Coronaviren bestätigt wurde. Diese Assays werden verwendet, um Kontaktuntersuchungen durchzuführen und eine groß angelegte Querschnittsüberwachung durchzuführen, um die Krankheitslast in der Bevölkerung zu definieren.


Schneller quantitativer Screening-Assay für neutralisierende SARS-CoV-2-Antikörper mit HiBiT-markierten virusähnlichen Partikeln

Kei Miyakawa, Sundararaj Stanleyraj Jeremiah, Norihisa Ohtake, Satoko Matsunaga, Yutaro Yamaoka, Mayuko Nishi, Takeshi Morita, Ryo Saji, Mototsugu Nishii, Hirokazu Kimura, Hideki Hasegawa, Ichiro Takeuchi, Akihide Ryo, Rapid quantitativer Screening-Assay für SARS-Co-2 neutralisierende Antikörper mit HiBiT-markierten virusähnlichen Partikeln, Zeitschrift für Molekulare Zellbiologie, Band 12, Ausgabe 12, Dezember 2020, Seiten 987–990, https://doi.org/10.1093/jmcb/mjaa047

Aufgrund des Fehlens einer konkreten Gegenmaßnahme konnte die sich ständig ausbreitende COVID-19-Pandemie nur teilweise und vorübergehend durch regionale Sperren verlangsamt werden, die die Menschen dazu zwingen, zu Hause zu bleiben und ihre Bewegung zu verhindern. Mit dem Fortschreiten der Pandemie hätte ein beträchtlicher Teil der Bevölkerung eine Immunität nach der Infektion erworben, und die Tests, die den Immunstatus nach der Infektion von Einzelpersonen aufdecken, sind das Gebot der Stunde. Ein glaubwürdiger Test, der den Geschützten genau identifiziert, kann einen Immunitätspass bieten, damit die Person aus der Sperrung befreit und Routinetätigkeiten wiederaufnehmen kann, ohne befürchten zu müssen, sich anzustecken. Derzeit stehen hierfür nur der semiquantitative Neutralisationstest (NT) und der quantitative Plaque-Reduktions-Neutralisationstest (PRNT) zum Nachweis von neutralisierenden Anti-SARS-CoV-2-Antikörpern (nAbs) zur Verfügung. Die praktische Durchführbarkeit dieser hochspezifischen Tests wird jedoch durch Nachteile wie geringer Durchsatz, lange Durchlaufzeiten (TAT) und die Notwendigkeit eines speziellen Laboraufbaus mit Einrichtungen der Biosicherheitsstufe 3 (BSL3) für den Umgang mit den in diesen verwendeten lebenden Viren belastet Tests (Cao et al., 2020).

Um diese Hürden zu überwinden, werden pseudovirusbasierte NT (Nie et al., 2020), Surrogat-Serodiagnostik-Tests (sVNT) (Tan et al., 2020) und Einzelzell-RNA-Sequenzierung (Cao et al., 2020) untersucht . Ein einfacher, bequemer, schneller und Hochdurchsatztest, der nAbs mit hoher Spezifität direkt nachweisen kann und als ideale Alternative zum Neutralisationsassay fungieren könnte, muss jedoch noch entwickelt werden (Ozcurumez et al., 2020). Virusähnliche Partikel (VLPs) sind selbstorganisierende, nicht replizierende, nicht pathogene Einheiten mit ähnlicher Größe und Konformation wie infektiöse Virionen. VLPs können erzeugt werden, um die Oberflächenproteine ​​jeder Art von Viren auf ihrer Membran ohne die viralen Nukleinsäuren zu besitzen. Diese genomfreie Eigenschaft von VLPs überschreibt die Notwendigkeit von BSL3-Einrichtungen während der Handhabung, hat jedoch den Nachteil, dass es schwierig ist, den Zelleintritt und die Membranfusion zu quantifizieren.

HiBiT ist ein 11-Aminosäuren-Peptid-Tag, das an jedes interessierende Protein angehängt werden kann. LgBiT, das Gegenstück der NanoLuc-Luciferase, ist komplementär zu HiBiT und bindet an letzteres, um ein hochaktives Luciferase-Enzym zu produzieren. HiBiT-markierte Proteine ​​können mithilfe des Nano-Glo-Assay-Systems basierend auf Biolumineszenz leicht nachgewiesen und quantifiziert werden. Die HiBiT-Technologie bietet die Vorteile einer hohen Sensitivität, der Bequemlichkeit eines einzigen Reagenz-Additionsschritts und einer kurzen TAT von nur wenigen Minuten. In diesem Bericht haben wir einen HiBiT-VLP-basierten Neutralisationstest (hiVNT) entwickelt, der SARS-CoV-2-nAbs leicht nachweisen kann ( Abbildung 1A).

Schneller quantitativer Assay für SARS-CoV-2-nAbs. (EIN) Schematische Darstellung des hiVLP-SARS2-basierten Neutralisationstests (hiVNT). (B) Nachweis des Zelleintritts von hiVLP-SARS2. VeroE6/TMPRSS2-LgBiT-Zellen wurden mit hiVLP-SARS2 für 3 h inokuliert, danach wurde die intrazelluläre NanoLuc-Lumineszenz gemessen. Die Expression von HaloTag-fusioniertem LgBiT in Zielzellen wurde durch Immunblotting-Analyse bestätigt. ****P < 0,0001. (C) NanoLuc-Lumineszenz von Zellen, die mit hiVLP-SARS2 bei jedem gesunden Spender (HD, n = 37) oder rekonvaleszente COVID-19-Patientenseren (n = 74) für 3 h. ****P < 0,0001. (D) hiVNT stimmt mit dem NT überein, das authentisches SARS-CoV-2 verwendet. Daten von gesunden Spendern und zwei repräsentativen Patienten werden mit NT-Titer (NT50) gezeigt. (E) Korrelation zwischen serologischem Test und Neutralisationsaktivität von rekonvaleszentem COVID-19-Patientenserum. n = 74 Proben. NP, Nukleokapsidprotein SP, Spike-Protein.

Schneller quantitativer Assay für SARS-CoV-2-nAbs. (EIN) Schematische Darstellung des hiVLP-SARS2-basierten Neutralisationstests (hiVNT). (B) Nachweis des Zelleintritts von hiVLP-SARS2. VeroE6/TMPRSS2-LgBiT-Zellen wurden mit hiVLP-SARS2 für 3 h inokuliert, danach wurde die intrazelluläre NanoLuc-Lumineszenz gemessen. Die Expression von HaloTag-fusioniertem LgBiT in Zielzellen wurde durch Immunblotting-Analyse bestätigt. ****P < 0,0001. (C) NanoLuc-Lumineszenz von Zellen, die mit hiVLP-SARS2 bei jedem gesunden Spender (HD, n = 37) oder rekonvaleszente COVID-19-Patientenseren (n = 74) für 3 h. ****P < 0,0001. (D) hiVNT stimmt mit dem NT überein, das authentisches SARS-CoV-2 verwendet.Daten von gesunden Spendern und zwei repräsentativen Patienten werden mit NT-Titer (NT50) gezeigt. (E) Korrelation zwischen serologischem Test und Neutralisationsaktivität von rekonvaleszentem COVID-19-Patientenserum. n = 74 Proben. NP, Nukleokapsidprotein SP, Spike-Protein.

Um hiVNT zu etablieren, fügten wir den HiBiT-Tag in das HIV-1-Gag-Pol-Protein ein, eine minimale Untereinheit zur Herstellung von VLPs. Nach dem Testen mehrerer Prototypen stellten wir fest, dass die HiBiT-Tag-Insertion in der C-terminalen Region des Kapsid-Gens in Gag-Pol am besten funktionierte (Ergänzende Abbildung S1A). HiBiT-Tag kann mit hoher Affinität an seine komplementäre größere Untereinheit LgBiT binden und Luciferase (NanoLuc) bilden (Sasaki et al., 2018). Wie erwartet, könnten HiBiT-haltige VLPs (im Folgenden als hiVLP-SARS2 bezeichnet) bei Zugabe von rekombinantem LgBiT und Furimazin-Substrat Licht emittieren. Da das Kapsidantigen das HiBiT-Tag trug, korrelierte die Lumineszenzintensität mit der Menge an Kapsidantigen (Ergänzende Abbildung S1B). Durch Co-Transfektion von Gag-Pol-HiBiT- und SARS-CoV-2-Spike-Expressionsvektoren erzeugten wir hiVLP-SARS2 und bestätigten ihre Expression in Zell- und Viruslysaten (Ergänzende Abbildung S1C).

Da SARS-CoV-2 VeroE6/TMPRSS2-Zellen mit hoher Effizienz infizieren kann (Matsuyama et al., 2020), generierten wir als nächstes LgBiT-exprimierende VeroE6/TMPRSS2-Zellen. Wir stellten einen starken Anstieg der NanoLuc-Aktivität fest, als die LgBiT-exprimierenden VeroE6/TMPRSS2-Zellen 3 h mit hiVLP-SARS2 behandelt wurden (Abbildung 1B, ergänzende Abbildung S1D). Wir zeigten ferner den Abfall der Lumineszenzsignale nach Vorbehandlung mit einem TMPRSS2-Inhibitor (Camostat-Mesylat) und auch mit einem neutralisierenden monoklonalen Anti-Spike-Antikörper (Ergänzende Abbildung S1E). Wir beobachteten keine Verringerung der Lumineszenzsignale von hiVLP, das eine VSVg-Hülle trägt (Ergänzende Abbildung S1E), was darauf hindeutet, dass hiVLP-SARS2 durch die Wechselwirkungen zwischen viralen Spikes und zellulären Rezeptoren auf ähnliche Weise wie bei authentischem SARS-CoV . in die Zielzellen eindringt -2.

Als nächstes testeten wir, ob unser neu entwickeltes hiVLP-SARS2-System nAbs im Serum von COVID-19-Patienten nachweisen kann. Der Neutralisationsassay wurde gemäß den folgenden Schritten durchgeführt. VeroE6/TMPRSS2-LgBiT-Zellen wurden 1 Tag vor der Inokulation auf weiße Polystyrolplatten mit 96 Vertiefungen mit einer Dichte von 10 4 Zellen/Vertiefung ausgesät. Dekomplementierte Seren von rekonvaleszenten COVID-19-Patienten wurden mit hiVLP-SARS2 gemischt und die Mischung wurde auf VeroE6/TMPRSS2-LgBiT-Zellen geimpft. Drei Stunden später wurden die Zellen mit PBS gewaschen und auf ihre NanoLuc-Lumineszenz gemessen. Wir fanden heraus, dass alle Seren der getesteten Patienten den Eintritt von hiVLP-SARS2 in unterschiedlichem Ausmaß blockieren konnten (Abbildung 1C), was auf das Vorhandensein von nAbs gegen SARS-CoV-2 hindeutet. Zwei Rekonvaleszenzseren und ein gesundes Spenderserum wurden mit hiVNT und authentischem SARS-CoV-2 NT getestet, nur um zu zeigen, dass alle Proben in beiden Tests ähnliche Ergebnisse lieferten (Abbildung 1D), was darauf hindeutet, dass die hiVNT-Leistung mit der NT unter Verwendung von authentischen übereinstimmt SARS-CoV-2. Da der Nachweis von Ersatzantikörpern als Alternative zu NT weithin untersucht wird, wollten wir die Korrelation der von hiVNT nachgewiesenen nAbs mit den durch ELISA nachgewiesenen Antikörpertitern überprüfen. Wir haben die Ergebnisse von hiVNT mit den durch ELISA nachgewiesenen Antikörpertitern in 74 COVID-19-positiven Seren abgeglichen. Es wurde festgestellt, dass die nAb-Spiegel mit IgG-Antikörpern korrelieren, jedoch nicht mit IgM-Antikörpern, sowohl gegen das Nukleokapsid- als auch gegen das Spike-Protein ( 1E ). Zusammenfassend könnte unser neuartiges hiVNT für den schnellen Nachweis von nAbs in den Seren von Personen nützlich sein, die von COVID-19 genesen sind.

Das hiVNT-Assay-Prinzip ähnelt herkömmlichen Neutralisationsassays und basiert auf viralem Eintritt und Membranfusion mit Messung der NanoLuc-Luciferase-Aktivität, um das Ergebnis zu vereinfachen. Angesichts der Nachteile von NT und PRNT sind Tests, die Einzelpersonen einen Immunitätspass verleihen können, das Gebot der Stunde, und zu diesem Zweck werden verschiedene Plattformen genutzt, obwohl detailliertere serologische Studien erforderlich sind. Pseudovirus-basierte NTs sind die beliebten Alternativen zum Nachweis von nAbs, da sie die Notwendigkeit einer BSL3-Einrichtung überwinden und einen hohen Durchsatz aufweisen (Muruato et al., 2020). Diese Tests verwenden Pseudoviren, die eine Hülle mit SARS-CoV-2-Spike-Proteinen besitzen und auch ein Reportergen in ihr Genom einbauen. Der Test hängt von der Expression des Reportergens in den mit Pseudovirus infizierten Zielzellen ab, deren Nachweis 24–48 h dauert. Im Vergleich dazu beinhaltet unser hiVNT keine Genexpression und verkürzt somit die TAT auf nur 3 h. Die Einzelzellsequenzierung könnte ähnliche Vorteile haben (Cao et al., 2020), aber der Bedarf an spezialisierter und teurer Ausrüstung behindert ihre praktische Anwendung.

Die Messung antiviraler Antikörper im Serum von rekonvaleszenten COVID-19-Patienten wird auf ihr Potenzial untersucht, als Surrogatmarker zu fungieren, um das Vorhandensein von SARS-CoV-2-nAbs widerzuspiegeln (Tan et al., 2020). Unsere Ergebnisse in einer kleinen Stichprobengröße (n = 74) zeigen, dass IgG als besserer Surrogatmarker als IgM dienen könnte. Die Verwendung von Serodiagnostika für den nAb-Nachweis könnte jedoch einige inhärente Nachteile haben. Obwohl alle COVID-19-Infektionen eine humorale Immunantwort auslösen, spiegelt das Vorhandensein von Antikörpern nicht die Immunität wider. Außerdem lösen leichte COVID-19-Infektionen eine sehr geringe humorale Reaktion aus, die durch serologische Tests möglicherweise nicht nachgewiesen werden kann (Ozcurumez et al., 2020). In dieser Einstellung können Ersatzantikörpernachweistests zu falschen Ergebnissen führen. Darüber hinaus infiziert SARS-CoV-2 Wirtszellen über die Rezeptorbindungsdomäne (RBD) innerhalb der S1-Untereinheit im Spike-Protein auf der Oberfläche von Viruspartikeln, die an den Angiotensin-konvertierenden Enzym-2-Rezeptor der Wirtsoberfläche binden. ELISA-Kits zum Nachweis von Anti-RBD-Antikörpern in vitro erzeugtes Spike-Protein und seine Derivate, um nAbs im Serum nachzuweisen. Da Spike-Proteine ​​jedoch einer Glykosylierung und Oligomerisierung unterliegen in vivo (Xiao et al., 2004 Walls et al., 2020), die Leistung von in vitro erzeugte Spike-Proteine ​​können je nach Herstellungsverfahren sowie ihrer klinischen Bedeutung variieren. Es können auch nAbs existieren, die auf andere Regionen des Spike-Proteins abzielen, um die Funktion des Fusionspeptids der S2-Untereinheit zu unterdrücken, die beim S1- und RBD-basierten ELISA-Nachweis unentdeckt bleiben könnten (Chi et al., 2020).

In dieser Studie haben wir das hiVNT etabliert, ein einfaches Hochdurchsatz-Assay-System zur quantitativen und schnellen Bestimmung von SARS-CoV-2-nAbs in den Seren von Personen nach der Genesung von symptomatischem oder subklinischem COVID-19. Das hiVNT-System ermöglicht BSL2-konforme Tests und liefert quantitative Ergebnisse bei ultrahohem Durchsatz. Es wurde gezeigt, dass der Luciferase-Fragment-Komplementierungsassay eine überlegene Sensitivität mit Spielraum für eine weitere Miniaturisierung in das 384- oder 1536-Well-Plattenformat aufweist. Basierend auf unseren Ergebnissen glauben wir, dass hiVNT durch den Einsatz der NanoLuc-Technologie dazu beitragen kann, Personen mit schützender Immunität zu identifizieren, epidemiologische Studien zur Anfälligkeit der Bevölkerung durchzuführen, die Virusausbreitung zu modellieren und Rekonvaleszenzplasma für die Therapie und Impfstoffbewertung zu bewerten. Erfreulicherweise kann all dies auf einer Hochdurchsatzplattform mit kurzer TAT und in einer niedrigeren biologischen Sicherheitseinstellung erreicht werden.


PCR und serologische Assays zum Nachweis einer Toxoplasma gondii-Infektion bei Sportpferden in Kairo, Ägypten

Insgesamt 240 Serumproben von Pferden unterschiedlichen Alters, Rassen, Geschlechts und Fortpflanzungsbedingungen, die für Sportzwecke verwendet wurden und sich auf den wichtigsten Pferdefarmen in Kairo, Ägypten, befanden, wurden auf Toxoplasma gondii-Infektion getestet. PCR und serologische Assays zeigten, dass die PCR die höhere Prävalenz von Toxoplasmose (53,8%) zeigte, gefolgt von LAT (52,1%), MAT (50,8%) und der niedrigsten Prävalenz von ELISA (39,2%). Die Prävalenz der T. gondii-Infektion in Bezug auf Rasse, Geschlecht und Fortpflanzungszustand wurde bestimmt. Die Prävalenz war höher (73,1%) bei importierten Rassen, gefolgt von einheimischen (58,5%) und am niedrigsten bei arabischen Rassen (44,4%). Eine höhere Prävalenz (60,8%) wurde bei den Weibchen festgestellt, die mit 10,8, 12,4 bzw. 29,9% bei Stuten, trächtigen und wiederholten Züchtern vertreten waren. Auf der anderen Seite wurde eine geringere Prävalenz (23,9 %) bei den Rüden festgestellt, die mit 0, 8,7 bzw. 15,2 % bei Hengstfohlen, Hengsten und Rennläufern vertreten waren. Beim Vergleich der Daten der serologischen Tests mit denen der PCR als Referenztest für Toxoplasmose hatte MAT die höchste Sensitivität (93,8%), gefolgt von LAT (91,5%) und die geringste Sensitivität im ELISA (71,3%). Auf der anderen Seite hatte ELISA die höchste Spezifität (92,8%), gefolgt von MAT (91,9%) und die niedrigste Spezifität war von LAT (88,3%). Die vorliegende Studie ist das erste Mal, dass die PCR und die serologische Untersuchung von T. gondii-Antikörpern bei Sportpferden in Ägypten angewendet werden und legt nahe, dass MAT allein oder mit LAT als hochempfindlicher Screening-Test verwendet werden kann, gefolgt von PCR als spezifischer Bestätigungstest für die Diagnose von Toxoplasmose bei Pferden. Auch die beobachtete hohe Prävalenz weist darauf hin, dass das Ansteckungsrisiko von Pferden auf Menschen oder andere Tiere sehr hoch ist.

R. M. Shaapan, Amal M. Abo-ElMaaty, K.A. Abd El-Razik und S.M. Abd El-Hafez, 2012. PCR und serologische Assays zum Nachweis einer Toxoplasma-Gondii-Infektion bei Sportpferden in Kairo, Ägypten. Asian Journal of Animal and Veterinary Advances, 7: 158-165.

Alle Wirte, einschließlich des Menschen, können mit einer der drei Formen des Parasiten Toxoplasma gondii infiziert werden, die drei morphologischen Stadien entsprechen: Tachyzoit-, Bradyzoit- und Sporozoit-Form. Feliden sind Endwirte für T. gondii, ein intrazelluläres Pathogen, das eine Vielzahl warmblütiger Zwischenwirte infiziert. Toxoplasmose ist eine Krankheit, bei der die Interessen der verschiedenen medizinischen und veterinärmedizinischen Fachrichtungen zusammentreffen (Cenci-Goga et al., 2011). Eine T. gondii-Infektion verursacht keine ernsthaften Erkrankungen, ist jedoch bei trächtigen Frauen und weiblichen Tieren eine häufige Ursache für Abtreibung, Blindheit, Megallozephalie und geistige Behinderung bei Kindern. Während tierische Föten mumifiziert, mazeriert und tot geboren wurden oder schwach geboren werden und innerhalb von Wochen nach der Geburt sterben, und auch der Parasit, trat bei Patienten mit erworbenem Immunschwächesyndrom als Haupttodesursache auf (Innes, 2010).

Obwohl lebensfähiges T. gondii aus Pferden isoliert wurde, die im Zoo-Schlachthof geschlachtet wurden, wird Pferdefleisch in Ägypten nicht für den menschlichen Verzehr verwendet (Shaapan und Ghazy, 2007) und die T. gondii-Zysten wurden in essbarem Gewebe von Pferden nachgewiesen (Al -Khalidi und Dubey, 1979). Die Rolle von Pferden als Quelle der T. gondii-Infektion hängt von den regionalen Präferenzen für Pferdefleisch, der Zubereitungsmethode und der Seroprävalenz von Pferden ab, die in Ländern wie Belgien, Italien, Frankreich und Japan roh oder ungekocht verzehrt werden (Gill, 2005) .

In einigen Ländern wurden nur wenige Daten über die Prävalenz einer T. gondii-Infektion bei Sportpferden berichtet, die Prävalenz betrug 28 % bei für sportliche Zwecke in der Provinz Ankara gezüchteten türkischen Pferden unter Verwendung des Sabin-Feldman-Farbtests (DT) (Guclu et al ., 2007), 71,2% im Iran mit MAT (Hajialilo et al., 2010) und 43,7 % bei Pferden für sportliche Zwecke in der Provinz Riad, Saudi-Arabien mit DT (Alanazi und Alyousif, 2011).

Die Prävalenzdaten zur Bestimmung einer T. gondii-Infektion bei Pferden in den verschiedenen Lokalitäten der Welt sind äußerst variabel und basieren hauptsächlich auf unterschiedlichen serologischen Tests. Die Prävalenz betrug 97,1 % in Argentinien unter Verwendung des indirekten Häm-Agglutinationstests (IHAT) (Mayer et al., 1987), 1 % bei schwedischen Pferden unter Verwendung von ELISA (Uggla et al., 1990), 6,9 % in Nordamerika unter Verwendung von MAT (Dubey et al., 1999), 23% in der Tschechischen Republik mit LAT (Bartova et al., 2010) und 34% in Costa Rica mit ELISA (Dangoudoubiyam et al., 2011).

In Ägypten gibt es, obwohl keine Daten zur T. gondii-Prävalenz bei Sportpferden vorliegen, wenig bekannte Untersuchungen zur Prävalenz der Infektion bei Equiden. Bei Pferden wurden die T. gondii-Antikörper bei 38,1 bzw. 48,1 % unter Verwendung von ELISA bzw. MAT gefunden (Ghazy et al., 2007), während Haridy et al. (2009) berichteten, dass die ELISA-T. gondii-Antikörper insgesamt 25 % der Pferde im Großraum Kairo betrugen, 50 (Weibchen) und 22,2 % (Männer). Bei Eseln betrug die Infektionsrate mit ELISA (El-Ghaysh, 1998) 65,6%, und kürzlich haben Shaapan und Khalil (2008) festgestellt, dass die Prävalenz von T. gondii-Antikörpern bei Eseln bei Verwendung der verschiedenen T. gondii zwischen 36 und 52% lag Isolate als Antigene von MAT.

Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Prävalenz der T. gondii-Infektion bei Sportpferden auf einigen Farmen in Kairo mittels PCR und serologischen Assays (LAT, MAT und ELISA) zu untersuchen. Es wurde die Infektionsprävalenz in Bezug auf Rasse, Geschlecht und Reproduktionsstatus untersucht. Darüber hinaus wurden Sensitivität, Spezifität, Vor- und Nachteile jedes Tests bestimmt.

Blut- und Serumproben: Insgesamt 240 Blutproben wurden durch Venenpunktion von Sportpferden auf einigen Pferdefarmen in Kairo, Ägypten, entnommen. Daten zu diesen Tieren (Alter, Geschlecht, Rasse, Rasse und Fortpflanzungsbedingungen) wurden ebenfalls gesammelt. Die Seren wurden getrennt, markiert und bei –20°C gelagert, bis sie für serologische und PCR-Tests verwendet wurden.

Stämme von T. gondii
T. gondii RH-Stamm: Der für die PCR verwendete virulente RH-Stamm von T. gondii wurde aus einer Kolonie erhalten, die im Department of Zoonoses, National Research Center, gehalten wurde.

Lokaler isolierter T. gondii-Stamm: Der lokale T. gondii-Stamm, der für die Antigenpräparation verwendet wurde, wurde erfolgreich von Shaapan und Ghazy (2007) nach vielen Bioassays des mutmaßlich infizierten Pferdegewebes bei Katzen und Mäusen gemäß den von Sharma und Dubey . beschriebenen Verfahren erhalten (1981) und Dubey (2010), um die Infektionsstadien von T. gondii zu isolieren.

Erhaltung von T. gondii-Stämmen: Das RH- und equine T. gondii-Isolat wurde im Labor durch serielle Passage in Mäusen gemäß den Verfahren von Johnson et al. (1979).

Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
DNA-Extraktion: Genomische DNA wurde aus dem Stamm T. gondii RH (Positivkontrolle) unter Verwendung eines im Handel erhältlichen Kits (Dneasy Blood and Tissue Kit, Qiagen Co., Kat.-Nr. 69504) mit den folgenden Modifikationen der Herstellerprotokolle extrahiert: (1) Tachyzoites wurde zuerst in 300 &mgr;956 l ATL-Puffer (im gleichen Kit enthalten) suspendiert. (2) Lysierte Tachyzoitensuspensionen wurden dann mit 20 μL Proteinase K für 3 h bei 56°C inkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit 300 μL ATL-Puffer bei 70°C für 10 min mit Vortexen für 10 s alle 3 min. DNA wurde durch die Säulen gemäß dem Protokoll des Herstellers gereinigt und in 50 μL des mitgelieferten AE-Puffers eluiert und dann bei –20°C gelagert. Die Blutproben wurden in Teströhrchen mit Heparin als Antikoagulans gesammelt und dann mit demselben Kit unter Verwendung des vom Hersteller empfohlenen Blutprotokolls vor dem Test durch PCR verdaut.

PCR-Amplifikation: Für die PCR verwendete Primer zielten auf das repetitive 35-fache B1-Gen (Burg et al., 1989). Die äußeren Primer wurden nur in dieser Studie verwendet. Die Reaktionen wurden auf ein Endvolumen von 25 μL mit 2 μL DNA-Probe (Standardkontrollen) oder 5 μL Blutproben-DNA, 1 μL jedes Primers (100 pmol) und 12,5 & #956L Pyro-Start™ Fast PCR Master Mix (Fermentas Co., Kat. Nr. Ko211). Die PCR wurde in einem PTC-100 Peltier Thermal Cycler (MJ Research, Incline Village, USA) durchgeführt. Der erste Zyklus umfasste 1 Minute Denaturierung bei 95°C. Auf diesen ersten Schritt folgten 39 Zyklen von 2 Sekunden Denaturierung bei 94 °C, 5 Sekunden Annealing bei 48 °C und 25 Sekunden Primerverlängerung bei 72 °C und ein letzter Verlängerungsschritt bei 72 °C für 10 min. Ein 10 μL-Aliquot des amplifizierten Produkts wurde auf 1% Agarosegel analysiert und mit Ethidiumbromid gefärbt. Jeder PCR-Lauf umfasste positive und negative Kontrollen.

Serologische Tests zum Nachweis von T. gondii-Antikörpern: Die gesammelten Seren wurden mit folgenden 3 serologischen Tests serologisch auf den Nachweis von T. gondii-Antikörpern untersucht:

Latex-Agglutinationstest (LAT): Das Antigen, das durch Sensibilisierung von Latexpartikeln mit beschallten T. gondii-Tachyzoiten gemäß den Verfahren von Lunde und Jacobs (1967) hergestellt wurde. Der Latex-Agglutinationstest wurde als Verfahren von Holliman et al. (1989) unter Verwendung negativer und positiver Referenzserumproben und Reaktionen wurden durchgeführt, indem ein Tropfen Latexlösung zu einem Tropfen Serum auf einem Mikroskop-Objektträger gegeben und durch seitliche Bewegung des Objektträgers gemischt wurde. Die Agglutination tritt in positiven Fällen innerhalb von 2-3 Minuten auf
Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA): Das Tachyzoiten-Antigen, hergestellt nach dem von Waltman et al. (1984), kurz gesagt, wurden Tachyzoiten wiederholt eingefroren und aufgetaut, beschallt und bei 12.000 U/min 45 min lang bei 4°C zentrifugiert. Die Überstände wurden getrennt gesammelt und ihr Proteingehalt wurde nach dem Verfahren von Lowry et al. (1951). Die optimalen Antigen-, Serum- und Konjugatkonzentrationen wurden durch Schachbrett-Titration und Testverfahren bestimmt, die gemäß dem von Lind et al. (1997)
Modifizierter Agglutinationstest (MAT): Die formalisierten abgetöteten ganzen Tachyzoiten von T. gondii (pferdeartigen Ursprungs) wurden nach dem von Desmonts und Remington (1980) beschriebenen Verfahren hergestellt. Die Verfahren wurden nach der von Dubey und Desmonts (1987) beschriebenen Methode in einer Verdünnung von 1:25 durchgeführt

Statistische Auswertung: Die Daten der verschiedenen serologischen Tests wurden statistisch ausgewertet. Die Sensitivität und Spezifität jedes Tests wurden durch Vergleich seiner Ergebnisse mit denen der PCR als Referenztest gemäß dem von Waltman et al. (1984) und Dubey et al. (1995).

Prävalenz der T. gondii-Infektion bei Sportpferden mittels PCR und serologischen Assays: Die Untersuchung der 240 Serumproben von Sportpferden mittels PCR, LAT, MAT und ELISA ergab, dass 129 (53,8%), 125 (52,1%), 122 (50,8%) ) bzw. 94 (39,2%) waren positive Reaktoren mit T. gondii, was gleichzeitig als Prozentsatz der Infektion angesehen wurde (Tabelle 1, Abb. 1).

Prävalenz von T. gondii in Bezug auf Rasse, Geschlecht und Fortpflanzungszustand: Importierte Zuchtpferde zeigten eine hohe Prävalenz (73,1%), gefolgt von (58,5%) bei einheimischen Rassen, während arabische Rassen die geringste Prävalenz (44,4 %) aufwiesen. Die Prävalenz war höher (60,8%) bei den Hündinnen, vertreten mit 10,8, 12,4 bzw. 29,9% bei Stuten, trächtigen bzw. Wiederholungszüchtern. Auf der anderen Seite niedrigere Prävalenz bei Rüden (23,9%) mit 0, 8,7 und 15,2, bei Hengstfohlen, Hengsten bzw. Rennläufern (Abb. 2).

Vergleich zwischen PCR und serologischen Tests: Die Sensitivität und Spezifität der serologischen LAT-, MAT- und ELISA-Tests wurde durch den Vergleich ihrer Ergebnisse mit denen des PCR-Tests berechnet und ergab, dass MAT die höchste Sensitivität (93,8%) hatte, gefolgt von LAT (91,5%) und die niedrigste Sensitivität im ELISA (71,3%).

Auf der anderen Seite hatte ELISA die höchste Spezifität (92,8%), gefolgt von MAT (91,9%) und die niedrigste Spezifität war von LAT (88,3%) (Tabelle 2).

In der vorliegenden Arbeit war die Prävalenz der T. gondii-Infektion bei Sportpferden höher bei PCR (53,8%), gefolgt von LAT (52,1%), MAT (50,8%). von Toxoplasmose bei Pferden (48,1, 43,7 und 34%) wurden von Ghazy et al. (2007) bei Zuchtpferden in Ägypten, Alanazi und Alyousif (2011) bei Pferden für Sportzwecke in der Provinz Riad, Saudi-Arabien und Dangoudoubiyam et al. (2011) in Costa Rica, während niedrigere Inzidenzraten (1, 6,9 und 23 %) von Uggla et al. (1990) bei schwedischen Pferden, Dubey et al. (1999) in Nordamerika und Bartova et al. (2010) in der Tschechischen Republik. Höhere Inzidenzraten (97,1, 65,6 und 71,2%) wurden jedoch von Mayer et al. (1987) in Argentinien, El-Ghaysh (1998) in Ägypten und Hajialilo et al. (2010) im Iran.

Der Unterschied zwischen den Ergebnissen der PCR und serologischen Tests während der vorliegenden Studie und denen anderer Forscher könnte auf die Wirt-Parasit-Beziehung zurückgeführt werden, die von der Virulenz des T. gondii-Stamms, der Expositionszeit der Infektion und der Biologie des Virus abhängt Parasiten und den Immunstatus und das Alter der infizierten Pferde an verschiedenen Orten. Dies stimmt mit den Schlussfolgerungen von Tassi (2007) überein, der hinzufügte, dass die Prävalenz von equinen Toxoplasma-Infektionen unter natürlichen Bedingungen von 0 bis 90% variieren kann, abhängig von der Empfindlichkeit des verwendeten Tests, dem Alter der Tiere, dem geografischen Gebiet, den hygienischen Bedingungen der die Betriebe und die Betriebsführung.

Die Prävalenz der T. gondii-Infektion in Bezug auf die Rasse in dieser Studie zeigte, dass die Prävalenz bei arabischen Rassen niedriger war (44,4%) als bei (58,5%) bei einheimischen und (73,1%) bei importierten Rassen. Dies stimmt mit Ergebnissen überein, die zuvor von Riemann et al. (1975), der herausfand, dass die Prävalenz von T. gondii bei Arabern (19%) niedriger war als bei Paint- (22%) und Vollblutpferden (24%) in den USA. Auch Aganga et al. (1983) stellten fest, dass lokale Pferderassen in Nigeria eine geringere Inzidenz von T. gondii (33,0%) aufwiesen als importierte Pferderassen (38,5%).

In der vorliegenden Arbeit wurde jedoch eine hohe Prävalenz der T. gondii-Infektion bei Weibchen (60,8%) festgestellt, die 10,8, 12,4 und 29,9% bei Stuten, trächtigen bzw. Wiederholungszüchtern repräsentiert. Ähnliche sehr wenige Studien haben Geschlechts- und Fortpflanzungsstörungen im Zusammenhang mit Toxoplasmose bei Pferden gezeigt. Cusicket al. (1974) berichteten über eine hohe Prävalenz von Toxoplasmose bei Pferden mit einer Vorgeschichte von Aborten, Roperto et al. (1983) isolierten T. gondii aus der Leber eines abgetriebenen Fohlens und Turner und Savva (1990) zeichneten T. gandii-DNA in Läsionen aus der Plazenta einer Stute auf.

Über die Spezifität und Sensitivität der serologischen Diagnose einer T. gondii-Infektion bei Pferden ist wenig bekannt. Die höchste Sensitivität (93,8%) bei MAT, höchste Spezifität bei ELISA (92,8%) und niedrigste Spezifität (88,3%) bei LAT wurden in dieser Studie beim Vergleich der Daten der serologischen Tests mit denen der PCR als Referenztest erhalten für Toxoplasmose. Auch Dubey (2010) kam zu dem Schluss, dass der Nachweis von Toxoplasma-DNA durch PCR als der spezifischste und Standardtest angesehen wurde, nach dem alle anderen Tests beurteilt werden sollten. LAT zeigte die niedrigste Spezifität, erzeugt häufig falsch positive LAT-Titer und daher könnten technische Erwägungen, die die Genauigkeit des Ablesens schwach positiver Reaktionen beinhalten, für einige der Unterschiede verantwortlich sein (Holliman et al., 1989). Andererseits zeigt ELISA eine große Spezifität, ist quantitativ, niedrig und kann automatisch übernommen werden, erfordert jedoch eine weitere Verfeinerung in Bezug auf Verfahren und Standardisierung des verwendeten Antigens (Dubey et al., 1995). Bezüglich MAT beschreiben Dubey (1997) und Shaapan et al. (2008) fanden heraus, dass MAT unter allen serologischen Tests die höchste Sensitivität zum Nachweis einer Toxoplasma gondii-Infektion bei natürlich infizierten Sauen bzw. Schafen aufweist, die einfach durchzuführen sind und keine hochentwickelte Ausrüstung erfordern.

Es ist von Interesse, darauf hinzuweisen, dass der vorliegende Bericht der erste über den Nachweis einer T. gondii-Infektion bei Sportpferden in Ägypten ist. Die hohe Prävalenz dieses zoonotischen Parasiten deutet darauf hin, dass das Risiko einer Infektion des Menschen durch Pferde extrem hoch zu sein scheint, obwohl der Verzehr von Pferdefleisch unter Ägyptern ungewöhnlich ist. Die Teilnahme von Pferden an den Übertragungszyklen ist jedoch als Infektionsquelle sowohl für Vektoren als auch für Endwirte möglich. Darüber hinaus legte diese Studie nahe, dass MAT allein oder mit LAT als hochempfindlicher Screening-Test verwendet werden kann, gefolgt von PCR als spezifischer Bestätigungstest für die Diagnose von Toxoplasmose bei Pferden.

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