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Welche Chemokine werden von Melanozyten produziert?


Ich untersuche Vitiligo, eine Autoimmunerkrankung, die aufgrund einer falsch gefalteten Proteinansammlung zur Apoptose von Melanozyten führt.

Es erhöht auch die Brustkrebsrate dramatisch (600-fach) innerhalb von ein bis fünf Jahren nach den ersten Symptomen von Vitiligo. Eine Funktion von Melanozyten besteht darin, Chemokine zu produzieren, aber ich konnte keine Informationen darüber finden, welche.

Welche Chemokine werden von Melanozyten produziert?


Grenzen in der Immunologie

Die Zugehörigkeiten der Herausgeber und Gutachter sind die neuesten Angaben in ihren Loop-Forschungsprofilen und spiegeln möglicherweise nicht ihre Situation zum Zeitpunkt der Überprüfung wider.


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    Überproduktion von Th2-spezifischen Chemokinen bei NC/Nga-Mäusen mit atopischer Dermatitis-ähnlichen Läsionen

    1 Klinik für Molekulare Präventivmedizin, Universität Tokio, Tokio 113-0033, Japan 2 Klinik für Dermatologie, Marselisborg Hospital, Universität Aarhus, 8000 Aarhus C, Dänemark 3 Klinik für Dermatologie, School of Medicine, Universität Tokio, Tokio 113- 0033, Japan 4 Department of Bacteriology, School of Medicine, Kinki University, Osaka 589-8511, Japan 5 Laboratory of Cancer Biology and Molecular Immunology, Graduate School of Pharmacology, University of Tokyo, Tokio 113-0033, Japan 6 Department of Dermatology, Mie Universität, Medizinische Fakultät, Mie 547-8507, Japan

    Adresskorrespondenz an: Kouji Matsushima, Department of Molecular Preventive Medicine, School of Medicine, University of Tokyo, 7-3-1 Hongo, Bunkyo-ku, Tokyo 113-0033, Japan. Fax: 81-3-5684-2297 E-Mail: [email protected]

    Artikel von Vestergaard, C. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Yoneyama, H. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Nakamura, K. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Terashima, Y. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Irimura, T. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Mizutani, H. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

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    Artikel von Matsushima, K. finden in: JCI | PubMed | Google Scholar

    Veröffentlicht am 15. Oktober 1999 - Mehr Infos

    Wir haben die Expression von Chemokinen und ihren Rezeptoren in atopischen Dermatitis-ähnlichen (AD-ähnlichen) Läsionen von NC/Nga-Mäusen untersucht. Solche Läsionen entwickeln sich, wenn die Mäuse unter herkömmlichen Bedingungen gehalten werden, aber nicht, wenn sie von bestimmten Krankheitserregern isoliert gehalten werden. Das Thymus- und Aktivierungs-regulierte Chemokin TARC wird unerwartet stark in der basalen Epidermis von 14 Wochen alten Mäusen mit Läsionen exprimiert, während es in der Haut ohne Läsionen nicht exprimiert wird. Die Produktion von TARC durch Keratinozyten wurde durch Kultivieren von murinen keratinozytären Zelllinienzellen (PAM212) mit TNF-&agr;, IFN-&ggr; oder IL-1&bgr; bestätigt. Die Expression eines anderen Th2-Chemokins, des von Makrophagen abgeleiteten Chemokins (MDC), wurde in der Haut von Mäusen beobachtet, die sowohl unter konventionellen als auch unter pathogenfreien Bedingungen gehalten wurden, aber die Expression von MDC war in der Haut mit Läsionen um ein Vielfaches erhöht. Als zellulärer Ursprung von MDC wurden dermale dendritische Zellen identifiziert. Die Infiltration der Haut durch IL-4-produzierende T-Zellen und Mastzellen sowie die Zunahme der CCR4-mRNA in der Haut fielen mit der Entwicklung von AD-Läsionen zusammen. Diese Beobachtungen weisen darauf hin, dass TARC und MDC aktiv an der Pathogenese von AD-ähnlichen Läsionen bei NC/Nga-Mäusen beteiligt sind und dass diese Th2-Chemokine neue Ziele für die Interventionstherapie von AD beim Menschen sein könnten.

    Die atopische Dermatitis (AD) ist ein klinisches Syndrom, das durch juckende und ekzematöse Hautläsionen an charakteristischen Stellen sowie andere klinische Haupt- und Nebensymptome gekennzeichnet ist (1, 2). AD wird im Allgemeinen als eine genetische Störung des Immunsystems angesehen, wobei Patienten häufig eine Familienanamnese von AD haben (2, 3). Es wurde vermutet, dass ein primärer ektodermaler Defekt zu einer Störung der T-Zell-Reifung führt (4). Darüber hinaus wurde als ätiologischer Faktor eine Reduktion von Ceramiden in atopischer Haut beschrieben, die zu einer gestörten Hautbarriere führt (5). Die Hautläsionen sind durch infiltrierende Lymphozyten, Monozyten/Makrophagen und vollständig granulierte Mastzellen (6) und Eosinophile (7) gekennzeichnet. Eine erhöhte Anzahl von dermalen dendritischen Zellen (DCs) und epidermalen Langerhans-Zellen wurde auch in den Hautläsionen von AD beobachtet (8, 9). Die Lymphozyten, die die Hautläsionen der AD infiltrieren, sind, zumindest in der Anfangsphase der Krankheit, T-Zellen vom Th2-Typ, die IL-4, IL-5 und IL-10 produzieren (10), auch wenn in späteren Stadien der Krankheit werden Cytokine vom Th1-Typ, wie IFN-γ, in AD-Läsionen produziert (2, 10, 11). Die IgE-Spiegel im Kreislauf sind bei den meisten, aber nicht allen Patienten mit AD erhöht (2), und dies wird der hohen Produktion von IL-4 zugeschrieben, einem Induktor der IgE-Produktion (12).

    Der NC/Nga-Mäusestamm stammt von japanischen Phantasiemäusen und wurde 1957 von K. Kondo als Inzuchtstamm etabliert (13). Es wurde berichtet, dass die Maus bestimmte Eigenschaften wie eine hohe Anfälligkeit für Bestrahlung und einen durch Ovalbumin induzierten anaphylaktischen Schock aufweist (13, 14). Es wurde auch berichtet, dass die NC/Nga-Mäuse in einer konventionellen Umgebung einen ekzematösen Zustand entwickeln, jedoch nicht, wenn sie unter spezifischen pathogenfreien (SPF) Bedingungen gehalten werden (15). Das Ekzem entwickelt sich im Alter von 8 Wochen, mit maximaler Aktivität nach etwa 17 Wochen mit Läsionen, die durch Ödeme, Blutungen, Erosion, Trockenheit und Alopezie gekennzeichnet sind, die typischerweise an den Ohren, am Rücken und am Hals sowie im Gesichtsbereich lokalisiert sind. Die betroffenen Mäuse zeigen auch eine Wachstumsverzögerung. Serologisch ist der IgE-Spiegel ab einem Alter von 8 Wochen zeitgleich mit dem Auftreten der Hautläsionen deutlich erhöht, während der IgG-Spiegel bis zum Alter von 12 Wochen unverändert bleibt. Die Läsionen zeigen eine ausgeprägte Hyperkeratose und etwas Parakeratose, Lymphozyteninfiltration mit einem hohen CD4/CD8-Verhältnis, Makrophageninfiltration und Mastzell- und Eosinophilendegranulation. IL-4 und IL-5 werden beide von Mastzellen in den Läsionen produziert, während CD4 + -Zellen nur IL-4 und in späteren Stadien auch IFN-γ produzieren (15). Die B-Zellen der NC/Nga-Maus weisen auch eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber CD40-Liganden und IL-4 auf, was vermutlich auf eine verstärkte Aktivierung der Janus-Kinase 3 (JAK3) zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigen B-Zellen der NC/Nga-Maus mit Dermatitis-Läsionen eine konstitutive Tyrosin-Phosphorylierung von JAK3, ein Merkmal, das vermutlich zu einer IgE-Hyperproduktion bei Patienten mit AD führt (16). Die Behandlung der Läsionen der NC/Nga-Maus mit Tacrolimushydrat (FK506) unterdrückt die Hautinfiltration durch CD4 + T-Zellen, Mastzellen und Eosinophile und unterdrückt auch die IL-4-, IL-5- und IgE-Produktion bei diesen Mäusen. Es wurde festgestellt, dass Steroidsalbe eine marginale Wirkung hat (17).

    Chemokine sind kleine sezernierte Proteine, die eine wichtige Funktion bei der Regulierung der Leukozytenmigration haben, aber, wie sich in den letzten Jahren herausgestellt hat, auch in nicht hämatopoetischen Geweben ein breites Spektrum an Funktionen haben (18). Die Chemokine können aufgrund der hochkonservierten Cysteinreste in ihrer Sequenz in CC-, CXC-, C- und CX3C-Chemokine eingeteilt werden. Die Rezeptoren für die Chemokine werden nach der Struktur ihrer Liganden bis heute klassifiziert, CCR 1–9, CXCR 1–5, XCR1 und CX3CR1 wurden identifiziert (19). Kürzlich wurde berichtet, dass Chemokinrezeptoren auf verschiedenen Untergruppen von T-Zellen unterschiedlich exprimiert werden (20 – 23). CXCR3 wird vorzugsweise auf der Th1-Untergruppe (20) exprimiert, während CCR4 auf der Th2-Untergruppe (21) exprimiert wird. CCR5 wird auf der Th1-Untergruppe ( 22 ) exprimiert, kann aber auch auf aktivierten T-Zellen ( 23 ) exprimiert werden. Die Liganden für CCR4 sind Thymus- und Aktivierungs-reguliertes Chemokin (TARC) (24) und von Makrophagen abgeleitetes Chemokin (MDC) (25). TARC ist ein CC-Chemokin mit einer Molekularmasse von ungefähr 8 kDa (26) und wird von DCs synthetisiert, die sich von Monozyten mit GM-CSF, IL-3 und IL-4 (27) unterscheiden. In ähnlicher Weise ist MDC ein CC-Chemokin mit einer Molekülmasse von 8 kDa, das von von Monozyten abgeleiteten Makrophagen synthetisiert wird (28). Beide sind chemotaktisch für eine Fraktion von CD4 + CD45RO + T-Zellen, die polarisiert sind, um Th2-Zytokine zu produzieren (21). MDC und TARC teilen 37% Identität und werden beide von Chromosom 16 (27, 29) kodiert, im Gegensatz zu anderen CC-Chemokinen, von denen viele von Chromosom 17 (18) kodiert werden.

    Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen, dass TARC, das von basalen Keratinozyten produziert wird, und MDC, das von dermalen DC produziert wird, eine bedeutende Rolle bei der Rekrutierung von Th2-Lymphozyten zu AD-ähnlichen Hautläsionen spielen können und dass ein Glukokortikoid bei der Behandlung der Läsionen der NC/ Nga-Maus.

    Mäuse. Männliche und weibliche SPF, 8 Wochen alte, NC/Nga-Mäuse wurden von SLC (Tokyo, Japan) gekauft. Diese wurden in 2 Gruppen eingeteilt, wobei eine Gruppe in einer SPF-Umgebung und die andere unter konventionellen Bedingungen gehalten wurde. In jeder der 2 Gruppen wurden die Mäuse verpaart und die Nachkommen für Experimente verwendet. Alle Tierversuche entsprachen den Standards der Richtlinien der Universität Tokio.

    Steroidbehandlung. Unter normalen Bedingungen gehaltene Mäuse mit voll entwickelten Hautläsionen wurden mit Steroidsalbe (0,05% Clobetasolepropionat) (Glaxo, Tokio, Japan) behandelt, indem die Salbe auf die betroffene Region von den Ohren bis zur Mitte des Rückens aufgetragen wurde. Die Behandlung wurde ab dem Alter von 14 Wochen einmal täglich für 7 Tage wiederholt. Als Negativkontrolle wurden gleichaltrige Mäuse mit den gleichen Läsionen nur mit Vehikel (Petroleum Jelly alba) behandelt.

    Hautbiopsien. Die Mäuse wurden durch Dislokation des Halses getötet, wobei die Rückenhaare mit Enthaarungscreme (Kanebo, Tokyo, Japan) entfernt worden waren. Eine Fläche von ca. 1,5 × 1,5 cm 2 wurde ausgeschnitten und das Unterhautfett und die Blutgefäße wurden vorsichtig abpräpariert.

    Histologie. Hautbiopsien wurden mit 10 % Formalin in neutralem Puffer für mindestens 16 Stunden fixiert und in Paraffin eingebettet. Entparaffinierte Schnitte (3–5 µm dick) wurden mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt und lichtmikroskopisch analysiert.

    Herstellung von Antikörpern gegen MDC. Ein 21 Aminosäuren langes MDC-Peptid aus den Aminosäuren 38–58 wurde synthetisiert (PerSeptive Biosystems/Vestec Products, Tokio, Japan) und mit Maleimidobenzoyl . an Keyhole-Napfschnecken-Hämocyanin (KLH Calbiochem-Novabiochem Corp., San Diego, Kalifornien, USA) gekoppelt -n-Hydroxysuccinimidester (MB Pierce Chemical Co., Rockford, Illinois, USA).Die Aminosäuresequenz des Fragments war QDYIRHPLPSRLVREPPWTS. Das resultierende KLH-MB-Domänen-fusionierte Protein wurde unter Verwendung einer Sephadyl S-200HR-Säule (Pharmacia Biotech AB, Uppsala, Schweden) isoliert, wonach das fusionierte Protein in CFA emulgiert und zur Immunisierung von 2 weißen Neuseeland-Kaninchen nach 3-, 2-, 2- und 1-wöchige Intervalle. Den Kaninchen wurde Blut abgenommen und die Seren erhalten, und die resultierende Antikörperspezifität wurde in einem ELISA getestet. Es wurde keine Kreuzreaktivität mit anderen Maus-Chemokinen, einschließlich TARC, JE und Makrophagen-Entzündungsprotein-2 (MIP-2), gefunden.

    Immunhistochemie. Hautbiopsien wurden in Tissue-Tek OCT-Verbindung (Miles Inc., Elkhart, Indiana, USA) eingebettet, in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Das Gewebe wurde mit einem Kryostaten in 8-μm-Schnitte geschnitten und danach mit dem ersten Antikörper inkubiert. Die verwendeten Antikörper waren Kaninchen-Anti-Maus-MDC-Polyantikörper, ein Ratten-Anti-Maus-CD4-mAb (RM4-5, PharMingen, San Diego, Kalifornien, USA), ein Ratten-Anti-Maus-CD8-mAb (53-6,7 PharMingen), ein Ratten-Anti- -Maus DEC-205 mAb (NLDC-145 BMA Biomedicals, Genf, Schweiz), ein Ratten-Anti-Maus-MHC II (ER-TR3 BMA Biomedicals), ein Ratten-Anti-Maus-c-Bausatz mAb (ACK45 PharMingen), ein Ratten-Anti-Maus-IL-4-mAb (BVD6-24G2 PharMingen), ein Ratten-Anti-Maus-LOM-14-mAb (30) und ein Hamster-Anti-Maus-TARC-mAb (31). Als Negativkontrolle wurde ein Ratten-IgG, ein Hamster-IgG oder ein Kaninchen-IgG verwendet. Nach der Färbung mit den ersten Antikörpern wurden die Proben entweder mit einem Meerrettichperoxidase-konjugierten (HRP-konjugierten) Ziegen-Anti-Hamster-IgG (Southern Biotechnology Associates Inc., Birmingham, Alabama, USA), einem HRP-konjugierten Ziegen-Anti-Ratte-IgG inkubiert IgG (BioSource International, Camarmillo, Kalifornien, USA) oder ein mit alkalischer Phosphatase konjugiertes Esel-Anti-Ratten-IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories Inc., West Grove, Pennsylvania, USA). Die Reaktion wurde entweder mit einem AEC Substrate Kit für Peroxidase oder einem Vector Red Alkaline Phosphatase Substrate Kit I (beide von Vector Laboratories, Burlingame, Kalifornien, USA) betrachtet.

    Die doppelte Immunfärbung wurde wie von Matsuno et al. ( 32 ). Aceton-fixierte 6-μm-Gefrierschnitte wurden mit den ersten Ratten- oder Kaninchen-Antikörpern 1 Stunde lang inkubiert. Nach sequenzieller Inkubation mit alkalischer Phosphatase-konjugiertem Anti-Ratten- oder Kaninchen-IgG für 45 Minuten wurden die markierten Zellen mit Vector Red oder Vector Blue (Vector Laboratories) rot oder blau gefärbt. Die Proben wurden dann mit dem zweiten Ratten-IgG inkubiert und gebundene mAbs wurden mit einem HRP-markierten Anti-Ratten-IgG nachgewiesen und mit 3,3′-Diaminobenzidin (DAB Wako Chemicals, Dallas, Texas, USA)-Substratlösung braun oder rot gefärbt oder Vektor-Nova-Rot. Die Objektträger wurden mit Mayers Hämatoxylin gegengefärbt.

    Expression von Chemokinen, Zytokinen und Chemokinrezeptoren in Hautbiopsien. Gesamt-RNA wurde aus den Hautbiopsien mit RNAzol (Biotecx Laboratories, Houston, Texas, USA) nach Herstellerangaben isoliert und mit M-MLV RT 200 U/20 µL Reaktionsvolumen (Sawaday, Tokyo, Japan) in DNA revers transkribiert ), RNase-Inhibitor 40 U/20 µL Reaktionsvolumen (Sawaday), Random Primer (Promega Corp., Madison, Wisconsin, USA) 100 µg/20 µL Reaktionsvolumen und 3 µg RNA nach Herstellerangaben. Ein Mikroliter der resultierenden cDNA wurde durch PCR amplifiziert, wobei AmpliTaq im Puffer mit MgCl . verwendet wurde2 (Perkin-Elmer Corp., Norwalk, Connecticut, USA Roche Molecular Systems, Branchburg, New Jersey, USA). Der Sense-Primer für TARC war 5'-CAGGAAGTTGGTGAGCTGGTATA-3' und der Antisense-Primer war 5'-TTGTGTTCGCCTGTAGTGCATA-3'. Der Sense-Primer für MDC war 5'-TCTGATGCAGGTCCCTATGGT-3' und der Antisense-Primer war 5'-TTATGGAGTAGCTTCTTCAC-3'. Der Sense-Primer für IL-4 war 5'-CAGCTAGTTGTCATCCTGCTCTTC-3' und der Antisense-Primer war 5'-GCCGATGATCTCTCTCAAGTGA-3'. Der Sense-Primer für IFN-γ war 5'-CTCAAGTGGCATAGATGT-3' und der Antisense-Primer war 5'-GAGATAATCTGGCTCTGCAGGATT-3'. Der Sense-Primer für Eotaxin war 5'-AGAGCTCACAGCGCTTCTATT-3' und der Antisense-Primer war 5'-GGTGCATCTGTTGTTGGTGATT-3'. Der Sense-Primer für CCR3 war 5'-TTGCAGGACTGGCAGCATT-3' und der Antisense-Primer war 5'-CCATAACGAGGAGAGGAAGAGCTA-3'. Der Sense-Primer für CCR4 war 5'-TCTACAGCGGCATCTTCTTCAT-3' und der Antisense-Primer war 5'-CAGTACGTGTGGTTGTGCTCTG-3'. Der Sense-Primer für CCR5 war 5'-CATCGATTATGGTATGTCAGCACC-3' und der Antisense-Primer war 5'-CAGAATGGTAGTGTGAGCAGGAA-3'. Der Sense-Primer für CXCR3 war 5'-ATCAGCGCTTCAATGCCAC-3' und der Antisense-Primer war 5'-TGGCTTTCTCGACCACAGTT-3'. Der Sense-Primer für GAPDH war 5'-AGTATGACTCCACTCACGGCAA-3' und der Antisense-Primer war 5'-TCTCGCTCCTGGAAGATGGT-3'. Die Reaktionsprodukte wurden auf einem 3% Polyacrylamidgel mit Ethidiumbromid betrachtet.

    Quantitative PCR. Um die mRNA der oben erwähnten Zytokine, Chemokine und Chemokinrezeptoren in der Haut zu quantifizieren, wurde eine quantitative PCR unter Verwendung des ABI 7700-Sequenzer-Nachweissystems (Perkin-Elmer Applied Biosystems, Foster City, Kalifornien, USA) durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers hergestellt, um Endkonzentrationen von 1 × PCR-Puffer A 200 μM dATP, dGTP und dCTP je 400 μM dUTP 4 mM MgCl2 1,25 U AmpliTaq Gold DNA-Polymerase und 200 μM jedes Primers zu ergeben. Zu den separaten Reaktionen wurden auch die folgenden Target-Hybridisierungssonden (100 &mgr;M) zum spezifischen Nachweis hinzugefügt. Für MDC wurde die Sonde 5'-CCAATGTGGAAGACAGTATCTGCTGCCA-3' hinzugefügt. Für CCR5 wurde die Sonde 5'-TACCTGCTCAACCTGGCCATCTCTGA-3' hinzugefügt. Für GAPDH wurde die Sonde 5'-AACGGCACAGTCAAGGCCGAGAAT-3' hinzugefügt. Die Sonde wurde mit einem Reporter-Fluoreszenzfarbstoff, FAM (6-Carboxyflourescein), am 5'-Ende markiert. Die Temperaturwechselbedingungen wurden auf 50 °C für 2 Minuten und 95 °C für 10 Minuten eingestellt, gefolgt von 50 Amplifikationszyklen bei 95 °C für 15 Sekunden und 55 °C für 1,5 Minuten zum Denaturieren bzw. Annealing/Extension. Um die mRNA-Expression zu vergleichen, wurden die Ergebnisse als relative Werte unter Verwendung von GAPDH als interner Referenz und den Proben von Mäusen, die unter SPF-Bedingungen gehalten wurden, als Gesamtreferenz verglichen. Der relative Wert wurde nach folgender Formel berechnet: relativer Ausdruck = 2[ –(ΣVs/Ns – ΣGAPDHs/Ns)-(ΣVr/Nr – ΣGAPDHr/Nr) ], wobei Vs bezeichnet das ABI-Prism-Signal einer gegebenen Probe, Ns ist die Anzahl der Proben, GAPDHs ist das ABI Prism-Signal für GAPDH in derselben Probe, Vr das ABI-Prism-Signal für dieselbe Probe, aber in der gesamten Referenzprobe ist, und GAPDHr ist das ABI Prism GAPDH-Signal in der Referenzprobe. Die Anzahl der Proben war n = 3 in jeder Gruppe.

    TARC-Produktion durch Maus-Keratinozyten in vitro. Murine Keratinozyten (PAM 212 American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, USA) wurden in RPMI-1640 (GIBCO BRL, Rockville, Maryland, USA) und 10 % FCS in einer Konzentration von 4 × 10 4 Zellen/ml in 1- ml-Wells für 4 Tage und wurden mit 1 der folgenden Zytokine 10 ng/ml TNF-α (R&D Systems Inc., Minneapolis, Minnesota, USA) 100 ng/ml TNF-α und 10 ng/ml GM-CSF (Genzyme Japan, Tokio, Japan) 1,0 ng/ml IFN-γ (R&D Systems Inc.) 100 ng/ml IFN-γ und 10 pg/ml IL-1β (Genzyme Japan) und 1 ng/ml IL-1β 1 und 100 pg /ml oder 1 ng/ml IL-4 (Becton Dickinson und Co., Franklin Lakes, New Jersey, USA). Alle Experimente wurden dreifach durchgeführt, mit Ausnahme des IL-4-Experiments, das nur zweifach durchgeführt wurde. Nach 4 Tagen wurden die Überstände der Zellkulturen isoliert und bis zur Verwendung bei –80°C gelagert. Um die Produktion von TARC zu beurteilen, wurde ein ELISA durchgeführt. Kurz gesagt wurde eine 96-Well-Platte (F96 MaxiSorp, NUNC A/S, Roskilde, Dänemark) mit Hamster-Anti-Maus-TARC-Polyantikörper ausplattiert und mit 1 mg/ml BSA in PBS blockiert, wonach die Überstände zugegeben wurden. Der zweite Antikörper war ein biotinylierter Kaninchen-Anti-TARC, und nach der Inkubation wurde das Ergebnis mit HRP-Streptavidin gemäß den Anweisungen des Herstellers (Vector Laboratories) betrachtet und mit einem Emax ELISA-Lesegerät bei 450 nm Wellenlänge gelesen.

    Die Nachkommen der NC/Nga-Mäuse wurden in 2 Gruppen gehalten: 1 Gruppe unter SPF-Bedingungen und eine weitere Gruppe unter konventionellen Bedingungen. Die unter konventionellen Bedingungen gehaltenen Mäuse begannen sich im Alter von 8 Wochen zu kratzen, wobei die Haut zu diesem Zeitpunkt trocken und schuppig wurde. Innerhalb der nächsten 2 Wochen entwickelten die Mäuse Läsionen an den Ohren, am Hals und im Gesicht. Die Läsionen auf dem Rücken waren von den Ohren bis zur Mitte des Rückens lokalisiert und reichten nach vorne bis zur hinteren Achsellinie. Die Läsionen bestanden aus Exkoriationen und nodulären Infiltrationen, die durch die Haut tastbar waren (Abbildung 1a). Die knotigen Läsionen fehlten, nur an den Ohren und im Gesicht waren Exkoriationen zu finden. Die unter SPF-Bedingungen gehaltenen Mäuse entwickelten keine Läsionen (Abbildung 1b). Schwangere weibliche Mäuse, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden, entwickelten weniger schwere Läsionen.

    Das Auftreten von Hautläsionen bei Mäusen im Alter von 14 Wochen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden (ein) 14 Wochen alt, unter SPF-Bedingungen gehalten (B) und 15 Wochen alt, unter konventionellen Bedingungen gehalten, aber ab dem Alter von 14 Wochen 7 Tage lang mit Steroidsalbe behandelt (C). Das Haar wurde unter Verwendung von Enthaarungscreme wie in Methoden beschrieben entfernt. Hämatoxylin-Eosin-Färbung von in Paraffin eingebetteten Schnitten (3–5 µm dick) aus Hautbiopsien von 14 Wochen alten Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden (D) und SPF-Bedingungen (e) und von 15 Wochen alten Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten und 7 Tage lang mit Steroiden behandelt wurden (F). Die gezeigten Ergebnisse sind repräsentativ für 3 Mäuse in jeder Gruppe. Beachten Sie die Verdickung der Epidermis und der Keratinschicht in D im Vergleich zu e, und die Kerne der Keratinozyten sind in der Keratinschicht sichtbar. Beachten Sie auch die bemerkenswerte Wirkung der Steroidsalbe bei der Unterdrückung sowohl der Infiltration in die Dermis als auch des Wachstums der Epidermis. ×100.

    Die zelluläre Zusammensetzung des Infiltrats in den Hautläsionen. In Paraffin eingebettete Schnitte von sowohl läsionalen (14 Wochen alten Mäusen, die unter herkömmlichen Bedingungen gehalten wurden) als auch nichtläsionalen (14 Wochen alten Mäusen, die unter SPF-Bedingungen gehalten wurden) wurden hergestellt. Die läsionale Haut zeigte Hyperkeratose, Akanthose und Parakeratose in der Epidermis (Abbildung 1d) im Gegensatz zur normalen nichtläsionalen Haut (Abbildung 1e). Die läsionale Haut zeigte auch ein starkes Infiltrat in der Dermis mit dichtem Bindegewebe, während die nicht läsionale Haut keine Infiltration zeigte. Die die Dermis infiltrierenden Zellen wurden durch Immunfärbung von Gefrierschnitten identifiziert. Die Lymphozyten, die in die läsionale Haut eindringen, waren hauptsächlich CD4 + -Zellen (Abbildung 2a), mit einigen wenigen CD8 + -Zellen (Daten nicht gezeigt). Die dermalen Makrophagen in läsionaler (Abbildung 2b) und nicht-läsionaler (Abbildung 2c) Haut wurden mit einem Antikörper gegen MMGL (LOM14) identifiziert und die Anzahl der Makrophagen in der läsionalen Haut (Tabelle 1) im Vergleich zur nicht-läsionalen Haut erhöht. Es wurde überwiegend beobachtet, dass sich nicht-lymphoide dendritische Zellen positive (NLDC-positive) Zellen sowohl in der Dermis als auch in der Epidermis ansiedelten (Abbildung 2d). Die NLDC-positiven Zellen in der Epidermis wurden als Langerhans-Zellen angesehen. Zellen in der Dermis und in der Epidermis färbten sich gleichermaßen für MHC II (Abbildung 2e), obwohl die Zahl der MHC II-positiven Zellen in der Dermis wesentlich höher war als die der NLDC-positiven Zellen (Tabelle 1). Die doppelte Immunfärbung zeigte zusätzlich zu einer ähnlichen Morphologie und Verteilung, dass die Zellen, die für NLDC in der Dermis positiv waren, auch für MHC II positiv waren (Abbildung 2f) und als dermale DCs identifiziert wurden. Die verbleibenden MHC II-positiven Zellen hatten eine ähnliche Morphologie und Verteilung wie LOM14-positive Zellen und wurden als Makrophagen identifiziert. Zuletzt sehr große Populationen großer amorpher Zellen, die positiv für c-Bausatz in der Dermis sowohl läsionaler (Abbildung 2g) als auch in geringerer Anzahl (Tabelle 1) nichtläsionaler Haut (Abbildung 2h) wurden als Mastzellen angesehen. Außerdem ist ein c-Bausatz–positive Zellpopulationen von dendritischen Zellen wurden in der Epidermis (Abbildung 2g) der läsionalen Haut gefunden, jedoch nicht in den nichtläsionalen Biopsien. Zellen in der Haut, die c- exprimierenBausatz wurden entweder als Mastzellen ( 33 ) und ihre Vorläufer ( 34 ) oder Melanozyten ( 35 ) beschrieben. Um die c-Bausatz–positive Zellen wurde eine Toluidinblau-Färbung für Mastzellen durchgeführt. Die dendritisch geformten Zellen in der Epidermis wurden nicht mit Toluidinblau gefärbt, was darauf hindeutet, dass es sich um Melanozyten handelte (Daten nicht gezeigt).

    Immunhistochemische Färbung von gefrorenen Schnitten von Hautbiopsien. (ein) CD4-Färbung von Biopsien von 14 Wochen alten Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden. (B und C) MMGL-Färbung von Mäusen unter konventionellen Bedingungen (B) und SPF-Bedingungen (C). (D) NLDC-Färbung von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden. (e) MHC II-Färbung von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden. (F) Doppelte Immunfärbung für MHC II (dunkelrot) und NLDC (blau). NLDC-positive Zellen in der Dermis sind ebenfalls positiv für MHC II (Pfeil). MHC II-positive Zellen (Pfeilspitzen) werden als Makrophagen identifiziert. (g und h) C-Bausatz Färbung von Hautbiopsien von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden (g) und SPF-Bedingungen (h). (ich und J) TARC-Färbung der Haut von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden (ich) und SPF-Bedingungen (J). (k) MDC-Färbung von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden. (l) Doppelte Immunfärbung für NLDC (braun) und MDC (rot). Etwa 80 % der NLDC-positiven Zellen sind auch MDC-positiv (Pfeil). MDC-produzierende NLDC-positive Zellen (doppelt positive Zellen im Vergleich zu k) werden als dermale DCs identifiziert. (m) IL-4-Färbung von Mäusen, die unter herkömmlichen Bedingungen gehalten wurden. (n) Doppelte Immunfärbung für CD4 (blau) und IL-4 (dunkelrot). Die meisten CD4 + (blau gefärbt mit Zelloberfläche) Zellen sind positiv für IL-4 (dunkelrot gefärbt mit Zytoplasmapfeil). Einige Zellen zeigen einfach positiv für IL-4 (Pfeilspitzen), die als Mastzellen identifiziert werden. Originalvergrößerungen: ×100 (einD, gJ), ×200 (e, f, k, m, und n), ×400 (l).

    Die zelluläre Zusammensetzung des Infiltrats in den Hautläsionen.

    Erhöhte Expression von TARC in der Haut mit Alterung und Verschlimmerung der Läsionen. Gesamt-RNA wurde aus Hautbiopsien isoliert, die von Mäusen im Alter von 6, 8 und 12 Wochen erhalten wurden, und RT-PCR wurde wie in Methoden beschrieben durchgeführt. In der Haut von Mäusen, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden, wurde TARC bereits im Alter von 6 Wochen schwach und nach 8 Wochen auf dem gleichen Niveau exprimiert. Im Alter von 12 Wochen, als die Hautläsionen auffällig wurden, war die Expression von TARC deutlich erhöht (Abbildung 3a). In der Haut von Mäusen, die unter SPF-Bedingungen gehalten wurden, konnte keine TARC-Expression nachgewiesen werden (Abbildung 3a). Dies war auch der Fall, wenn eine quantitative RT-PCR durchgeführt wurde (Daten nicht gezeigt, da kein relativer Wert angegeben werden kann). Unter Verwendung eines Anti-TARC-mAb wurde die Produktion von TARC hauptsächlich auf die Basalschicht der Epidermis lokalisiert (Abbildung 2i). Darüber hinaus konnte in der Haut von Mäusen, die unter SPF-Bedingungen gehalten wurden, durch Immunfärbung keine TARC-Produktion beobachtet werden (Abbildung 2j).

    (ein) RT-PCR von mRNA, die aus Hautbiopsien isoliert wurde, die zu den angegebenen Zeitpunkten entnommen wurden. Links: Expression von IFN-γ, MDC, TARC und GAPDH von Mäusen, die im Alter von 6, 8 und 12 Wochen unter SPF-Bedingungen gehalten wurden. Rechts: Expression der mRNA zu den gleichen Zeitpunkten, jedoch von Mäusen, die unter normalen Bedingungen gehalten wurden. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 6, 4 und 6 Mäuse unter SPF-Bedingungen und 6, 4 und 6 Mäuse unter normalen Bedingungen betrug das Verhältnis von Männchen zu Weibchen 1:1. (B) RT-PCR durchgeführt an der Haut von 14 Wochen alten Mäusen, die unter normalen Bedingungen (oben) und SPF-Bedingungen (Mitte) gehalten wurden, und von 15 Wochen alten Mäusen, die unter normalen Bedingungen gehalten und ab einem Alter von 14 Wochen mit Steroiden behandelt wurden (Unterseite). Die x Achse zeigt die untersuchte Genexpression. Die Ergebnisse sind repräsentativ für 6, 6 bzw. 3 unabhängige Experimente.

    Produktion von TARC durch Keratinozyten in vitro. Wenn Zellen der murinen keratinocytischen Zelllinie (PAM 212) kultiviert und mit verschiedenen Zytokinen stimuliert wurden, konnte die Produktion von TARC durch TNF-&agr;, IFN-&ggr; Die durch 10 ng/ml TNF-α induzierte Produktion von TARC war bei allen Konzentrationen signifikant höher als die durch IFN-γ und IL-1β induzierte Produktion (P < 0,05), wohingegen es bei allen Konzentrationen keinen signifikanten Unterschied in der Produktion von TARC gab, die durch 100 ng/ml TNF-&agr; und durch IFN-&ggr; und IL-1&bgr; induziert wurde. Weder GM-CSF noch IL-4 konnten bei keiner der getesteten Konzentrationen TARC induzieren, und es gab keine nachweisbare Produktion von TARC durch unstimulierte Maus-Keratinozyten.

    Die Ergebnisse des TARC ELISA wurden an den Kulturüberständen von Keratinozyten-Zellkulturen nach 4 Tagen Kultivierung durchgeführt. Die x Achse zeigt die Stimuli an, die den Kulturen hinzugefügt wurden, und die ja Achse ist die TARC-Menge in den Kulturüberständen der Zellkulturen. Die Ergebnisse sind die Durchschnittswerte, die aus 3 verschiedenen Experimenten erhalten wurden, wobei jeder Wert in Dubletts bestimmt wurde. Fehlerbalken zeigen SD an.

    MDC wird sowohl in läsionaler als auch in nicht läsionaler Haut konstitutiv produziert. Die eben beschriebene RNA wurde auch auf die Expression von MDC untersucht, die ab dem Alter von 6–14 Wochen sowohl in läsionaler als auch in geringerem Maße in nicht läsionaler Haut exprimiert wurde (Abbildung 3, a und b). Mittels quantitativer RT-PCR wurde das Verhältnis zwischen der Expression in der läsionalen und nicht läsionalen Haut zu 6 gefunden (Abbildung 5). Die Färbung mit Anti-MDC-Polyantikörpern zeigte, dass die produzierenden Zellen große runde Zellen sind, die sich in der Dermis in der Haut der Läsion befinden (Abbildung 2k). In nichtläsionaler Haut sahen die produzierenden Zellen ähnlich aus, waren jedoch zahlenmäßig geringer und befanden sich tiefer in der Dermis (Daten nicht gezeigt). Die meisten MDC-produzierenden Zellen waren bei der NLDC-Färbung positiv (Abbildung 21), was darauf hinweist, dass diese Zellen dermale DCs waren.

    Quantitative RT-PCR für MDC und CCR5. Die Expressionsverhältnisse für MDC und CCR5 zwischen Mäusen, die in normalen und SPF-Bedingungen gehalten wurden, wurden unter Verwendung von GADPH als interner Referenz und der Expression in der SPF-Haut als Basislinie berechnet. Die Ergebnisse wurden aus 3 unabhängigen Experimenten berechnet. Fehlerbalken zeigen SD an.

    Expression von Zytokinen, Chemokinen und Chemokinrezeptoren. Die Expression des Rezeptors für TARC und MDC, CCR4, wurde in 14 Wochen alten Mäusen mittels RT-PCR untersucht. Das Ergebnis zeigte, dass mRNA für CCR4 in läsionaler Haut exprimiert wird, aber nicht in nicht läsionaler Haut (Abbildung 3b). Ein ähnliches Ergebnis wurde mit quantitativer RT-PCR erhalten (Daten nicht gezeigt). IL-4 und IFN-γ wurden nur in läsionaler Haut exprimiert (Abbildung 3b), und die Zellen, die IL-4 produzieren, wurden als Mastzellen und Lymphozyten identifiziert (Abbildung 2, m und n). Eotaxin wurde mittels RT-PCR sowohl in läsionaler als auch in nicht läsionaler Haut exprimiert. Die Rezeptoren CCR3 und CCR5 wurden sowohl in läsionaler als auch in nicht läsionaler Haut exprimiert (Abbildung 3b), aber das Niveau der CCR5-Expression war in läsionaler Haut zehnmal höher als in nichtläsionaler Haut (Abbildung 5). CXCR3 wurde in läsionaler oder nicht läsionaler Haut nicht exprimiert.

    Wirkung der topischen Steroidbehandlung.Wenn 14 Wochen alte Mäuse, die unter normalen Bedingungen gehalten wurden, 7 Tage lang mit Steroidsalbe behandelt wurden (n = 3) zeigten die Läsionen am Rücken eine starke Regression (Abbildung 1c). Die Verletzung an den Ohren und am Rücken schien zu heilen, aber die Haut war sehr dünn. Die Zahl der CD4 + -Zellen in der Haut sank unter normale Werte (Tabelle 1) und die der CD8 + -Zellen kehrte auf normale Werte zurück (Tabelle 1). Die Anzahl der Makrophagen und c-Bausatz–positive Zellen nahmen im Vergleich zu unbehandelter Haut mit Läsionen ab, kehrten jedoch nicht auf normale Werte zurück. Die Zahl der NLDC-positiven Zellen nahm in der Epidermis und Dermis im Vergleich zu nichtläsionaler Haut ab, ebenso die Zahl der MHC II-positiven Zellen in steroidbehandelter Haut (Tabelle 1). Die Expression von Zytokinen, Chemokinen und Chemokinrezeptoren wurde sowohl mit RT-PCR (Abbildung 3b) als auch mit quantitativer RT-PCR (Daten nicht gezeigt) bewertet. In keinem Fall konnte eine Expression der mRNA der Chemokine, Zytokine und Chemokinrezeptoren nachgewiesen werden. Die mit Vehikel behandelten Mäuse zeigten keinen Unterschied zu den 14 Wochen alten Mäusen, die unter herkömmlichen Bedingungen gehalten wurden (Daten nicht gezeigt).

    Die NC/Nga-Maus wurde als Modell für die menschliche AD vorgeschlagen. Die Hautläsionen, die sich bei diesen Mäusen entwickelten, wenn sie unter herkömmlichen Bedingungen gehalten wurden, ähneln denen der menschlichen AD, mit einer deutlichen CD4 + -Lymphozyteninfiltration, begleitet von Makrophagen, Eosinophilen und Mastzellen (15). Es wurde auch gezeigt, dass dieser Mausstamm wie bei menschlichen Patienten mit AD einen Anstieg der Serum-IgE-Spiegel aufweist, was auf eine verstärkte Phosphorylierung von JAK3 bei diesen Mäusen und wahrscheinlich auch bei menschlichen Patienten mit AD zurückzuführen ist (16). Der auslösende Faktor der Dermatitis ist nicht bekannt, aber wenn BALB/c-Mäuse unter konventionellen Bedingungen mit den NC/Nga-Mäusen gehalten wurden, entwickelten sie keine Läsionen, was darauf hindeutet, dass ein genetischer Faktor neben einem Umweltfaktor für die Entwicklung der Dermatitis (15). AD wurde zumindest in der Anfangsphase als eine Krankheit vom Th2-Typ beschrieben, da Lymphozyten, die in die Haut eindringen, hauptsächlich IL-4, IL-5 und IL-10 produzieren (10). Der überwiegend auf humanen T-Zellen vom Th2-Typ exprimierte Chemokinrezeptor ist CCR4 (21, 23), und die Liganden für diesen Rezeptor sind TARC (25) und MDC (24). Es wurde gezeigt, dass das TARC/MDC-CCR4-System am Th2-vermittelten Krankheitsprozess beteiligt ist, sogar in Mausmodellen (31, 36). Die Produktion von IL-4 und IL-5 in Hautläsionen der NC/Nga-Mäuse wurde beschrieben (15), und die Produktion von IL-4 in Mastzellen und Lymphozyten in der Dermis der läsionalen Haut wird ebenfalls in dieser Studie gezeigt.

    Basierend auf diesen Ergebnissen wurde postuliert, dass die Pathogenese der Hautläsionen bei den NC/Nga-Mäusen durch Zytokine vom Th2-Typ diktiert wird, und die Expression der Liganden für CCR4 in diesen Mäusen wurde in dieser Studie untersucht. Die Überexpression von TARC durch die basalen Keratinozyten während der Entwicklung der Läsionen in der Haut der NC/Nga-Mäuse legt nahe, dass TARC eine Schlüsselrolle bei der Pathogenese der Läsionen spielt. Wenn Zellen der keratinocytischen Zelllinie der Maus in Gegenwart mehrerer entzündlicher Zytokine kultiviert wurden, war TNF-&agr; der stärkste Induktor von TARC. Die Induktion von TARC durch das Th1-Zytokin IFN-γ in Keratinozyten war eher unerwartet, stimmt aber mit einer hohen Expression von TARC in der Haut der NC/Nga-Mäuse zu einem Zeitpunkt überein, als eine gleichzeitige Expression von IFN-γ beobachtet wurde. Andererseits induzierte ein Zytokin vom Th2-Typ IL-4 keine TARC-Produktion. Es wurde berichtet, dass TNF-α in Mastzellen in der Haut von AD-Läsionen hochreguliert wird ( 37 ) und die Expression von Adhäsionsmolekülen im Endothel in läsionaler AD-Haut induziert ( 38 ), was auf eine Doppelrolle von TNF-α als Induktor hindeutet von Chemokinen und Adhäsionsmolekülen und wirkt dabei auf 2 verschiedene Moleküle im chemotaktischen Prozess. Keratinozyten produzieren bekanntermaßen mehrere Zytokine, wie IL-1, IL-6 und IL-8 (39), aber dies ist das erste Mal, dass TARC von Keratinozyten produziert wird. Dieser Befund legt nahe, dass TARC, das von aktivierten Keratinozyten produziert wird, ein früher Induktor der Th2-Antwort sein könnte, indem es CCR4 + Th2-T-Lymphozyten an die läsionale Haut anzieht.

    Der zweite Ligand, der den Chemokinrezeptor CCR4 verwendet, ist MDC, und wir fanden eine konstitutive Expression von MDC sowohl in läsionaler als auch in nicht-läsionaler Haut bei Mäusen im Alter von 6–14 Wochen. Unter Verwendung von Anti-MDC-Polyantikörpern wurden die MDC produzierenden Zellen als große runde oder spindelförmige Zellen identifiziert. Die quantitative RT-PCR zeigte einen signifikanten Unterschied in der Expression von MDC. Die Verteilung der MDC-positiven Zellen unterschied sich jedoch in läsionaler und nicht läsionaler Haut, wobei die Zellen tiefer in der Dermis und dem subkutanen Gewebe in der nicht läsionalen Haut im Vergleich zur läsionalen Haut lagen. Diese Ergebnisse weisen auf eine komplexere Rolle von MDC als TARC bei der Pathogenese der AD-ähnlichen Hautläsionen bei den NC/Nga-Mäusen hin. MDC kann unter SPF-Bedingungen als homöostatisches Chemokin wirken und den normalen Leukozytentransport durch die Haut regulieren. Die Bedeutung von TARC und MDC bei der Pathogenese der AD-ähnlichen Erkrankung bei den NC/Nga-Mäusen ist die verstärkte Expression von CCR4-mRNA in der läsionalen Haut, die in der nicht-läsionalen Haut überhaupt nicht exprimiert wurde. Dieser Befund verstärkt auch den Beweis, dass die Hauterkrankung einer Zytokin-Antwort vom Th2-Typ unterliegt. Um festzustellen, ob TARC und MDC selektiv an Th2-vermittelten Hauterkrankungen beteiligt sind, sind weitere Untersuchungen bei anderen durch Kontaktallergene und Infektionserreger induzierten ekzematösen Läsionen erforderlich.

    Eotaxin ist sowohl bei Menschen (41) als auch bei Mäusen (42) als potenter Chemoattraktant für Eosinophile (40) und als Ligand für CCR3 bekannt. In unserer Studie wurde Eotaxin sowohl in läsionaler als auch in nicht läsionaler Haut exprimiert, der Rezeptor wurde jedoch nur in läsionaler Haut exprimiert. Dies steht im Einklang mit der Beschreibung von Eosinophilen als Zellen, die die Haut von AD-Läsionen infiltrieren (7, 15).

    Hinsichtlich der zellulären Zusammensetzung des dermalen Infiltrats in der läsionalen Haut bestätigen unsere Ergebnisse die bereits beobachteten ( 15 ), wobei das Infiltrat aus Lymphozyten mit einem hohen CD4 + /CD8 + -Verhältnis und einer hohen Anzahl von Makrophagen und Mastzellen besteht. Außerdem war die Zahl der NLDC- und MHC II-positiven Zellen in den Hautläsionen erhöht, jedoch mit einer viel höheren Zahl an MHC II-positiven Zellen. Einige der NLDC-positiven Zellen waren auch positiv für MHC II und waren aller Wahrscheinlichkeit nach dermale DCs, aber die verbleibenden MHC II-positiven Zellen waren wahrscheinlich Makrophagen aufgrund ihrer Morphologie und Verteilung von MMGL-positiven Zellen. Darüber hinaus wurde durch doppelte Immunfärbung festgestellt, dass diese NLDC- und MHC II-positiven dermalen DCs die Quelle von MDC in der läsionalen Haut sind. In der Epidermis wurde eine große Zahl von NLDC- und MHC II-positiven Zellen gefunden, die wahrscheinlich Langerhans-Zellen waren.

    Eine einwöchige Steroidbehandlung hatte eine bemerkenswerte Verbesserungswirkung auf die Läsionen der Mäuse, die unter konventionellen Bedingungen gehalten wurden: Die Läsionen verschwanden fast. Eine solche Behandlung hatte jedoch auch negative Auswirkungen, da die behandelte Haut an einigen Stellen sehr dünn wurde. Die Regression der Akanthose und Hyperkeratose kann auf die Entfernung des Juckreizes zurückzuführen sein, der wiederum die Maus daran hindert, sich selbst zu kratzen, wodurch der Lichinifizierungsprozess unterbrochen wird, anstatt eine direkte Wirkung von Steroiden auf die Epidermis zu haben. Mikroskopisch war die Infiltration deutlich reduziert, so dass nur sehr wenige CD4 + -Zellen und fast keine CD8 + -Zellen übrig blieben. Auf der anderen Seite war die Zahl der dermalen Makrophagen immer noch hoch, ebenso wie die Zahl der Mastzellen, was entweder auf die geringere Empfindlichkeit dieser Zellen gegenüber Steroiden oder auf eine längere Umsatzzeit in der Haut zurückzuführen sein könnte. Das hier präsentierte Ergebnis steht offensichtlich im Widerspruch zu den früher berichteten Ergebnissen (17), kann jedoch an einer größeren Menge topischer Steroide liegen, die in dieser Studie verwendet wurden.

    Die hier präsentierten Ergebnisse unterstützen die früheren Berichte über die NC/Nga-Maus als Modell für die menschliche AD. Interessanterweise korrelierten die TARC-Spiegel, die hauptsächlich von den Keratinozyten der Basalschicht in der Haut produziert werden, mit der Schwere der Hautläsionen, während MDC von dermalen DCs sowohl in läsionaler als auch in nicht läsionaler Haut produziert wurde, obwohl die MDC-Produktion in läsionaler Haut anstieg. ebenso wie die Zahl der MDC-produzierenden Zellen. Überraschenderweise konnte TARC, ein Th2-Chemokin, in keratinozytären Zelllinien durch IFN-γ, ein Th1-Zytokin, induziert werden, was zwar mit den Ergebnissen übereinstimmt, die in der Haut der NC/Nga-Maus und auch bei menschlichen Patienten mit AD beobachtet wurden ( 11), ist eine einzigartige Verstärkung der 1 Th-Typ-Antwort durch die andere. Weitere Untersuchungen dieser Beobachtungen beim Menschen sind notwendig, aber dies könnte ein wichtiger Hinweis sein, um die Komplexität der Pathogenese der AD beim Menschen zu untersuchen, da dies einen direkten Zusammenhang zwischen der Th1- und Th2-Antwort in der Haut zeigt.

    Wir danken Joost J. Oppenheim (National Cancer Institute, Frederick, Maryland, USA) für die Vorprüfung des Manuskripts. Diese Studie wurde teilweise durch ein Stipendium von Core Research and Revolutional Science and Technology, Japan Science and Technology Corporation, unterstützt.


    Abstrakt

    Chemokine, eine Superfamilie kleiner zytokinähnlicher Moleküle, regulieren den Leukozytentransport im Körper. In den letzten Jahren haben wir den Übergang immuntherapeutischer Strategien vom Labor zum Krankenbett erlebt. Hier untersuchen wir die Rolle von Chemokinen in der Tumorbiologie und die Entwicklung der Anti-Tumor-Abwehr des Wirts. Wir fassen das aktuelle Wissen über die Expression von Chemokinrezeptoren durch relevante zelluläre Komponenten des Immunsystems und die Rolle ihrer Liganden bei der Organisation der Antitumor-Immunantwort zusammen. Schließlich diskutieren wir aktuelle Erkenntnisse, die darauf hindeuten, dass Chemokine therapeutisches Potenzial als Adjuvanzien oder Behandlungen in der Antitumor-Immuntherapie haben, sowie verbleibende Fragen und Perspektiven für die Übertragung experimenteller Erkenntnisse in die klinische Praxis.


    Diese Arbeit wurde vom National Institute of Arthritis and Musculoskeletal and Skin Diseases Grant AR-047079 (an A. Slominski) und einem Trainingsstipendium des Johnson and Johnson Skin Research Center (für B. Zbytek) unterstützt.

    Die Kosten für die Veröffentlichung dieses Artikels wurden teilweise durch die Zahlung von Seitengebühren bestritten. Der Artikel muss daher hiermit gekennzeichnet werden „Werbung“ gemäß 18 U.S.C. § 1734 nur, um auf diese Tatsache hinzuweisen.

    Wir danken Dr. A. Pisarchik für die Konstruktion des Reportergen-Plasmids, das den humanen POMC-Promotor und das Fragment von Exon 1 enthält. Echtzeit-RT-PCR wurde auf ABI Prism 7770 im Molecular Resource Center der University of Tennessee, Memphis, TN . durchgeführt . Auch die hervorragende administrative Unterstützung von Christine Crawford wird gewürdigt.


    Abstrakt

    Atherosklerose ist eine chronisch-entzündliche Erkrankung großer Arterien, die unter anderem durch einen kontinuierlichen Einstrom von Monozyten in den Subendothelialraum, anschließende Makrophagenakkumulation und Schaumzellbildung gekennzeichnet ist. Chemokine und ihre Rezeptoren steuern den Handel und das Schicksal von Monozyten von der Geburt bis zum Tod eng. Dieser kurze Überblick fasst unser derzeitiges Verständnis des Zusammenspiels zwischen Monozyten und Chemokinen zusammen und zeigt dabei entscheidende Prozesse bei der Entwicklung, Progression und Regression von Atherosklerose.

    Einführung

    Monozyten und Makrophagen sind sowohl in menschlichen atherosklerotischen Plaques als auch in aus Tiermodellen erhaltenen Läsionen reichlich vorhanden. 1,2 Direkte Hinweise auf die Bedeutung von Monozyten bei der Atherogenese konnten in einer Studie gezeigt werden, in der ihre Depletion die Plaquebildung bei Kaninchen reduzierte. 3 Bei Mäusen 4,5 und beim Menschen wurden drei Hauptuntergruppen von Monozyten (als klassisch, intermediär und nicht klassisch bezeichnet) beschrieben. 5 Beim Menschen können Monozyten anhand der Expression von CD14 und CD16 unterschieden werden. Klassische Monozyten werden als CD14 ++ CD16 – definiert, intermediäre Monozyten als CD14 ++ CD16 + , während nichtklassische Monozyten CD14 + CD16 + sind. 5 Bei Mäusen werden CD115 + Monozyten-Untergruppen hauptsächlich aufgrund der Expression des Lymphozyten-Antigens 6C (Ly6C), aber auch CD43 unterschieden. Monozyten, die Ly6C ++ CD43 + sind, sind CX3CR1 niedrig CCR2 hoch und sollte den klassischen menschlichen Monozyten entsprechen. Im Gegensatz dazu sind murinen Ly6C + CD43 ++ Monozyten CX3CR1 hoch CCR2 niedrig sind phänotypische Äquivalente von humanen nichtklassischen Monozyten. 5 Bemerkenswert ist, dass eine kürzlich durchgeführte Studie, obwohl noch nicht bestätigt, Beweise dafür liefert, dass klassische Monozyten im Vergleich zu ihren nichtklassischen Gegenstücken bei Mäusen von dominanter Bedeutung bei der Atherogenese und Progression sind. 6

    Alle in dieser Serie veröffentlichten Artikel finden Sie unter http://atvb.ahajournals.org/site/misc/ATVB_in_Focus.xhtml.

    Im Allgemeinen präsentieren Monozyten Chemokinrezeptoren jeder bekannten Chemokinrezeptorfamilie. Die Rezeptorexpression unterscheidet sich jedoch zwischen den Untergruppen, wodurch sie für eine Vielzahl von Chemokinen anfällig werden, was zu unterschiedlichen funktionellen Konsequenzen führt. Daher sind Liganden und ihre jeweiligen Rezeptoren an verschiedenen pathophysiologischen Aspekten der Monozytenbiologie, die für Atherosklerose relevant sind, beteiligt, einschließlich homöostatischer Regulierung, Rekrutierung, Differenzierung oder Austritt. Dieser kurze Überblick konzentriert sich auf Chemokine, die an den oben genannten Prozessen beteiligt sind (Abbildung). Da die meisten der in diesem Review zitierten Studien nicht konsequent zwischen Monozyten-Untergruppen diskriminierten, sondern sich stattdessen auf Monozyten im Allgemeinen beziehen, werden wir uns nur auf bestimmte Monozyten-Untergruppen beziehen, wenn eine solche Unterscheidung im Originalbericht vorgenommen wurde.

    Abbildung. Chemokin-Monozyten-Interaktion während der Arteriosklerose. Erhöhte CXCL1-Plasmaspiegel regulieren die Monozytenmobilisierung bei Hypercholesterinämie. Die arterielle Adhäsion klassischer Monozyten wird durch Liganden von CCR1, CCR5 und CXCR2 kontrolliert. Innerhalb der atherosklerotischen Läsion werden die Schaumzellbildung, die Makrophagenaktivierung und das Überleben durch CXCL5, CXCL4 bzw. CX3CL1 kontrolliert. Schließlich erfordert die Bedeutung von CCR7-Liganden beim Austritt von Makrophagen aus atherosklerotischen Läsionen weitere Untersuchungen. EC bezeichnet Endothelzellen-HSPC, hämatopoetische Stamm- und multipotente Vorläuferzellen-MIF, migrationshemmenden Faktor MMP, Metalloproteinase und VSMC, vaskuläre glatte Muskelzellen.

    Chemokine kontrollieren die Monozytenhomöostase im Steady State und bei Hypercholesterinämie

    Die Zahl der zirkulierenden Monozyten, insbesondere der klassischen Monozyten, korreliert direkt mit dem Ausmaß der atherosklerotischen Läsionsbildung und folglich der läsionalen Makrophagenakkumulation bei Mäusen 6–8 und der Inzidenz von koronaren Herzkrankheiten 9 oder Myokardinfarkten beim Menschen. 10 Im letzten Jahrzehnt wurde deutlich, dass Hyperlipidämie, ein wichtiger Risikofaktor für Atherosklerose, eine Expansion myeloischer Zellen wie Neutrophile 11 und Monozyten 6,7 vorzugsweise der klassischen Untergruppe induziert. 7 Interessanterweise verringerte sich die Zahl nichtklassischer Monozyten bei Mäusen mit CX .-Mangel3CR1 wurde mit kleineren atherosklerotischen Plaques korreliert. 8 Allerdings konnte in dieser Studie kein direkter Beweis für die Bedeutung nichtklassischer Monozyten erbracht werden. Stattdessen ist der CX3CL1/CX3Die CR1-Achse scheint bei der Orchestrierung des Schicksals extravasierter Monozyten/Makrophagen von größerer Bedeutung zu sein, wie in einem späteren Abschnitt erörtert. Daher tragen Mechanismen, die die klassische Monozytenhomöostase kontrollieren, entscheidend zur arteriellen Monozytenakkumulation bei. Unter Steady-State-Bedingungen wird die Homöostase der klassischen Monozyten streng durch die CCL2/CCR2-Achse reguliert, und Mäuse, denen CCR2 fehlt, zeigen stark reduzierte Zahlen zirkulierender klassischer Monozyten. 12 Unter akuten Entzündungszuständen werden die klassischen Monozyten der Maus CCL2/CCR2- und CCL7/CCR2-abhängig aus dem Knochenmark mobilisiert. 12,13 Im Kontext der Atherosklerose scheinen diese Achsen jedoch von untergeordneter Bedeutung zu sein, da die Plasmakonzentrationen von CCL2 und CCL7 bei Apolipoprotein E-Mangel nicht ansteigen (Apoe −/− ) Mäuse erhielten eine fettreiche Diät. 6 Obwohl CCR2-defiziente Mäuse bereits unter Steady-State-Bedingungen eine deutlich reduzierte Zahl zirkulierender klassischer Monozyten aufweisen, steigt die Monozytenzahl bei diesen Mäusen unter Hypercholesterinämie immer noch an. 6 Stattdessen hat sich herausgestellt, dass die CXCL1/CXCR2-Achse bei der durch fettreiche Ernährung induzierten klassischen Monozytose von großer Bedeutung ist, da unter solchen Bedingungen Plasma-CXCL1 ansteigt und die CXCL1-Neutralisierung die Expansion zirkulierender klassischer Monozyten aufhebt. 6 Infolgedessen verringert die Injektion von neutralisierenden CXCL1-Antikörpern die Anzahl der Läsionsmakrophagen und die resultierenden Läsionsgrößen sind kleiner. 6

    Neben der direkten Mobilisierung klassischer Monozyten aus dem Knochenmark verbindet eine neuere Studie den Cholesterin-Efflux über ATP-bindende Kassettentransporter mit der Mobilisierung von hämatopoetischen Stamm- und multipotenten Vorläuferzellen und der extramedullären Proliferation. 14 Dies könnte von großem Interesse sein, da die Milz als Reservoir für klassische Monozyten identifiziert wurde, die während einer Entzündung leicht mobilisiert werden können. 15 In Übereinstimmung mit diesem Befund entwickelten splenektomierte Mäuse unter akuten entzündlichen Bedingungen keine Monozytose 15 und Milzmonozyten führen zu läsionalen Makrophagen. 16 Bemerkenswert ist, dass mehrere Chemokine, einschließlich CCL3 und CXCL8, nachweislich die Proliferation von hämatopoetischen Stamm- und multipotenten Vorläuferzellen unterdrücken und somit möglicherweise der Hämatopoese unter Bedingungen einer Hypercholesterinämie entgegenwirken. 17,18

    Chemokine locken Monozyten in atherosklerotische Läsionen

    Die Ligation von Chemokinrezeptoren löst eine Signalkaskade aus, die zur Chemoattraktion und Integrinaktivierung führt, ein Schritt von entscheidender Bedeutung für den festen Halt von Monozyten auf aktiviertem Endothel. Ein wichtiges Chemokin bei der Anziehung von Monozyten ist CCL2. Vor fast 20 Jahren wurde berichtet, dass Mäuse mit CCR2-Mangel stark reduzierte atherosklerotische Läsionen aufweisen. 19 Angesichts der entscheidenden Bedeutung von CCL2 für die Monozytenmobilisierung aus Produktionsstätten kann der bei CCR2-defizienten Mäusen beobachtete Läsionsphänotyp jedoch eher auf eine niedrige Anzahl zirkulierender Monozyten als auf eine gehemmte Rekrutierung zurückgeführt werden. 6

    Die Mehrheit der chemotaktischen Moleküle stammt von zirkulierenden Blutplättchen und Neutrophilen oder von geweberesidenten Zellen wie Endothelzellen und Makrophagen. Tatsächlich kann die Bedeutung von Blutplättchen bei Atherosklerose 20,21 teilweise durch die Abgabe und Ablagerung von Monozyten anziehenden Chemokinen erklärt werden. Blutplättchen sind reich an kationischen Arrest-Chemokinen wie CCL5 (RANTES), CXCL4 (PF4) und CXCL7. 22 Neuere Arbeiten heben die Bedeutung von CCL5 bei der Rekrutierung klassischer Monozyten hervor. 6,23 Hier lagern Blutplättchen CCL5 entlang des Endothels von atherosklerotischen Läsionen ab. 11 Immobilisiertes CCL5 wird durch rollende Monozyten erkannt, an denen sowohl CCR1 als auch CCR5 beteiligt sind. Interessanterweise erfordert die Wechselwirkung von CCL5 mit seinen Rezeptoren eine Sialylierung der Rezeptoren, wodurch günstige Konformationsänderungen in den Ccl5-Rezeptoren erzeugt oder elektrostatische Wechselwirkungen von basischen Chemokinresten mit negativ geladenen Sialinsäuren, die an die Chemokinrezeptoren gebunden sind, erzwungen werden. 24 Daher zeigen Mäuse, denen St3Gal-IV fehlt, eine drastisch reduzierte arterielle Monozytenadhäsion und eine stark verringerte Größe der atherosklerotischen Läsionen.25 Die Eignung von CCL5-Rezeptoren als therapeutische Ziele wird in Studien deutlich, in denen eine globale Blockade von CCL5-Rezeptoren mit Met-CCL5, 26 Hemmung von CCR5 mit Maraviroc, 27 oder CCR5-Mangel 28 zu einer reduzierten Größe der atherosklerotischen Läsionen und einem geringeren Gehalt an läsionalen Makrophagen führt. Angesichts der Beschleunigung der Atherosklerose als Reaktion auf einen Myokardinfarkt29 ist es interessant festzustellen, dass eine kürzlich durchgeführte klinische Studie eine Korrelation zwischen den Plasma-CCL5-Spiegeln und dem Fortschreiten der Atherosklerose nach akutem Koronarsyndrom zeigte. 30 Schließlich kann die durch CCL5 hervorgerufene arterielle Monozytenadhäsion weiter verstärkt werden, wenn CCL5 mit CXCL4 interagiert. 31 Die in-vivo-Relevanz dieser synergistischen Wechselwirkung wurde durch Befunde untermauert, dass eine Unterbrechung der CCL5-CXCL4-Heteromerbildung die Bildung von atherosklerotischen Läsionen deutlich hemmte. 31

    Läsionale Zellen setzen Chemokine frei, die die Adhäsion und Transmigration von Monozyten kontrollieren, wobei Liganden von CXCR2 eine dominante Bedeutung haben können. CXCL1 (KC bei Mäusen, GROα beim Menschen) wurde in Aortenklappenschnitten von atherosklerotischen Mäusen nachgewiesen 32 und kürzlich wurde ein Zusammenhang zwischen oxidiertem Lipoprotein niedriger Dichte (oxLDL) und der endothelialen CXCL1-Freisetzung festgestellt. 33 Hier benötigt oxLDL das Lysophosphatidsäure-erzeugende Enzym Autotaxin sowie die Lysophosphatidsäure-Rezeptoren 1 und 3, um die Freisetzung von CXCL1 aus Endothelzellen sowie die anschließende Monozytenadhäsion zu induzieren. Hinweise auf die Rolle von CXCR2 bei der Arteriosklerose stammen hauptsächlich aus Studien mit Knochenmarkchimären. Tatsächlich schützt ein Mangel an CXCR2 in hämatopoetischen Zellen vor Atherosklerose und reduziert den arteriellen Makrophagengehalt. 34 Ähnliche Effekte wurden bei atherosklerotischen Mäusen mit CXCL1-Mangel beobachtet. 32 Interessanterweise wurde gezeigt, dass CXCR2 für die Akkumulation von Makrophagen in etablierten Läsionen wichtiger ist als sein Ligand CXCL1 allein, 32 was auf die Bedeutung alternativer CXCR2-Liganden schließen lässt. In diesem Zusammenhang hat sich der migrationshemmende Faktor (MIF) als wichtiger Ligand der CXCR2-vermittelten arteriellen Monozytenrekrutierung herausgestellt. 35 MIF kann aus Makrophagen als Reaktion auf oxLDL und aus Endothelzellen unter Hypoxie freigesetzt werden. 36 Darüber hinaus wurde kürzlich gezeigt, dass MIF aus NG2 + -Perizyten in der Mikrozirkulation freigesetzt wird und so Leukozyten zu Entzündungsherden führt. 37 Neben der Blockierung von MIF, um eine Plaque-Regression zu induzieren und die Ansammlung von Makrophagen zu hemmen, wurde vor kurzem 35 Gremlin-1 als endogener Inhibitor von MIF identifiziert. Die Verabreichung eines rekombinanten Fusionsmoleküls mGremlin-Fc, das an MIF bindet, reduzierte die Größe der atherosklerotischen Läsionen und den Gehalt an arteriellen Makrophagen erheblich. 38 Neben MIF und CXCL1 erkennt CXCR2 auch andere Chemokine wie CXCL2, 6 oder 7. Obwohl CXCL5 bei der Schaumzellbildung wichtig zu sein scheint (siehe unten), erfordert die Rolle der anderen CXCR2-Liganden bei Arteriosklerose im Hinblick auf die Wirkung auf Monozyten weitere Studien.

    Chemokine regulieren das Schicksal von Monozyten in atherosklerotischen Läsionen

    Innerhalb des Plaques sind von Monozyten abgeleitete Makrophagen von einer Vielzahl von Chemokinen umgeben, die alle das Schicksal von Makrophagen in Bezug auf Aktivierung, Proliferation, Überleben und Polarisation unterschiedlich modulieren. Scavenger-Rezeptoren (zB CD36, SRA1) sind an der Aufnahme von modifiziertem LDL durch Makrophagen beteiligt und spielen bei der Schaumzellbildung eine wichtige Rolle. Es wurde festgestellt, dass das Transmembran-Chemokin CXCL16 eine Scavenger-Rezeptor-Aktivität aufweist. 39 In vitro zeigen CXCL16 −/− Makrophagen eine verminderte Aufnahme von oxLDL. Überraschenderweise beschleunigt der Mangel an CXCL16 in vivo die Arteriosklerose mit einem deutlichen Anstieg des Gehalts an läsionalen Makrophagen, was darauf hindeutet, dass CXCL16 atheroprotektiv ist. 40 Später wurde beschrieben, dass CXCL16 die Cholesterin-Efflux-Rate zu High-Density-Lipoprotein und ApoAI-Akzeptor erhöht, was darauf hindeutet, dass CXCL16 am reversen Cholesterintransport durch Makrophagen beteiligt ist, indem es die beiden Schlüssel-Cholesterintransporter ABCA1 und ABCG1 hochreguliert, 41 was eine Erklärung für den Phänotyp liefert beobachtet in Cxcl16 −/− Mäuse. Bemerkenswert ist, dass ein Mangel an CXCR6, dem Rezeptor für CXCL16, bei Atherosklerose im Spätstadium atheroprotektiv wirkt. Der veränderte Monozyten-/Makrophagengehalt in der Arterienwand resultierte jedoch aus einem verringerten Einstrom von CD3 + -Effektor-T-Zellen und einer insgesamt weniger entzündlichen Umgebung. 42 Kürzlich wurde beschrieben, dass CXCL5 über CXCR2 eine protektive Rolle bei Arteriosklerose spielt, indem es den Cholesteringehalt von Makrophagen und die Schaumzellbildung begrenzt, ein Effekt, der durch eine erhöhte ABCA1-Expression vermittelt wird. 43 Interessanterweise erhöht CXCL4, das hauptsächlich von Thrombozyten produziert wird, die Expression von ABCG1 in Makrophagen. 44 Obwohl der Rezeptor für CXCL4 auf Makrophagen noch unbekannt ist, zeigten frühere Arbeiten, dass CXCL4 auch an oxLDL-Partikel bindet und deren Aufnahme durch Makrophagen verstärkt. 45 Obwohl einige widersprüchliche Ergebnisse die komplexe Rolle von Chemokinen bei der Makrophagen- und Schaumzellbildung belegen, zeigen diese Studien eindeutig, dass Chemokine einen direkten Einfluss auf die Schaumzellbildung haben und als zukünftige therapeutische Ziele in Betracht gezogen werden könnten.

    Vor kurzem wurde beschrieben, dass insbesondere bei etablierter Atherosklerose läsionale Makrophagen lokal proliferieren und zur Plaque-Progression beitragen 46, was auf die Bedeutung des Makrophagen-Überlebens und der kontinuierlichen Proliferation hinweist. Obwohl MCSF (Makrophagen-Kolonie-stimulierender Faktor) als wichtigster Überlebensfaktor für Makrophagen innerhalb der Gefäßwand angesehen wurde, zeigte eine andere Studie, dass der CX3CL1/CX3Die CR1-Achse liefert ein wichtiges Überlebenssignal für läsionale Makrophagen. Insbesondere die Substitution von CX3CL1 rettete Monozyten vor experimentell induziertem Zelltod. 47,48 Zusammengenommen könnte dies zumindest teilweise die reduzierte Läsionsbildung bei Mäusen mit CX .-Mangel erklären3CR1 und betonen Sie die Bedeutung des CX3CL1/CX3CR1-Achse bei der Plaque-Regression.

    In den letzten zehn Jahren hat die Heterogenität, Plastizität und Polarisierung von Makrophagen im Kontext der Atherosklerose mehr Aufmerksamkeit erlangt und wurde kürzlich zusammengefasst. 49 Obwohl das meiste Wissen aus In-vitro-basierten Assays stammt und wenig über funktionelle Zusammenhänge zwischen Chemokinen, Chemokinrezeptoren, Makrophagen-Untergruppen und den Ergebnissen bei Atherosklerose bekannt ist, wurde beschrieben, dass CXCL4 ein einzigartiges Makrophagen-Transkriptom induziert. Dieser M4-Makrophagen-Phänotyp unterscheidet sich von M1 (klassisch aktivierte Makrophagen) und M2 (alternativ aktivierte Makrophagen) Phänotyp, wodurch eine neue Makrophagen-Untergruppe definiert wird. 44 M4-Makrophagen finden sich in humanen atherosklerotischen Plaques und sind durch die Expression der Metalloproteinase 7 und des Calcium-bindenden Proteins S100A8 gekennzeichnet. 50 Darüber hinaus zeigen CXCL4-induzierte Makrophagen einen vollständigen Verlust der atheroprotektiven CD163-Expression, 51 was zu einer starken Verringerung der Phagozytosekapazität dieser Makrophagen-Untergruppe führen könnte. Daher wird angenommen, dass M4-Makrophagen proinflammatorisch und proatherogen sind.

    Austreten von Makrophagen aus atherosklerotischen Läsionen

    Da Chemokine potente chemoattraktive Moleküle sind, wurde logischerweise vorgeschlagen, dass sie am Austritt von Makrophagen und Schaumzellen aus den Plaques teilnehmen könnten. In einem chirurgischen Modell der Plaque-Regression wurde eine bedeutende Verringerung der Plaque-Größe aufgrund der Emigration von Schaumzellen aus den atherosklerotischen Läsionen in die Lymphgefäße beobachtet. Dieser Effekt wurde aufgehoben, wenn beide Liganden für CCR7 (CCL19 und CCL21) blockiert wurden. 52 Bei diesem Operationsmodell kommt es jedoch zu einer spontanen Reanastomose zwischen Lymphgefäßen und Adventitia und kann somit zu falsch positiven Ergebnissen führen. Unabhängig von diesem kritischen Punkt reduziert die Statin-Behandlung den Cholesteringehalt der Makrophagen und erhöht die CCR7-Expression, die von der Anwesenheit eines Sterol-Response-Elements im Maus- und Human-CCR7-Gen abhängen könnte. 53 Darüber hinaus kann das neuronale Leitmolekül Netrin-1, das die chemotaktischen Reaktionen von Makrophagen auf verschiedene Chemokine in vitro hemmt, die Makrophagen-Chemotaxis gegenüber CCL19 oder CCL21 blockieren, 54 wodurch der potenzielle CCR7-abhängige Makrophagen-Austritt aus dem Plaque verringert wird. In Reihe, tödlich verstrahlt Ldlr −/− Mäuse, die mit Netrin-1-defizientem Knochenmark rekonstituiert wurden, zeigten eine erhöhte Makrophagen-Emigration aus dem Plaque. 54 Interessanterweise nehmen die Konzentrationen von Netrin-1 und einem anderen neuronalen Leitmolekül Semaphorin 3E ab, während die CCR7-Expression in regressiven Plaques induziert wird. 54,55 In einem nichtinvasiven Modell der Plaque-Regression, bei dem der Cholesterinspiegel durch die Reexpression von ApoE unter Verwendung eines Adenovirus in . gesenkt wird Affe −/− Mäusen konnte kein Unterschied in Plaquegröße und Makrophagengehalt zwischen Ccr7 −/− . beobachtet werden Affe −/− und Affe −/− Mäuse. 56 Dieser letzte Befund legt nahe, dass die Auswanderung von Makrophagen möglicherweise kein wesentlicher Mechanismus für die Plaque-Regression ist und dass andere Mechanismen, die das Schicksal von Makrophagen/Schaumzellen steuern, dominant sein könnten.

    Perspektive

    Die Bedeutung von Chemokinen im Kontext der Arteriosklerose wurde in den letzten Jahrzehnten vielfach untersucht. Klinische Studien mit Chemokinrezeptoren oder Chemokinantagonisten waren jedoch enttäuschend. Gründe für solche Fehler sind unter anderem prominente Off-Target-Effekte aufgrund der Kreuzreaktivität mit Rezeptoren ähnlicher Struktur, Diskrepanzen zwischen Tiermodellen und menschlichen Krankheiten und die Bedeutung des Zielmoleküls für die Wirtsabwehr und folglich kompromittierte Immunantworten. Darüber hinaus kann die auffallende Redundanz von Chemokinen bei der Kontrolle der Immunzellhomöostase, -rekrutierung und -aktivierung die Interferenz mit nur einem Molekül unzureichend machen. Neuere Arbeiten haben gezeigt, dass die Abgabe von Annexin A1-Fragmenten die redundanten Signale, die von Chemokinen im Zusammenhang mit der arteriellen Monozytenrekrutierung ausgeübt werden, außer Kraft setzen kann. 57 Trotz dieser positiven Ergebnisse müssen wir, um in zukünftigen therapeutischen Studien erfolgreich auf Chemokine und Chemokinrezeptoren abzielen zu können, besser verstehen, wie Chemokine die Monozytenfunktion im Steady State und bei akuter und chronischer Entzündung beeinflussen.


    WIRKUNGSMECHANISMEN VON ACKRs

    Chemokin-Gradientenformung

    Obwohl, wie bereits erwähnt, die Fähigkeit, den Chemokingradienten zu formen, eine gemeinsame Eigenschaft ist, und verschiedene ACKRs verwenden unterschiedliche Mechanismen, um diese Funktion zu erfüllen, wodurch ACKRs weiter in 3 „professionelle“ Kategorien eingeteilt werden können: Scavenger, Transporter und Presenter [2] (Abb. 2A). ACKR2, ACKR3, ACKR4 und ackr5 teilen sich die Fähigkeit, Chemokine einzufangen [41, 98, 125 –127]. ACKR1 und ackr5 teilen sich die Fähigkeit, ihre Liganden zu transportieren oder zu präsentieren (ACKR1 [58, 62, 74, 128, 129] ackr5 [36, 38, 42, 130]), was darauf hindeutet, dass diese beiden Mechanismen streng korreliert sind und wenn sie exprimiert werden auf Erythrozyten fungiert ACKR1 auch als Senke/Reservoir für Chemokine und wirkt somit als Chemokin-„Puffer“-Rezeptor [45, 131]. Wie in Signalisierungseigenschaften von ACKRs diskutiert, hängt der Mechanismus, der von einer gegebenen ACKR verwendet wird, um den Chemokingradienten zu formen, eng mit ihren Transporteigenschaften zusammen.

    Heatmaps der biologischen und biochemischen Eigenschaften von ACKR. (A) Die biologischen Funktionen von ACKRs in Bezug auf Mechanismen, die an der Formung des Chemokingradienten beteiligt sind (Abbau, Transzytose, Präsentation, Senke) und Auswirkungen auf die Signalgebung konventioneller Chemokinrezeptoren. (B) Die biochemischen Eigenschaften von ACKRs, analysiert in Bezug auf Transporteigenschaften in konstitutiven und Liganden-stimulierten Bedingungen. (C und D) Mechanismen der Rezeptorinternalisierung bzw. zellulären Verteilung werden beschrieben. Grün steht für positive Beweise, rot für negative Beweise, blau für kontroverse Beweise und weiß für fehlende Daten. (D) Schwache Positivität angezeigt als hellgrüne Ergebnisse aus dem Vergleich zwischen den 2 Zellkompartimenten.

    Auswirkungen auf die Aktivität konventioneller Chemokinrezeptoren

    Die Fähigkeit, die konventionelle Chemokinrezeptoraktivierung zu stören, stellt ein weiteres gemeinsames Thema unter ACKRs dar, obwohl die zugrunde liegenden molekularen Mechanismen noch weitgehend undefiniert sind (Abb. 2A). Es wurde gezeigt, dass alle ACKRs, aber nicht ACKR4 in der Lage sind, die Signaleigenschaften konventioneller Rezeptoren durch direkte Bindung verwandter Liganden zu stören, und es wurde auch gezeigt, dass ACKR1, ACKR3 und ACKR4 Oligomere mit konventionellen Chemokinrezeptoren bilden [122, 124, 132 , 133]. Die Koexpression von ACKR1 führt zu einer beeinträchtigten CCR5-vermittelten Signalübertragung und Chemotaxiseigenschaften [122], ACKR2 beeinträchtigt die CCR4-vermittelte Chemotaxis [134], ackr5 beeinträchtigt die CCR7-abhängige Aktivierung von B-Zellen [123] und die Chemotaxis der dendritischen Zellen [47] und ACKR3 verändert CXCR3 [135] sowie Signaleigenschaften von CD74 (dem anderen MIF-Rezeptor) [13] und AM-Rezeptor [32]. Umgekehrt haben mehrere Berichte gezeigt, dass ACKR3 die CXCR4-abhängige Chemotaxis verbessert [54, 132, 136]. Die Wirkung von ACKR auf konventionelle Rezeptoren geht über die direkte Konkurrenz um verwandte Liganden hinaus, da gezeigt wurde, dass einige ACKRs die Signalaktivität von nicht verwandten konventionellen Chemokinrezeptoren wie ACKR2 und ACKR4 beeinträchtigen, indem sie CXCR5 auf angeborenen B-Zellen und CXCR3 auf T-Zellen hemmen. bzw. [24, 124]. Da ACKR2 und ACKR4 β-Arrestin-abhängige Signalisierungsereignisse aktivieren (siehe β-Arrestin-abhängige Signalisierungseigenschaften), ist es verlockend zu spekulieren, dass eine Störung der effizienten Kopplung herkömmlicher Chemokinrezeptoren an β-Arrestine impliziert sein könnte. Zusammenfassend scheinen ACKRs ihre regulatorische Aktivität bevorzugt auszuüben, indem sie den Chemokingradienten formen, wenn sie auf nicht-hämatopoetischen Zellen exprimiert werden, und indem sie die konventionelle Chemokinrezeptoraktivierung stören, wenn sie auf hämatopoetischen Zellen koexprimiert werden (siehe diesen Abschnitt zur biologischen Relevanz dieser Mechanismen). Wie in Trafficking-Eigenschaften von ACKRs und Signalisierungseigenschaften von ACKRs erörtert, üben verschiedene ACKRs diese Funktionen durch unterschiedliche Mechanismen in Bezug auf ihre Trafficking- und Signalisierungseigenschaften aus.


    Abstrakt

    Die Hodgkin-Krankheit (HD) ist eine lymphoide Malignität, die durch seltene bösartige Zellen gekennzeichnet ist, die von reichlich entzündlichen Zellen umgeben sind. In dieser Studie untersuchten wir den potenziellen Beitrag von Chemokinen zur Rekrutierung von Entzündungszellen bei verschiedenen Subtypen der Huntington-Krankheit. Chemokine sind kleine Proteine, die als Chemoattraktoren und Regulatoren der Zellaktivierung aktiv sind. Wir fanden heraus, dass Huntington-Gewebe im Allgemeinen höhere Mengen an Interferon-γ-induzierbarem Protein-10 (IP-10), Mig, RANTES, Makrophagen-Entzündungsprotein-1 (MIP-1) und Eotaxin exprimieren, jedoch keine von Makrophagen abgeleitete Chemotaktik Faktor (MDC), als Gewebe aus lymphoider Hyperplasie (LH). Innerhalb der HD-Subtypen war die Expression von IP-10 und Mig im Subtyp gemischte Zellularität (MC) am höchsten, während die Expression von Eotaxin und MDC im Subtyp noduläre Sklerose (NS) am höchsten war. Es wurde eine signifikante direkte Korrelation zwischen dem Nachweis einer Epstein-Barr-Virus (EBV)-Infektion in den neoplastischen Zellen und den Expressionsniveaus von IP-10, RANTES und MIP-1 festgestellt. Die Niveaus der Eotaxin-Expression korrelierten direkt mit dem Ausmaß der Gewebe-Eosinophilie. Durch Immunhistochemie lokalisierten IP-10-, Mig- und Eotaxin-Proteine ​​in den malignen Reed-Sternberg (RS)-Zellen und ihren Varianten sowie einigen umgebenden Entzündungszellen. Eotaxin wurde auch in Fibroblasten und glatten Muskelzellen von Gefäßen nachgewiesen. Diese Ergebnisse belegen eine hohe Chemokin-Expression in Huntington-Geweben und legen nahe, dass Chemokine eine wichtige Rolle bei der Rekrutierung von Entzündungszellinfiltraten in Gewebe spielen können, die an der Huntington-Krankheit beteiligt sind.

    hDie ODGKIN-KRANKHEIT (HD) ist eine lymphoide Malignität, die durch seltene maligne Reed-Sternberg (RS)- und Hodgkin-Zellen in einer Umgebung von nichtmalignen Zellen, einschließlich T-Zellen, Makrophagen, Fibroblasten, Plasmazellen, Eosinophilen und Neutrophilen, gekennzeichnet ist. Das Auftreten relativ seltener neoplastischer Zellen im Zusammenhang mit reaktiven Zellen deutet darauf hin, dass eine ausgeprägte lokale Entzündungsreaktion auf die RS- und Hodgkin-Zellen ein Schlüsselmerkmal dieser Malignität ist. Die intensive Entzündung könnte eine unzureichende und/oder ineffektive Antitumorreaktion widerspiegeln, die selbst zur Krankheit beitragen kann.

    Eine Reihe von Studien hat dokumentiert, dass die Huntington-Krankheit eine Neoplasie ist, die mit einer abnormalen Zytokinproduktion einhergeht.1-3 Eine übermäßige Produktion des inhibitorischen Zytokins Interleukin (IL)-10 kann zu einer verringerten T-Zell-Immunität und zu abnormal hohen IL-Spiegeln beitragen. 6, IL-1 und Tumornekrosefaktor (TNF)-α können für einige der konstitutionellen Symptome verantwortlich sein, die häufig mit der Huntington-Krankheit assoziiert werden.1,4 Andere Aspekte der Huntington-Krankheit, einschließlich peripherer Bluteosinophilie, Plasmazytose und Thrombozytose, könnten ebenfalls sein durch abnormal hohe Zytokinspiegel von IL-3 bzw. IL-5, IL-6 bzw. IL-11 beigetragen.4 Es ist jedoch unwahrscheinlich, dass systemische Zytokin-Ungleichgewichte die charakteristischen zellulären Infiltrate erklären, die die malignen Zellen umgeben. Vielmehr könnte die Natur zellulärer Infiltrate in Huntington-Geweben auf der Grundlage bestimmter Chemokine erklärt werden, die lokal produziert werden und die selektive Zellmigration fördern.

    Jüngste Studien in einem athymischen Mausmodell haben eine Wirtsreaktion auf Epstein-Barr-Virus (EBV)-immortalisierte Zellen beschrieben und zwei Mediatoren dieser Reaktion identifiziert als die CXC-Chemokine IP-10 und Mig.5-7 Erhöhte Produktion von IP-10 und Mig wurde auch in EBV-positiven lymphomatösen Geweben identifiziert, die repräsentativ für lymphomatoide Granulomatose und nasales oder nasales T-/Natural Killer (NK)-Zell-Lymphom sind.8 Chemokine sind Mitglieder einer Familie kleiner Proteine, die als Chemoattraktoren und Zellaktivatoren aktiv sind. 9 Einige Mitglieder dieser Familie haben beträchtliche Aufmerksamkeit erregt, weil sie eine Selektivität von Zellzielen und Rezeptoren aufweisen. Diese Selektivität hat die Möglichkeit nahegelegt, dass die zelluläre Zusammensetzung von Entzündungsreaktionen teilweise eine Funktion der Chemokine ist, die an einer Stelle produziert werden. Abgesehen von vorläufigen Ergebnissen zur Expression von IL-8, einem neutrophilen chemotaktischen und aktivierenden Faktor, und dem verwandten monozytenchemotaktischen Peptid-1 (MCP-1), das Monozyten anzieht und aktiviert, gibt es nur begrenzte Informationen über die Beteiligung anderer Chemokine an der Pathogenese der zellulären Infiltrate, die die Huntington-Krankheit und ihre histologischen Subtypen charakterisieren.1,3

    In dieser Studie untersuchten wir den potenziellen Beitrag von Chemokinen zur Entzündungsreaktion in Huntington-Geweben und den verschiedenen Krankheitssubtypen. Insbesondere haben wir uns auf die CXC-Chemokine IP-10 und Mig konzentriert, die für T- und NK-Zellen chemoattraktiv sind, und deren Beziehung zur Positivität bei EBV, und das CC-Chemokin Eotaxin, das ein Chemoattraktant für Eosinophile ist, und seine Beziehung zur Gewebeeosinophilie .


    Fibroblasten haben ein verzweigtes Zytoplasma, das einen elliptischen, gesprenkelten Kern mit zwei oder mehr Nukleolen umgibt. Aktive Fibroblasten sind an ihrem reichlich vorhandenen rauen endoplasmatischen Retikulum zu erkennen. Inaktive Fibroblasten (Fibrozyten genannt) sind kleiner, spindelförmig und haben weniger raues endoplasmatisches Retikulum. Obwohl sie unzusammenhängend und zerstreut sind, wenn sie einen großen Raum abdecken müssen, richten sich Fibroblasten, wenn sie überfüllt sind, oft lokal in parallelen Clustern aus.

    Im Gegensatz zu den Epithelzellen, die die Körperstrukturen auskleiden, bilden Fibroblasten keine flachen Monoschichten und werden nicht durch eine polarisierende Bindung an eine Basallamina auf einer Seite eingeschränkt, obwohl sie in einigen Situationen zu Basallaminakomponenten beitragen können (z. B. können subepitheliale Myofibroblasten im Darm sezernieren die α-2-Ketten-tragende Komponente des Laminins, die nur in Regionen von Follikel-assoziierten Epithelien fehlt, denen die Myofibroblastenauskleidung fehlt). Fibroblasten können auch als einzelne Zellen langsam über das Substrat wandern, wiederum im Gegensatz zu Epithelzellen. Während Epithelzellen die Auskleidung von Körperstrukturen bilden, sind es Fibroblasten und verwandte Bindegewebe, die die "Masse" eines Organismus formen.

    Die Lebensdauer eines Fibroblasten, gemessen an Hühnerembryonen, beträgt 57 ± 3 Tage. [3]

    Beziehung zu Fibrozyten Bearbeiten

    Fibroblasten und Fibrozyten sind zwei Zustände derselben Zellen, wobei der erstere der aktivierte Zustand ist, der letztere der weniger aktive Zustand, der mit der Erhaltung und dem Gewebestoffwechsel befasst ist. Gegenwärtig gibt es eine Tendenz, beide Formen als Fibroblasten zu bezeichnen. Das Suffix „-blast“ wird in der Zellbiologie verwendet, um eine Stammzelle oder eine Zelle in einem aktivierten Stoffwechselzustand zu bezeichnen.

    Fibroblasten sind morphologisch heterogen mit unterschiedlichem Erscheinungsbild je nach Standort und Aktivität. Obwohl morphologisch unauffällig, können ektopisch transplantierte Fibroblasten oft ein Positionsgedächtnis des Ortes und des Gewebekontexts, in dem sie sich zuvor aufgehalten hatten, zumindest über einige Generationen hinweg, behalten. [4] Dieses bemerkenswerte Verhalten kann zu Unbehagen führen [ Klärung nötig ] für den seltenen Fall, dass sie dort übermäßig stagnieren.

    Entwicklung Bearbeiten

    Die Hauptfunktion von Fibroblasten besteht darin, die strukturelle Integrität des Bindegewebes durch kontinuierliche Sekretion von Vorläufern der extrazellulären Matrix aufrechtzuerhalten. Fibroblasten sezernieren die Vorläufer aller Komponenten der extrazellulären Matrix, hauptsächlich die Grundsubstanz und eine Vielzahl von Fasern. Die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix bestimmt die physikalischen Eigenschaften des Bindegewebes.

    Wie andere Zellen des Bindegewebes stammen Fibroblasten aus primitivem Mesenchym. So exprimieren sie das intermediäre Filamentprotein Vimentin, ein Merkmal, das als Marker verwendet wird, um ihren mesodermalen Ursprung zu unterscheiden. [5] Dieser Test ist jedoch nicht spezifisch, da in vitro auf adhärentem Substrat kultivierte Epithelzellen nach einiger Zeit auch Vimentin exprimieren können.

    In bestimmten Situationen können Epithelzellen zu Fibroblasten führen, ein Prozess, der als epithelial-mesenchymaler Übergang (EMT) bezeichnet wird.

    Umgekehrt können Fibroblasten in einigen Situationen zu Epithelien führen, indem sie einen Übergang von Mesenchym zu Epithel (MET) durchlaufen und sich zu einem kondensierten, polarisierten, seitlich verbundenen echten Epithelblatt organisieren. Dieser Prozess wird in vielen Entwicklungssituationen (z. B. Nephron- und Notocord-Entwicklung) sowie bei der Wundheilung und Tumorentstehung beobachtet. [ Zitat benötigt ]

    Fibroblasten bilden Kollagenfasern, Glykosaminoglykane, retikuläre und elastische Fasern. Die Fibroblasten von wachsenden Individuen teilen sich und synthetisieren Grundsubstanz. Gewebeschäden stimulieren Fibrozyten und induzieren die Produktion von Fibroblasten. [ Zitat benötigt ]

    Entzündung Bearbeiten

    Neben ihrer allgemein bekannten Rolle als strukturelle Komponenten spielen Fibroblasten eine entscheidende Rolle bei einer Immunantwort auf eine Gewebeverletzung. Sie sind frühe Akteure bei der Initiierung von Entzündungen in Gegenwart von eindringenden Mikroorganismen. Sie induzieren die Chemokinsynthese durch die Präsentation von Rezeptoren auf ihrer Oberfläche. Immunzellen reagieren dann und initiieren eine Kaskade von Ereignissen, um die invasiven Mikroorganismen zu beseitigen. Rezeptoren auf der Oberfläche von Fibroblasten ermöglichen auch die Regulierung von hämatopoetischen Zellen und stellen einen Weg für Immunzellen bereit, um Fibroblasten zu regulieren. [6]

    Tumormediation Bearbeiten

    Fibroblasten spielen wie die tumorassoziierten Wirtsfibroblasten (TAF) eine entscheidende Rolle bei der Immunregulation durch Komponenten und Modulatoren der TAF-abgeleiteten extrazellulären Matrix (ECM). Es ist bekannt, dass TAF bei der Entzündungsreaktion sowie bei der Immunsuppression bei Tumoren eine bedeutende Rolle spielt. Von TAF abgeleitete ECM-Komponenten verursachen Veränderungen in der ECM-Zusammensetzung und initiieren die ECM-Umgestaltung. [7] Das ECM-Remodeling wird als Veränderungen der ECM als Folge von Enzymaktivität beschrieben, die zum Abbau der ECM führen können. Die Immunregulation von Tumoren wird weitgehend durch das ECM-Remodeling bestimmt, da die ECM für die Regulierung einer Vielzahl von Funktionen wie Proliferation, Differenzierung und Morphogenese lebenswichtiger Organe verantwortlich ist. [8] Bei vielen Tumorarten, insbesondere solchen, die mit den Epithelzellen verwandt sind, ist ein ECM-Remodeling üblich. Beispiele von TAF-abgeleiteten ECM-Komponenten umfassen Tenascin und Thrombospondin-1 (TSP-1), die an Stellen chronischer Entzündung bzw. Karzinomen gefunden werden können. [7]

    Die Immunregulation von Tumoren kann auch durch die von TAF abgeleiteten Modulatoren erfolgen. Obwohl diese Modulatoren den von TAF abgeleiteten ECM-Komponenten ähnlich klingen mögen, unterscheiden sie sich in dem Sinne, dass sie für die Variation und den Umsatz der ECM verantwortlich sind. Gespaltene ECM-Moleküle können eine entscheidende Rolle bei der Immunregulation spielen. Proteasen wie Matrix-Metalloproteinasen (MMPs) und das uPA-System sind dafür bekannt, die ECM zu spalten. Diese Proteasen stammen von Fibroblasten. [7]

    Sekundäre Aktionen Bearbeiten

    Embryonale Fibroblasten (MEFs) der Maus werden häufig als "Feeder-Zellen" in der Forschung an humanen embryonalen Stammzellen verwendet. Viele Forscher verzichten jedoch nach und nach auf MEFs zugunsten von Kulturmedien mit genau definierten Inhaltsstoffen, die ausschließlich vom Menschen stammen. [ Zitat benötigt ] Darüber hinaus wird die Schwierigkeit, ausschließlich menschliches Material für Medienergänzungen zu verwenden, meistens durch die Verwendung von "definierten Medien" gelöst, bei denen die Ergänzungen synthetisch sind und das primäre Ziel erreichen, die Möglichkeit einer Kontamination durch abgeleitete Quellen zu eliminieren. [ Zitat benötigt ]

    Im Hinblick auf die klinische Anwendung von aus Stammzellen gewonnenen Geweben wurde die Verwendung von menschlichen Fibroblasten als Futtermittel untersucht. [9] Während die Fibroblasten normalerweise verwendet werden, um die Pluripotenz der Stammzellen aufrechtzuerhalten, können sie auch verwendet werden, um die Entwicklung der Stammzellen zu bestimmten Zelltypen wie Kardiomyozyten zu erleichtern. [10]

    Immunantwort des Wirts Bearbeiten

    Fibroblasten aus verschiedenen anatomischen Stellen im Körper exprimieren viele Gene, die für Immunmediatoren und Proteine ​​kodieren. [11] Diese Mediatoren der Immunantwort ermöglichen die zelluläre Kommunikation mit hämatopoetischen Immunzellen. [12] Die Immunaktivität von nicht-hämatopoetischen Zellen wie Fibroblasten wird als „strukturelle Immunität“ bezeichnet. [11] [13] Um eine schnelle Reaktion auf immunologische Herausforderungen zu ermöglichen, kodieren Fibroblasten entscheidende Aspekte der strukturellen Zellimmunantwort im Epigenom. [ Zitat benötigt ]


    Budget

    Wir haben uns um private Forschungsstipendien beworben, benötigen aber weitere vorläufige Daten, um unser Projekt auf den Weg zu bringen. Die Durchführung einer massenspektrometrischen Analyse von Proteinen in Zellen nach chemischen Behandlungen wird es uns ermöglichen, Veränderungen in den Proteinen/Zellen zu identifizieren, die das Immunsystem aktivieren. Wir können dann die Fähigkeit dieser veränderten Proteine ​​untersuchen, Autoimmunerkrankungen auszulösen. Darüber hinaus planen wir zu testen, ob diese veränderten Proteine ​​für Krebsimmuntherapien verwendet werden könnten.

    Wir werden die UMass Mass Spec Core Facility verwenden, um unsere Proben zu testen. 3000 US-Dollar decken die Kosten für die Durchführung von mindestens 5 Proben (500 US-Dollar/Probe) plus die Verwendung von Einwegreagenzien/Puffer (500 US-Dollar). Die damit verbundenen Analysegebühren sind in der Mustergebühr enthalten.

    Für jede 500 US-Dollar, die wir über das ursprüngliche Ziel hinaus sammeln, können wir eine zusätzliche Probe hinzufügen.