Information

Zufällige Mutagenese vs. gerichtete Evolution als Strategien zur Steigerung der Expression


Verwenden Menschen zufällige Mutagenese (z. B. unter Verwendung von UV), um Wirtsvarianten zu erzeugen, die eine hohe Expression eines Metaboliten / Enzyms aufweisen? Ich habe gesehen, dass es als Strategie erwähnt wurde, aber es verwirrt mich, warum.

Wie ist das im Vergleich zur Verwendung von Directed Evolution für den gleichen Zweck? Intuitiv erscheint die zufällige Mutagenese angesichts der kombinatorischen Explosion selbst in der Genomgröße von E. Coli höchst ineffizient (da Sie keine Kontrolle darüber haben, welche Gene Sie mutieren). Mache ich einen Fehler in dieser Argumentation?

In welchen Situationen kann man zufällige Mutagenese der gerichteten Evolution vorziehen? Gibt es Vor- und Nachteile zu beachten?


Nun, du hast es schon erwähnt. Die zufällige Mutagenese (mit UV- oder chemischen Mutagenen) zielt auf das gesamte Genom ab und Sie wählen die Organismus für bestimmte Eigenschaften.

In einem Experiment der gerichteten Evolution zielen Sie nur auf ein Gen oder eine Gruppe von Genen ab. Mit dem Fortschritt der synthetischen Biologie könnte es möglich sein, kleine Genome zu synthetisieren (bereits von Craig Venter und Gruppe gezeigt) und die Methodik der gerichteten Evolution genomweit anzuwenden. Dies würde immer noch nicht als gerichtet angesehen werden, da die Mutationen tatsächlich über das Genom zufällig sind.

Die Vor- und Nachteile hängen davon ab, was genau Sie tun möchten.


Gezielte, zufällige Mutagenese von Pflanzengenen mit dualen Cytosin- und Adenin-Base-Editoren

Eine gezielte Sättigungsmutagenese von Pflanzengenen könnte angewendet werden, um genetische Varianten mit verbesserter agronomischer Leistung zu erzeugen. Allerdings sind die Werkzeuge für die gerichtete Evolution von Pflanzengenen, wie fehleranfällige PCR oder DNA-Shuffling, begrenzt 1 . Wir entwickelten fünf gesättigte zielgerichtete endogene Mutagenese-Editoren (STEMEs), die de novo-Mutationen erzeugen und die gerichtete Evolution von Pflanzengenen erleichtern können. In Reisprotoplasten bearbeitete STEME-1 Cytosin und Adenin an derselben Zielstelle mit einer C > T-Effizienz von bis zu 61,61 % und einer gleichzeitigen C > T- und A > G-Effizienz von bis zu 15,10 %. STEME-NG, das die Protospacer-adjacent-Motiv-Variante der Nickase Cas9-NG enthält, wurde mit 20 einzelnen Einzel-Guide-RNAs in Reis-Protoplasten verwendet, um eine nahezu gesättigte Mutagenese (73,21 %) für einen 56-Aminosäuren-Anteil des Reisacetyls zu erzeugen -Coenzym-A-Carboxylase (OsACC). Wir haben auch STEME-1 und STEME-NG für die gerichtete Evolution des OsACC Gen in Reis und erhielten Mutationen der Herbizidresistenz. Dieser Satz von zwei STEMEs wird die Merkmalsentwicklung beschleunigen und sollte in allen Pflanzen funktionieren, die für die CRISPR-basierte Bearbeitung geeignet sind.


Zufällige Mutagenese vs. gerichtete Evolution als Strategien zur Steigerung der Expression - Biologie

Bei der Entwicklung der Biosynthese von Naturstoffen ist Protein-Engineering von größter Bedeutung, um die Eigenschaften von Enzymen oder genetisch kodierten Biosensoren zu verändern.

Protein-Engineering hat die Biosynthese von Naturstoffen durch Steigerung der enzymatischen Aktivität, Kolokalisierung von Enzymkomplexen, Verbesserung der Proteinstabilität und Engineering von Sensor-Regulatoren für besseres Screening oder dynamische Regulation verbessert.

Das Engineering bestehender Proteine ​​kann Varianten mit neuartigen katalytischen Funktionen ergeben. Diese Fortschritte erweitern das Produktspektrum und diversifizieren damit die Biosynthese von Naturstoffen.

In der Natur vorkommende Proteine ​​sind traditionell die am häufigsten verwendeten Biokatalysatoren zur Herstellung zahlreicher Naturstoffe, von Grundchemikalien bis hin zu Pharmazeutika. Protein Engineering hat sich zu einem leistungsfähigen biotechnologischen Werkzeugkasten in der Entwicklung des Metabolic Engineering, insbesondere für die Biosynthese von Naturstoffen, entwickelt. In letzter Zeit hat sich Protein-Engineering zu einer bevorzugten Methode entwickelt, um die enzymatische Aktivität zu verbessern, die Enzymstabilität zu erhöhen und die Produktspektren in der Naturstoffbiosynthese zu erweitern. Dieser Aufsatz fasst jüngste Fortschritte und typische Strategien im Protein-Engineering zusammen und hebt die herausragende Rolle des Protein-Engineerings bei der Verbesserung und Diversifizierung der Biosynthese von Naturstoffen hervor. Auch Zukunftsaussichten und Forschungsrichtungen werden diskutiert.


Abstrakt

Bioprocess, eine auf Biokatalyse basierende Technologie, wird in vielen Forschungsbereichen populär und findet breite Anwendung in der industriellen Fertigung. Eine geringe Bioumwandlung, geringe Produktivität und hohe Kosten während industrieller Prozesse sind jedoch normalerweise die Einschränkung bei Bioprozessen. Daher wurden in den letzten Jahren viele Biokatalysatorstrategien entwickelt, um diesen Herausforderungen zu begegnen. In diesem Aufsatz diskutieren wir zunächst Protein-Engineering-Strategien, die zur Verbesserung der Biokatalyseaktivität von Biokatalysatoren entwickelt wurden. Anschließend fassen wir Metabolic-Engineering-Strategien zusammen, die die Entwicklung mikrobieller Zellfabriken fördern. Als nächstes veranschaulichen wir die Notwendigkeit der Kombinationsstrategie von Protein-Engineering und Metabolic Engineering für effiziente Biokatalysatoren. Abschließend werden Zukunftsperspektiven zur Entwicklung und Anwendung neuartiger Biokatalysatorstrategien diskutiert. Dieser Aufsatz bietet theoretische Leitlinien für die Entwicklung effizienter, nachhaltiger und wirtschaftlicher Bioprozesse, die durch neuartige Biokatalysatoren vermittelt werden.


Schlussfolgerungen

Der Fortschritt hin zu sinnvollen Therapien für neurologische Entwicklungsstörungen hat sich in den letzten Jahren stark beschleunigt. ZNS-gerichtete AAV-Gentherapien, insbesondere Therapien mit AAV9, liefern vielversprechende präklinische Ergebnisse, insbesondere wenn sie früh im Krankheitsverlauf bereitgestellt werden, und werden zunehmend von der Prüfbank in klinische Phase-I-Studien überführt. Die zunehmende Forschung zum Verständnis der zugrunde liegenden Biologie neurologischer Entwicklungsstörungen wird enorm dazu beitragen, die relevanten Zelltypen und Behandlungsparadigmen zu definieren. In Verbindung mit kontinuierlichen Verbesserungen des Konstruktdesigns und der Entwicklung neuartiger AAV-Varianten mit spezifischen und verbesserten Targeting-Fähigkeiten besteht viel Hoffnung für die Behandlung selbst komplexer Erkrankungen. Beim Übergang von Behandlungen in die klinische Praxis werden Bemühungen zur Verhinderung hemmender Immunreaktionen ein wichtiger Schwerpunkt sein. Die Arbeit am Verständnis der Immunität gegen Therapien auf der präklinischen Seite und die sorgfältige Überwachung während klinischer Studien werden zweifellos eine Fülle von Erkenntnissen liefern und dazu beitragen, die Entwicklung sicherer und hochwirksamer Therapien zu fokussieren.


Methoden

Stämme und Expressionsvektoren

D2-BGL wurde exprimiert in Pichia pastoris SMD 1168 (Invitrogen, USA) oder in Saccharomyces cerevisiae ATCC 4.014.317. Die Plasmide pGAPZαC mit einem Zeocin-Resistenzmarker und YEp352 mit einem URA3-auxotrophen Marker (bereitgestellt von Prof. Frances Arnold, Division of Chemistry, Caltech, Pasadena, CA, USA) wurden für die rekombinante Enzymexpression in P. pastoris und S. cerevisiae, bzw. Diese beiden Plasmide enthalten das α-Paarungsfaktor-Sekretionssignalpeptid stromaufwärts von D2-BGL für die Proteinsekretion. Der Expressionsvektor pGAPZαC-D2 wurde wie in einer früheren Studie beschrieben erzeugt [20], während der Expressionsvektor YEp-D2 durch Klonieren des PCR-Produkts von D2-BGL in das YEp352-Plasmid erzeugt wurde.

Heterologe Expression von D2-BGL in Hefe

P. pastoris Kompetente Zellen wurden durch ein modifiziertes Lithiumacetat-Dithiothreitol (LiAc-DTT)-Verfahren hergestellt [34]. 400 Nanogramm pGAPZαC-D2, linearisiert mit dem Restriktionsenzym BspHI, wurden in P. pastoris durch Elektroporation. Transformanten wurden auf YPDS-Platten (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose, 1 M Sorbit und 20 g/l Agar), ergänzt mit 100 mg/l Zeocin (Invivogen, Taiwan), selektiert. Für die D2-BGL-Expression in Kolbenkultur wurde eine einzelne Kolonie in 3 ml YPD-Medium (1% Hefeextrakt, 2% Pepton, 2% Glucose) mit Zeocin inokuliert und dann bei 30°C über Nacht bei 250 U/min inkubiert. Diese Vorkultur wurde in 50 ml YPD-Medium mit der anfänglichen OD . geimpft600 Wert auf 0,05 eingestellt und dann bei 30 °C für 3 Tage bei 250 U/min inkubiert.

Saccharomyces cerevisiae Kompetente Zellen wurden präpariert und transformiert unter Verwendung der SC. EasyComp™ Transformations-Kit (ThermoFisher Scientific, USA). Einhundert Nanogramm Yep-D2 wurden umgewandelt in S. cerevisiae, und Transformanten wurden dann auf YNB-Ura-Platten selektiert, die 6,7 g/L Hefe-Stickstoffbase ohne Aminosäuren (Sigma-Aldrich, USA), 0,77 g/L –Ura DO Supplement (Clontech, USA), 2% Glucose und 20 g&supmin; enthielten /l Agar, pH 5,8. Für die D2-BGL-Expression wurde eine einzelne Kolonie in 4 ml SDCAA-Medium mit 6,9 g/l Hefe-Stickstoffbase, 5 g/l Bacto-Casaminosäure (BD, USA), 5,4 g/l Na&spplus;2Bestellung4, 8,56 g/l NaH2Bestellung4·H2O und 20 µg/mL L-Tryptophan (Sigma-Aldrich, USA) [35] und anschließend bei 30 °C über Nacht bei 250 U/min inkubiert. Diese Vorkultur wurde in 40 ml SDCAA-Medium mit der anfänglichen OD . geimpft600 Wert auf 0,1 eingestellt und dann bei 30 °C für 2 Tage bei 250 U/min inkubiert.

Ortsgerichtete Mutagenese

Punktmutationen wurden in D2-BGL mit dem QuikChange Lightning Site-Directed Mutagenesis Kit (Agilent, USA) erzeugt. Die Amplifikation der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) wurde mit 20 ng Plasmid als Matrize und Rücken-an-Rücken-Primern durchgeführt (Zusatzdatei 1: Tabelle S2). Die PCR wurde mit einem Denaturierungsschritt bei 95 °C für 2 min gestartet, gefolgt von 18 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Annealing bei 60 °C für 30 s und Verlängerung bei 68 °C für 3 min, und die Reaktion wurde nach einem letzten Extensionsschritt bei 68 °C für 5 min abgeschlossen. Die Plasmid-Matrize wurde durch DpnI-Restriktionsenzymverdau bei 37 °C für 1 h eliminiert, und das verbleibende PCR-Produkt wurde in . transformiert E coli DH5α-Stamm.

Zufallsmutagenese mit ePCR

Die Mutantenbibliothek wurde generiert und in gescreent S. cerevisiae indem sie einer modifizierten Version eines gerichteten Evolutionsansatzes folgten [36]. Der Expressionsvektor YEp-D2 wurde durch Restriktionsenzymverdau linearisiert, um die D2-BGL-Sequenz zu entfernen. Die mutierte D2-BGL-Sequenz wurde unter Verwendung von ePCR mit 100 ng YEp-D2 als Matrize in 100 µL PCR-Lösung mit 0,2 mM dNTP, 0,1 µM Sc ePCR F Sense-Primer, 0,1 µM Sc ePCR R Antisense-Primer, 0,5 mM MgCl . erzeugt2, 0,2 mM MnCl2 und 5 U GoTaq Flexi DNA-Polymerase (Promega, USA). Die Sc ePCR F- und Sc ePCR R-Primer (Zusatzdatei 1: Tabelle S2) erzeugten überlappende Regionen von 41 Basenpaaren (bp) und 47 bp mit linearisiertem yEP-Vektor an den 5'- bzw. 3'-Enden der ePCR-Produkte. Die ePCR wurde mit einem Denaturierungsschritt bei 95 °C für 2 min initiiert, gefolgt von 28 Denaturierungszyklen bei 95 °C für 30 s, Annealing bei 50 °C für 30 s und Verlängerung bei 72 °C für 3 min, und die Reaktion wurde nach einem letzten Extensionsschritt bei 72 °C für 5 min abgeschlossen. Sowohl linearisierte YEp- als auch ePCR-Produkte wurden unter Verwendung des QIAquick Gel Extraction Kit (QIAGEN, Deutschland) gereinigt.

Screening von Mutantenbibliotheken

Um die D2-BGL-Mutantenbibliothek in zu konstruieren S. cerevisiae, Gleiche Beträge (

45 fmol) linearisierter YEp- und ePCR-Produkte wurden zusammen in 40 μL kompetenter Zellen transformiert und die Transformanten wurden auf YNB-Ura-Platten bei 30 °C für 3 Tage selektiert. Einzelne Kolonien wurden isoliert und einzeln in die Vertiefungen einer 96-Deep-Well-Platte mit 50 &mgr;l SDCAA-Medium in jeder Vertiefung inokuliert. Transformanten, die mit PCR-Produkten aus Wildtyp-D2-BGL erzeugt wurden, wurden in eine Säule mit acht Vertiefungen inokuliert, um als Positivkontrolle zu dienen. Nach einer 2-tägigen Inkubation wurden 300 μl SDCAA-Medium in jede Vertiefung gegeben und die Platte wurde weitere 3 Tage bei 30 °C inokuliert. Um D2-BGL-Mutanten zu screenen, wurden 50 µl Kulturüberstand mit 50 µl 4 mM . gemischt P-Nitrophenyl-β-D-glucopyranosid (PNPG) in einer 96-Well-Platte. Die Enzymaktivität wurde 5 min bei 55 °C getestet und die Reaktion durch Zugabe von 100 μl 1 M Na . gestoppt2CO3. Werte von OD405 wurden mit einem SynergyMx Microplate Reader (BioTek, USA) gemessen. Der Durchschnitt (AVE) und die Standardabweichung (STDEV) wurden für die Wells der Positivkontrolle (WT) jeder Platte berechnet. Transformanten mit OD405 > (AVEWT + 2 × STABWWT) wurden isoliert und in neuen YNB-URA-Platten kultiviert. Plasmide wurden aus potentiell verbesserten D2-BGL-Mutanten unter Verwendung eines Zymoprep Yeast Plasmid Miniprep II Kits (ZYMO RESEARCH, USA) extrahiert. Die ausgewählten Transformanten wurden einer Kolbenkultur unterzogen und die Kulturüberstände wurden für den Cellobiase-Aktivitätsassay verwendet.

Proteinsequenz- und Strukturanalysen

Mehrfaches Alignment von β-Glucosidasen aus Chaetomella raphigera D2-BGL (PDB-Code: 6JXG), Aspergillus aculeatus BGL1 (PDB-Code: 4IIH), Aspergillus niger BGL1 (GenBank: RDH24713.1), Aspergillus niger ASKU28 (GenBank: AFW98805.1) und Trichoderma reesei (PDB: 4I8D) wurde mit Clustal Omega [37] durchgeführt. Strukturmodelle der D2-BGL-Mutanten F256Y und F256M wurden mit SWISS-MODEL erstellt [38]. Protein-3D-Kristallstrukturen wurden unter Verwendung des PyMOL Molecular Graphics System v2.2.3 (Schrodinger, LLC) visualisiert.

Enzymreinigung durch Immunaffinitätschromatographie

Die Immunaffinitätschromatographie wurde unter Verwendung einer Poly-Prep-Chromatographie-Schwerkraftflusssäule (Biorad, USA) durchgeführt, die mit 1 ml CNBr-aktiviertem Sepharose 4B-Harz (GE Healthcare Bio-sciences AB, Schweden) gefüllt war, gekoppelt an gereinigtes polyklonales Kaninchen-Anti-D2 -BGL-Antikörper (LTK BioLaboratories, Taiwan). Zur Probenvorbereitung 100 ml S. cerevisiae Kulturüberstand oder 30 ml P. pastoris-Kulturüberstand wurden durch 0,2 µm Supor Membrane Disc Filter (PALL, USA) filtriert. Der Überstand wurde unter Verwendung einer Vivaspin 20 MWCO 30.000-Säule (GE Healthcare, UK) auf 1 ml konzentriert und ein Pufferaustausch wurde dreimal mit 19 ml Bindungspuffer (20 mM Natriumphosphat, pH 7) durchgeführt. Die letzte Probe wurde unter Verwendung von Bindungspuffer auf 10 ml verdünnt. Die Reinigung begann mit einem Äquilibrierungsschritt unter Verwendung von 10 ml Bindungspuffer. Nach der Probeninjektion wurde die Säule mit 30 ml Bindungspuffer gewaschen. Die Elution erfolgte mit 15 ml Elutionspuffer (0,1 M Glycin, pH 2,7), bevor 700 µl Neutralisationspuffer (1 M Tris, pH 9) zugegeben wurden. Die Lösung des gereinigten Proteins wurde gepuffert und unter Verwendung einer Vivaspin 6 MWCO 10.000-Säule mit 50 mM Natriumacetatpuffer (NaOAc, pH 5) konzentriert.

Deglykosylierung durch Endo H-Behandlung

Gereinigtes D2-BGL und Proben aus dem Kulturüberstand wurden mit Endoglykosidase H (NEB, USA) gemäß Herstellerprotokoll deglykosyliert. Kurz gesagt wurden zur Deglykosylierung von gereinigtem D2-BGL 2 µg Pp D2-BGL oder Sc D2-BGL in 10 µl Reaktionslösung in Glycoprotein Denaturing Buffer (NEB, USA) gegeben. Nach 10 min Erhitzen auf 100 °C wurde die Deglykosylierung mit 0,4 μL Endo H in GlycoBuffer 3 bei 37 °C für 1 h durchgeführt. Zur Deglykosylierung von Proben, die in der Western-Blotting-Analyse verwendet werden, wurden 10 µL Kulturüberstand oder seriell verdünntes gereinigtes D2-BGL (Originalkonzentration: 0,11 mg/mL) in die Reaktionslösung (Gesamtvolumen: 50 µL) mit 0,5 µL Endo H . gegeben in GlycoBuffer 3. Die Reaktion wurde 30 min bei 37 °C durchgeführt.

Cellulase-Aktivitätsassays

β-Glucosidase-Aktivitätsassays wurden gemäß den Methoden durchgeführt, die in unserer vorherigen Studie beschrieben wurden [20]. Die Reaktion wurde nach 5, 10 und 20 Minuten getestet, um sicherzustellen, dass die Messung im linearen Bereich liegt. Kurz gesagt wurde die β-Glucosidase-Aktivität mit PNPG oder Cellobiose als Substrat in 50 mM NaOAc, pH 5. Für die PNPGase-Assay, die enzymatische Reaktion wurde mit 100 μl Enzymlösung gemischt mit 100 μl 4 mM . durchgeführt PNPG bei 55 °C für 5 min. Nach Zugabe von 600 μL 1 M Na2CO3 Um die Reaktion zu stoppen, wurden 200 μL der endgültigen Lösung in eine 96-Well-Platte überführt und die OD405 Wert wurde mit dem SynergyMx Microplate Reader gemessen. Die Produktkonzentrationen wurden anhand einer Standardkurve bestimmt, die mittels PNP-Serienverdünnung. Für den Cellobiase-Assay wurden 100 µl Enzymlösung mit 100 µl 20 mM Cellobiose gemischt und die Reaktion 10 min bei 55 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Hitzeinaktivierung bei 100 °C für 10 Minuten gestoppt. Die Glucosekonzentrationen wurden unter Verwendung eines YSI 2700 Select Biochemistry Analyzer (Yellow Springs Instruments, USA) bestimmt. Eine Enzymeinheit (U) wurde als 1 µmol Produkt (d. h. PNP oder Glucose) pro Minute freigesetzt.

Die Gesamtcellulaseaktivität wurde mit 50 mg NO.1-Filterpapier (Whatman, UK) bestimmt. Die Produktkonzentrationen wurden mit der Dinitrosalicylsäure (DNS)-Methode [39] bestimmt, und eine serielle Verdünnung von Glucose wurde verwendet, um die Standardkurve des reduzierenden Zuckers zu erstellen. Für den Filterpapier-(FP)-Assay wurden 0,5 ml Enzymlösung mit 1 ml NaOAc-Puffer (pH 5) gemischt, der das Filterpapier enthielt, und die Reaktion wurde 60 min bei 55 °C durchgeführt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 3 ml DNS-Lösung gestoppt und die Färbung wurde durch Erhitzen auf 100 °C für 5 min durchgeführt. Die OD540 Wert wurde mit dem SynergyMx Microplate Reader gemessen. Eine Filterpapiereinheit (FPU) wurde definiert als 1 µmol reduzierender Zucker, der pro Minute freigesetzt wird.

Temperatur- und pH-Stabilitätstests

Enzymlösungen mit 1,2 mg/L gereinigtem D2-BGL wurden bei 25–70 °C für 4 h für Temperaturstabilitätstests und bei pH 4–8 für 24 h für pH-Stabilitätstests inkubiert. Die relative Aktivität wurde unter Verwendung des Cellobiase-Assays bestimmt.

Enzymkinetik

Spezifische Aktivitäten wurden unter Verwendung von 0,15 µg gereinigtem Enzym in 100 µl Enzymlösung (d. h. Enzymkonzentration: 1,5 mg/l) bestimmt. Die PDer NPGase-Assay wurde bei 55 °C für 2 min mit 0,25–6 mM . durchgeführt PNPG und der Cellobiase-Assay wurde bei 55 °C für 5 min mit 0,625–100 mM Cellobiose durchgeführt. Die Glukosehemmung wurde bestimmt über PNPG-Assay in Gegenwart von 0, 5 oder 10 mM Glucose. Die kinetischen Parameter Km, Vmax, Kich glukose und Kich substrat wurden unter Verwendung der eingebauten Enzymkinetikmodelle von Prism 8.3.0 (GraphPad Software Inc., USA) bestimmt.

Intrazelluläre Proteinextraktion

Intrazelluläre Proteine ​​wurden aus Zellpellets einer 3-Tage-Kultur unter Verwendung von YeastBuster Extraction Reagent (Merck, USA) extrahiert. Die Extraktion wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers durchgeführt. Kurz gesagt wurden 5 μl Extraktionsreagenz und 0,05 μl 100X Tris(hydroxypropyl)phosphin(THP)-Lösung pro mg Zelle (Feuchtgewicht) verwendet,um das Zellpellet zu resuspendieren. Nach Zugabe von 25 U Benzonase-Nuclease wurde die Lösung bei Raumtemperatur für 20 Minuten unter Rühren inkubiert. Lösliche Proteine ​​wurden nach Konzentration bei 16.000 g bei 4 °C für 20 Minuten gesammelt und die Proteinkonzentration wurde unter Verwendung des Pierce Detergent Compatible Bradford Assay Kit (ThermoFisher Scientific, USA) bestimmt.

Western-Blotting

Proteinproben wurden unter Verwendung eines 10% SDS-PAGE-Gels getrennt. Western-Blotting wurde unter Verwendung einer Amersham Hybond 0,2 &mgr;m Polyvinylidendifluorid-PVDF-Blotting-Membran (GE Healthcare Life Science, Deutschland) und des Mini Trans-Blot-Zellsystems (Bio-Rad, USA) durchgeführt. Nach Übertragung bei 100 V und 200 mA mit dem PowerPac 1000 Electrophoresis Power Supply (Bio-Rad, USA) für 1,5 h auf Eis wurde die PVDF-Membran über Nacht bei 4 °C in eine Blockierungslösung mit 30 ml Tris Buffered Saline (TBS Omics Bio, Taiwan), 1,5 g Magermilchpulver und 0,05 % Tween 20 (JTBaker, USA). Anti-D2-BGL-Serum-Antikörper wurden dann in einer Verdünnung von 1:30.000 in die Blockierungslösung gegeben und das Eintauchen bei Raumtemperatur für weitere 1 h fortgesetzt. Die Membran wurde dreimal mit 30 ml TBS-T (TBS und 0,05% Tween 20) gewaschen, dann wurde die Membran in 10 ml TBS-T mit 0,1 g Magermilchpulver und Anti-Kaninchen-IgG-HRP (Perkin Elmer, USA 1 .) getaucht :10.000). Nach 1 h Eintauchen wurde die PVDF-Membran dreimal mit TBS-T gewaschen und die Anwesenheit von D2-BGL wurde durch Chemilumineszenz unter Verwendung von Western Lightning ECL Pro (Perkin Elmer, USA) nachgewiesen. Die Proteinmengen wurden mit der Bildgebungssoftware ImageJ [40] quantifiziert.

Quantitative Polymerase-Kettenreaktionen (qPCR)

Gesamt-RNA aus P. pastoris Zellen, die nach 24-stündiger Inkubation bei 30 °C gesammelt wurden, wurden mit TRIzol Reagenz (ThermoFisher Scientific, USA) gemäß den Anweisungen des Herstellers isoliert. Ein Mikrogramm DNase I (Invitrogen, USA) behandelter Gesamt-RNA wurde verwendet, um cDNA unter Verwendung von SuperScript II Reverse Transcriptase (Invitrogen, USA) zu erzeugen. Die qPCR-Reaktionslösung wurde mit Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems, USA) hergestellt und die Amplifikation wurde mit dem QuantStudio™ 12 K Flex-System (Applied Biosystems, USA) durchgeführt. Die P. pastoris Aktin-Gen (AKT 1 GenBank: AF216956.1) wurde als Referenzgen verwendet, und die − 2 ΔΔCT-Methode wurde angewendet, um die relative Expression von D2-BGL- und Unfolded Protein Response (UPR)-verwandten Genen zu bestimmen HAC1, KAR2, PDI1, ERO1 und CNE1 (mit Primern, die in Zusatzdatei 1: Tabelle S2 aufgeführt sind).

Biomasseverzuckerungsassays

Säurevorbehandelte Biomasse wurde vom Institute of Nuclear Energy Research (Taoyuan, Taiwan) bereitgestellt. Der Zellulosegehalt in vorbehandelter Zuckerrohr-Bagasse und Reisstroh wurde auf 44,7 % bzw. 48,17 % geschätzt. Die Verzuckerungsassays wurden mit 1, 2, 5 oder 7,5% Zuckerrohr-Bagasse (w/v) in 1 ml Reaktionslösung in einem 2 ml Safe-Lock Tube (Eppendorf) durchgeführt. Die Reaktionslösung wurde hergestellt, pro 1% Biomasse , mit 10 μl Tween 80, 0,06 FPU C1.5L (Sigma-Aldrich, USA) und 0,3 μg WT D2 oder Mut M in 50 mM NaOAc (pH 5). Die Verzuckerung wurde 72 h bei 50 °C und 250 U/min getestet. Die Glucosekonzentration wurde unter Verwendung des Glucoseanalysators YSI 2700 bestimmt.


Zugangsoptionen

Erhalten Sie vollen Zugriff auf Zeitschriften für 1 Jahr

Alle Preise sind Nettopreise.
Die Mehrwertsteuer wird später an der Kasse hinzugefügt.
Die Steuerberechnung wird während des Bezahlvorgangs abgeschlossen.

Erhalten Sie zeitlich begrenzten oder vollständigen Artikelzugriff auf ReadCube.

Alle Preise sind Nettopreise.


Abstrakt

Bei der experimentellen Evolution entwickeln Wissenschaftler Organismen im Labor weiter, indem sie sie typischerweise an neue Umweltbedingungen herausfordern. Wie entwickelt man am besten ein gewünschtes Merkmal? Soll die Herausforderung abrupt, schrittweise, periodisch, sporadisch angewendet werden? Sollte man chemische Mutagenese anwenden und entwickeln sich Stämme mit hoher angeborener Mutationsrate schneller? Was sind ideale Populationsgrößen von sich entwickelnden Populationen? Es gibt endlose Strategien, die über diejenigen hinausgehen, die von einzelnen Labors aufgedeckt werden können. Aus diesem Grund haben wir eine Community-Challenge, Evolthon, organisiert, bei der Studenten und Wissenschaftler aus verschiedenen Labors aufgefordert wurden, sich weiterzuentwickeln Escherichia coli oder Saccharomyces cerevisiae für abiotischen Stress – niedrige Temperatur. Etwa 30 Teilnehmer aus der ganzen Welt erforschten verschiedene Umwelt- und genetische Regime der Evolution. Nach einer Evolutionsphase in jedem Labor wurden alle Stämme jeder Art miteinander konkurriert. Bei Hefe waren die erfolgreichsten Strategien die der Paarung, was die Bedeutung des Geschlechts in der Evolution unterstreicht. Bei Bakterien verwendete der am besten geeignete Stamm eine Strategie, die auf der Untersuchung verschiedener Mutationsraten beruhte. Verschiedene Strategien zeigten unterschiedliche Leistungs- und Stabilitätsniveaus bei zusätzlichen Herausforderungen und Bedingungen. Diese Studie deckt daher Prinzipien effektiver experimenteller evolutionärer Regime auf und könnte sich auch für die biotechnologische Entwicklung neuer Stämme und für das Verständnis natürlicher Strategien im evolutionären Wettrüsten zwischen Arten als nützlich erweisen. Evolthon stellt ein Modell für gemeinschaftsbasierte wissenschaftliche Erkundungen dar, das Kreativität und Zusammenarbeit fördert.

Zitat: Kaminski Strauss S., Schirman D, Jona G, Brooks AN, Kunjapur AM, Nguyen Ba AN, et al. (2019) Evolthon: Ein Gemeinschaftsprojekt zur Weiterentwicklung der Laborevolution. PLoS Biol 17(3): e3000182. https://doi.org/10.1371/journal.pbio.3000182

Wissenschaftlicher Redakteur: Laurence D. Hurst, University of Bath, VEREINIGTES KÖNIGREICH

Veröffentlicht: 29. März 2019

Urheberrechte ©: © 2019 Kaminski Strauss et al. Dies ist ein Open-Access-Artikel, der unter den Bedingungen der Creative Commons Attribution License vertrieben wird und die uneingeschränkte Verwendung, Verbreitung und Reproduktion in jedem Medium gestattet, sofern der ursprüngliche Autor und die Quelle angegeben werden.

Finanzierung: YP wurde unterstützt von The Minerva Center for Live Emulation of Genome Evolution AZ 5746940763, TD wurde von SPP1819 unterstützt Schnelle Anpassung Die Geldgeber spielten keine Rolle beim Studiendesign, der Datensammlung und -analyse, der Entscheidung zur Veröffentlichung oder der Erstellung des Manuskripts

Konkurrierende Interessen: Die Autoren haben erklärt, dass keine konkurrierenden Interessen bestehen.

Abkürzungen: DREAM, Dialogue for Reverse Engineering Assessments and Methods iGEM, International Genetically Engineered Machine OD, Optical density

Herkunft: Nicht in Auftrag gegeben extern peer-reviewed.


Evolution von Pflanzenmutagenesewerkzeugen: ein Paradigmawechsel von zufälliger zu gezielter Genom-Editierung

Mutationen sind die Grundlage aller genetischen Variationen, und die klassische Pflanzenzüchtung hat sich die Kraft natürlicher Mutationen bei der Entwicklung ertragreicher Sorten zunutze gemacht. Seit der Entdeckung chemischer und Strahlungsmutagene wurden verschiedene Mutagenesemethoden in der molekularen Pflanzenzüchtung effektiv eingesetzt, um Genfunktionen zu untersuchen und entscheidende genetische Mutationen zu identifizieren, um Pflanzen neue Eigenschaften zu verleihen. Hier überprüfen wir die historische Entwicklung und Verwendung von Pflanzenmutagenesewerkzeugen, hauptsächlich physikalische und chemische Mutagene, PCR-basierte Methoden, T-DNA-Insertionen, Transposon-Insertionen, RNA-Interferenz und Meganukleasen. Das einzigartige Merkmal von Meganukleasen wie dem CRISPR/Cas-System ist die Kontrolle von ortsgerichteten DNA-Veränderungen. Wir heben die jüngsten Fortschritte bei CRISPR/Cas-basierten Mutagenesewerkzeugen hervor, die verschiedene Anwendungen genetischer Manipulationen ermöglichen, einschließlich Gen-Knock-out, Genersatz, gezielte Basensubstitutionen und Nukleotid-Diversifizierung benutzerdefinierter Stellen. Darüber hinaus überprüfen wir den Einsatz von CRISPR/Cas-basierten Mutagenesewerkzeugen in der Landwirtschaft.

Dies ist eine Vorschau von Abonnementinhalten, auf die Sie über Ihre Institution zugreifen können.


Materialen und Methoden

Plasmide, Stämme, Reagenzien und Wachstumsmedien. Das pGAD424-SRC1-"Beute"-Plasmid, das den Volllängen-Steroidrezeptor-Coaktivator 1 (SRC-1)-Coaktivator enthält, wurde wie in Lit. beschrieben konstruiert. 20 und war ein freundliches Geschenk von Benita S. Katzenellenbogen (University of Illinois). Die Aminosäuren 312–595, die die LBD- und F-Domäne von hERα enthalten, wurden stromabwärts der Gal4-DNA-Bindungsdomäne in das pBD-Gal4-Cam-"Köder"-Plasmid (Stratagene) eingefügt, wie in Lit. beschrieben. 21. Für diese Arbeit wurde der Hefe-Two-Hybrid (Y2H)-Stamm YRG2 (Stratagene) verwendet. Die Klonierung von mutanten hERα-LBD-Konstrukten in den Säugetier-Expressionsvektor pCMV5 wurde in Lit. beschrieben. 21. Für das Wachstum von Hefezellen verwendete reiches Medium war Hefeextrakt-Peptondextrose-Medium plus Adenin (22), während minimales Medium synthetisches komplettes (SC) Dropout-Medium (23) war, dem die entsprechenden Aminosäuren fehlten. Taq DNA-Polymerase wurde von Promega erhalten, und PfuTurbo DNA-Polymerase wurde von Stratagene bezogen. 4,4'-Dihydroxybenzil wurde wie in Lit. beschrieben synthetisiert. 24. Sofern nicht anders angegeben, wurden alle anderen Reagenzien von Sigma-Aldrich bezogen.

Systembasiertes Y2H-Screening. Transformanten von einzelnen Site-Sättigungs-Mutagenese-Bibliotheksplatten und fehleranfälligen PCR-Bibliotheksplatten wurden mit sterilen Zahnstochern gepickt und über Nacht (≈16–20 h) bei 30 °C in 96-Well-Platten mit rundem Boden (Evergreen Scientific, Los Angeles) mit 50 μl SC-Leu-Trp-Minimalflüssigkeitsmedium in jeder Vertiefung. Als Kontrolle wurde eine Vertiefung in jeder Mikrotiterplatte mit einer Hefekolonie beimpft, die das parentale hERα-LBD-Konstrukt exprimiert. Nach dieser Inkubation über Nacht werden 250 μl steriles, doppelt destilliertes H2O wurde in jede Vertiefung gegeben, und 5 μl jeder verdünnten Kultur wurden dann in die entsprechenden Vertiefungen von zwei sterilen 96-Well-Mikrotiterplatten mit flachem Boden (Rainin Instruments) mit 200 μl SC-Leu-Trp-His-Medium mit an geeignete Konzentration von entweder Zielliganden (DHB) oder E2. Geeignete Ligandenkonzentrationen für dieses Screening wurden basierend auf der Reaktion des parentalen hERα-LBD-Konstrukts ausgewählt. Für jede Screeningrunde wurde eine DHB-Konzentration ausgewählt, bei der das parentale hERα-LBD-Konstrukt schwach oder gar nicht reagiert, während die Konzentration von E2 für das Screening wurde so ausgewählt, dass das Elternkonstrukt mäßig anspricht. Diese ligandenhaltigen Mikrotiterplatten wurden 24 h bei 30 °C inkubiert, danach wurden sie visuell auf Mutanten mit verstärkter Reaktion auf den Zielliganden (höhere Zelldichte als die parentale Mutantenkontrolle) und abgeschwächte Reaktion auf E . untersucht2 (niedrigere Zelldichte als Eltern). Einhundertneunzig Mutanten wurden pro Sättigungs-Mutagenese-Bibliothek unter Verwendung dieses Ansatzes gescreent, wobei 95 Bibliotheksvarianten und eine das Elternkonstrukt exprimierende Hefe als Kontrolle pro Mikrotiterplatte verwendet wurden.

Liganden-Dosis-Reaktions-Assay. Übernachtkulturen der entsprechenden Hefezellen wurden in SC-Leu-Trp-His-Minimalmedium auf eine endgültige OD . verdünnt600 von 0,002. Aliquots (190 μl) dieser verdünnten Kultur wurden in die Vertiefungen einer sterilen 96-Well-Mikrotiterplatte mit flachem Boden (Rainin Instruments) gegeben, gefolgt von der Zugabe von 10 μl eines entsprechend konzentrierten Liganden, bestehend aus einer 50-fachen Verdünnung von Ethanolstamm Lösung in SC-Leu-Trp-His Minimalmedien. Diese Mikrotiterplatten wurden 24 h bei 30 °C inkubiert, danach wurden die Kulturen durch Pipettieren gemischt und OD600 die Ablesungen wurden unter Verwendung eines Spectramax 340PC-Plattenlesegeräts (Molecular Devices) vorgenommen.

Säugetiertransfektion und Luciferase-Assay. Verfahren, die für die Zellkultur, Transfektion und Durchführung des Luciferase-Assays verwendet werden, wurden in Lit. beschrieben. 25.

Unterstützende Materialien und Methoden. Die Erstellung von Bibliotheken, das Klonen und Transformation von Bibliotheken sowie die molekulare Modellierung werden beschrieben in Unterstützende Materialien und Methoden, die als unterstützende Informationen auf der PNAS-Website veröffentlicht wird.


Abbildung 1

Abbildung 1. Die mathematische Modellierung schlägt die Möglichkeit vor, bistabiles Verhalten mit den Start- und entwickelten positiven Rückkopplungsschaltungen zu erzeugen. a) Schema der PFL unter der Kontrolle eines Signals OHHL (S). Der Transkriptionsfaktor LuxR (R) bildet nach Bindung mit S einen aktivierten Komplex C, der ein Homodimer bildet und an den Promotor bindet PluxI um den LuxR-Ausdruck zu aktivieren, was ein positives Feedback bewirkt. Dieses System kann durch zwei dimensionslose Gleichungen modelliert werden: dR/dτ = α(C n /1 + C n )) – βR – kSR + α0 dC/dτ = kSR– C. Hier repräsentieren S, R und C in den Gleichungen Konzentrationen von OHHL, LuxR bzw. Komplex C. Die Synthese von R wird durch eine einzelne Hill-Funktion modelliert, die Transkription und Translation zusammenfasst. Der Hill-Koeffizient wird auf 2 gesetzt, um die schnelle Dimerisierung von C und die Bindung des Dimers an . widerzuspiegeln PluxI . α ist die Syntheseratenkonstante von R aufgrund der Rückkopplung. α0 ist die basale oder konstitutive Synthesegeschwindigkeitskonstante von R. β ist die Abbaugeschwindigkeitskonstante von R. k ist die Bindungskonstante von R mit S. Um das Modell dimensionslos zu machen, wird die Zeit in Bezug auf die Zerfallskonstante von C skaliert und die Konzentrationen in Bezug auf die halbe Aktivierungsschwelle von C skaliert. Für die Verzweigung werden biologisch machbare Parameterwerte verwendet Analyse, mit Basiswerten von β = 5, α0 = 1, und k =1. b) Das dynamische Verhalten der PFL wird durch α bestimmt. Wenn α größer als der kritische Wert ist (blaue gestrichelte Linie), zeigt das System Bistabilität (oberer Einschub). Für jedes α definieren die beiden roten Linien die Grenzen des bistabilen Bereichs in Bezug auf S.

Bistabile Genschalter, die durch positives Feedback gesteuert werden, wurden in einigen zellulären Kontexten experimentell untersucht (19, 20). Die aktuellen Daten in Lit. 16, die auf Bevölkerungsebene gemessen wurden, können keine Aussage darüber treffen, ob das System bistabil ist. Um diese interessante Dynamik aufzuklären, sind zusätzliche Analysen erforderlich, indem das Verhalten einzelner Zellen untersucht und das Vorhandensein von Hysterese erkannt wird. Wenn dies das Designziel der Autoren wird, könnten weitere Evolutionsrunden bei LuxR, anderen Schaltungskomponenten oder der Schaltung helfen.


Schau das Video: From DNA to protein - 3D (November 2021).