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2.12: Mikroben-Mythbuster - Biologie


Der große Feind der Wahrheit ist sehr oft nicht die Lüge, gewollt, erfunden und unehrlich, sondern der Mythos, hartnäckig, überzeugend und unrealistisch.

Was ist Wahrheit?

Wahrheit ist ein philosophisches Konstrukt, dessen Bedeutung seit der Erfindung der Sprache durch den Menschen diskutiert wird. Das steht nicht im Fokus dieses Unterfangens.

In diesem Projekt geht es mehr um Vernunft, auch ein philosophisches Konstrukt. Die Vernunft bietet einen Weg, um über die Wahrheit nachzudenken. Einigen zufolge entsteht Wahrheit, wenn Menschen angemessene Argumente für ein anstehendes Problem anwenden. Dies ist das Ziel der Wissenschaft.

Vielleicht haben Sie kürzlich eine Behauptung über ein Nahrungsergänzungsmittel gehört oder eine Werbung für ein pharmazeutisches Medikament gesehen, das erstaunliche Vorteile anpreist, wenn Sie es einnehmen, und sich gefragt, ob Sie es sollten. Oder haben Sie über die Gesundheitsrisiken nachgedacht, die mit einer Grippeimpfung verbunden sind, oder überlegt, ein Probiotikum einzunehmen, weil der Freund Ihres Cousins ​​gesagt hat, dass Sie es sollten? Wie können Sie wissen, was für Sie am besten ist?

Es gibt eine Vielzahl wissenschaftlicher Studien zu einer unendlichen Anzahl von Themen in Wissenschaft und Medizin, die in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht und in durchsuchbaren Datenbanken gespeichert werden. Indem Sie eine organisierte Überprüfung der veröffentlichten Forschung zu diesem Thema durchführen und „angemessene Gründe“ anwenden, können Sie selbst entscheiden, was für Sie am besten ist, anstatt sich auf Ratschläge von Anzeigen oder Personen zu verlassen, die Sie nicht kennen.

Die Durchführung wissenschaftlicher Forschung wird von Praktiken geleitet, die zusammen als wissenschaftliche Methode bezeichnet werden und bei denen Experimente dazu dienen, Fragen zu einer Hypothese zu beantworten. In einer perfekten Welt werden Experimente sorgfältig entworfen, um sicherzustellen, dass die gesammelten Daten und die daraus abgeleiteten Ergebnisse objektiv und ohne Verzerrungen sind. Wenn die Ergebnisse signifikant sind, wird die Wissenschaft in einer Zeitschrift veröffentlicht, um die Ergebnisse an andere interessierte Personen weiterzugeben. Zeitschriftenbände wurden historisch in Bibliotheken aufbewahrt, wo darin enthaltene Artikel gelesen und gegebenenfalls kopiert werden konnten. Es ist nicht mehr notwendig, verstaubte „Stapel“ gedruckter Zeitschriften zu durchsuchen, um einen wissenschaftlichen Artikel zu finden, denn eine Vielzahl von Artikeln sind inzwischen „open access“ oder elektronisch über eine Bibliotheksschnittstelle verfügbar.

Es gibt Unterschiede zwischen Artikeln, die in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlicht werden, und denen in anderen Arten von Veröffentlichungen, und der Hauptunterschied ist das Peer-Review. Es ist wichtig zu beachten, dass die Verwendung des Begriffs „Veröffentlichung“ sowohl in elektronischer Form als auch in gedruckter Form veröffentlichte Arbeiten umfasst.

Sie sollten sich ein kurzes Video ansehen, das unter verfügbar ist http://www.library.vanderbilt.edu/peabody/tutorial_files/scholarlyfree/, die erklärt, wie man zwischen einer Quellenangabe aus einer wissenschaftlichen Veröffentlichung und einer in den populären Medien veröffentlichten unterscheidet.

Ihr Lehrer wird Ihnen ein Konzept zum Thema Mikrobiologie vermitteln, von dem Sie vielleicht schon gehört haben, bevor Sie mit diesem Projekt beginnen. Abhängig von den Vorlieben Ihres Dozenten können Sie Ihre zugewiesene Idee als schriftliche Aufgabe untersuchen oder Sie werden möglicherweise aufgefordert, die Aufgabe in einer Präsentationssoftware (wie PowerPoint) zu formatieren und eine formelle Präsentation durchzuführen.

Bevor Sie eine Recherche durchführen, denken Sie über Ihre ersten Eindrücke und persönlichen Ansichten zu der Ihnen gelieferten Idee nach und schreiben Sie sie auf. Wenn Sie mit der Idee nicht vertraut sind oder das Gefühl haben, sie gut zu verstehen, führen Sie eine kleine Hintergrundrecherche des Themas in gängigen Quellen (wie Google und Wikipedia) durch, um Hintergrundinformationen zu sammeln, bevor Sie mit Ihrer wissenschaftlichen Suche beginnen.

Entlarven Sie die Mythen, unterstützen Sie die Wahrheit

Vieles von dem, was Sie in den Abendnachrichten über Entdeckungen in Wissenschaft und Medizin hören, stammt aus der Forschung an Universitäten und medizinischen Hochschulen. Die Finanzierung dieser Forschung kann aus staatlichen Quellen stammen und wird daher von der steuerzahlenden Öffentlichkeit bezahlt. Angesichts der begrenzten Topfgröße wird die Forschung jedoch auch von privaten Unternehmen betrieben, die dann von der Forschung profitieren, die in einem gewinnbringenden Produkt gipfelt. Wenn die Forschung zu einer Veröffentlichung in einer „hochrangigen“ Zeitschrift führt (Rangfolge nach dem „Impact Factor“ der Zeitschrift, basierend auf der Häufigkeit, mit der in der Zeitschrift veröffentlichte Artikel als Referenz in anderen Publikationen zitiert werden), eine kurze Beschreibung der Studie und ihre Ergebnisse werden an die populären Medien zur Berichterstattung an die Öffentlichkeit weitergegeben. Manchmal wird die Regierungspolitik auf der Grundlage veröffentlichter Studien als Grundlage für die Gesetzgebung entwickelt.

Die wissenschaftliche und nicht-wissenschaftliche Berichterstattung über wissenschaftliche Entdeckungen bedeutet, dass die Menschen heute die beispiellose Möglichkeit haben, fundierte Entscheidungen über Dinge zu treffen, die ihr Leben beeinflussen können. Es bietet jedoch auch einen fruchtbaren Boden für die Verbreitung von Informationen, die darauf abzielen, die Idee zu „vermarkten“, um öffentliche Unterstützung zu gewinnen. Einmal im öffentlichen Bewusstsein verankert, können falsch angewendete „Fakten“ zu „Mythen“ werden – hartnäckig, überzeugend und unrealistisch. Wie erkennst du den Unterschied?

In diesem Projekt untersuchen Sie, ob eine gemeinsame Mikrobiologie-Idee wissenschaftlich konzipiert ist und inwieweit sie „wahr“ ist, indem Sie in wissenschaftlichen Zeitschriften veröffentlichte Forschungsergebnisse auswerten und berichten. Die Bestandteile Ihres Berichts oder Ihrer Präsentation sind unten aufgeführt.

1. Überprüfen Sie die populäre Meinung und entwickeln Sie eine These

Wenn Sie Ihr Mythbuster-Thema kennen, suchen Sie nach Hintergrundinformationen und Meinungen in Quellen, die nicht als „wissenschaftlich“ gelten. Dazu gehören beliebte Pressequellen wie Zeitungen, Zeitschriften, Internetquellen oder Großtante Martha, die alles weiß.

Entwickeln Sie aus Ihrem gesammelten Wissen zu diesem Thema eine These zu diesem Thema und machen Sie Ihre Meinung dazu in einer Thesenaussage geltend – einer ein oder zwei Sätzen Vorhersage dessen, was Sie für wahr halten. Das Thesenstatement sollte fokussiert und spezifisch genug sein, um im Rahmen Ihrer Untersuchung beweisbar zu sein.

Wenn Sie nach dem „Grund“ suchen, um die „Wahrheit“ zu untermauern, stellen Sie möglicherweise fest, dass Ihre These nicht durch die verfügbaren wissenschaftlichen Beweise gestützt werden kann. Sie müssen jedoch flexibel, objektiv und ehrlich sein, wenn Sie die wissenschaftliche Literatur konstruieren und durchsuchen und nicht nur nach Wegen suchen, um Ihre Meinung wahr erscheinen zu lassen.

2. Durchsuchen Sie die wissenschaftliche Literatur

Wissenschaftler, die ihre Forschung für bedeutsam halten, kommunizieren die Ergebnisse durch Veröffentlichung in wissenschaftlichen Zeitschriften. Die meisten medizinischen und wissenschaftlichen Organisationen veröffentlichen Fachzeitschriften – die American Society for Microbiology beispielsweise veröffentlicht mehrere Fachzeitschriften wie Angewandte und Umweltmikrobiologie und Zeitschrift für Klinische Mikrobiologie, unter anderen. Bei wissenschaftlichen Zeitschriften eingereichte Manuskripte werden an ein Gremium aus anderen Wissenschaftlern gesendet, das sie auf wissenschaftliche Legitimität und Integrität überprüft. Dies stellt sicher, dass die Daten und Ergebnisse aus sorgfältig entworfenen, reproduzierbaren Experimenten stammen und die Schlussfolgerungen evidenzbasiert sind. Sobald sie von Experten begutachtet und genehmigt wurden, werden sie in einen Band der Zeitschrift aufgenommen und veröffentlicht.

Es ist wichtig zu bedenken, dass in einer perfekten Welt die Verwendung von Wissenschaft und wissenschaftlichen Methoden zum Verständnis der Natur ein logischer, objektiver und völlig unvoreingenommener Prozess ist, dass Peer-Reviewer immer ehrlich sind und dass Peer-Review-Artikel die „Wahrheit“ darstellen. ” Wie mehrere hochkarätige Fälle aus jüngster Zeit zeigen, in denen veröffentlichte Studien aufgrund von Betrug der Forscher und/oder ihrer Gutachter „zurückgezogen“ wurden, ist der Prozess nicht perfekt. Dies gilt insbesondere dann, wenn der finanzielle oder persönliche Einsatz hoch ist.

Nachdem Sie Ihr Thesenstatement entwickelt haben, ist der nächste Schritt, nach veröffentlichten Forschungsstudien zu Ihrem Thema zu suchen. Siehe http://www.wikihow.com/Find-Scholarly-Articles-Online/ für einen kompakten Überblick über die Erstellung und Durchführung einer Suche nach wissenschaftlichen Artikeln zu einem interessanten Thema.

Viele Bibliotheken an Colleges und Universitäten, wie das Bibliothekssystem der State University of New York, haben Zugriff auf riesige Datenbanken mit Millionen von wissenschaftlichen Artikeln. Daher ist ein weiterer ausgezeichneter Ausgangspunkt, die Hilfe eines Referenzbibliothekars in Ihrer Hochschulbibliothek in Anspruch zu nehmen, der Ihnen sagen kann, welche Artikeldatenbanken verfügbar sind, und Ihnen bei der Erstellung Ihrer Suche helfen kann. Referenzbibliothekare sind besonders hilfreich, wenn es darum geht, die richtigen Wörter oder Phrasen zu finden, damit Ihre Suche eine überschaubare Anzahl von Ergebnissen liefert, nicht zu wenige oder zu viele.

Seien Sie objektiv, wenn Sie entscheiden, welche Artikel Sie weiterlesen möchten. Beschränken Sie sich nicht nur auf diejenigen, die Ihrer These zu 100% zustimmen. Lesen Sie die Zusammenfassung durch, und wenn der Artikel für Ihre Idee relevant ist, laden Sie den gesamten Artikel (Volltext) herunter und lesen Sie den vollständigen Inhalt.

3. Erstellen Sie eine kommentierte Bibliographie ausgewählter wissenschaftlicher Artikel

An dieser Stelle haben Sie (hoffentlich) eine große Liste von Artikeln zu Ihrem Thema durchgeblättert. Für diejenigen, die Sie sich entschieden haben, tiefer zu lesen, bereiten Sie ein Literaturverzeichnis mit dem von Ihrem Dozenten bevorzugten Zitierformat vor. Einige der Datenbanken schreiben die Zitation tatsächlich für Sie, und auch hier kann Ihr Referenzbibliothekar Ihnen helfen, die Zitationsanwendung zu finden und darauf zuzugreifen, wenn sie für diese Datenbank existiert.

Sie sollten Zitate für alle von Ihnen ausgewählten Artikel angeben. Wählen Sie aus den Artikeln, die Sie in das Literaturverzeichnis aufnehmen, drei der Artikel aus, die Ihrer Meinung nach beispielhaft für Ihre Idee sind, und schreiben Sie eine kurze Anmerkung zum Zitat. „Annotiert“ bedeutet, dass Sie nach dem Zitat eine kurze Zusammenfassung der Ziele und Ergebnisse der im Artikel vorgestellten Forschung mit ein bis zwei Absätzen schreiben. Im letzten Satz der Zusammenfassung sollte erläutert werden, wie sich der Artikel auf Ihre Abschlussarbeit bezieht. Ein Beispiel für eine kommentierte Referenz ist unten dargestellt (das Zitierformat ist APA).

Fava, F., Lovegrove, J. A., Gitau, R., Jackson, K. G. & Tuohy, K. M. (2006) Die Darmmikrobiota und der Fettstoffwechsel: Auswirkungen auf die menschliche Gesundheit und koronare Herzkrankheiten. Aktuelle medizinische Chemie, 13, 3005-3021.

Zusammenfassung: Die koronare Herzkrankheit (KHK) ist die häufigste Todesursache in der westlichen Gesellschaft und betrifft etwa ein Drittel der Bevölkerung vor dem siebzigsten Lebensjahr. Dieser Artikel gibt einen Überblick über die modifizierbaren Risikofaktoren im Zusammenhang mit KHK und diskutiert die Hypothese, dass eine Ernährung, die reich an Ballaststoffen und pflanzlichen Polyphenolen ist, eine bessere koronare Gesundheit fördert. Pflanzenfasern werden von der Darmmikroflora metabolisiert und in biologisch aktive Verbindungen umgewandelt, die den menschlichen Stoffwechsel ergänzen. Der Stoffwechsel von Pflanzenfasern durch die Darmmikroflora kann einen gestörten Fettstoffwechsel und eine vaskuläre Dysfunktion, die für KHK und Typ-II-Diabetes typisch sind, verhindern oder anderweitig positiv beeinflussen. Insgesamt unterstützt dieser Artikel meine These, dass die Bakterien im menschlichen Darm einen positiven Beitrag zur allgemeinen Gesundheit eines Menschen leisten.

4. Schreiben Sie eine Zusammenfassung und ein Fazit

Papieroption: Fassen Sie in einem (oder zwei) Absatz den Umfang des Projekts, die Idee, die Sie untersuchen, zusammen und formulieren Sie Ihre Abschlussarbeit neu. Fassen Sie in zwei bis vier Absätzen die Forschungsergebnisse zusammen, die Sie bei Ihrer Recherche in der wissenschaftlichen Literatur gefunden haben, und fügen Sie für jede Referenz das passende Zitat hinzu. Vergleichen und vergleichen Sie in einem letzten Absatz (oder zwei) die nicht-wissenschaftlichen Informationen mit dem, was Sie aus Ihrer Recherche in der Wissenschaft gelernt haben, und diskutieren Sie, ob die wissenschaftlichen Beweise Ihre These stützen oder ob die Beweise Ihre Ansicht nicht stützen . Überlegen Sie, ob Sie an Ihrer These festhalten oder diese ändern möchten und welche Ergänzungen aufgrund der wissenschaftlichen Erkenntnisse angebracht sein könnten.

PräsentationMöglichkeit: Entwickeln Sie Ihren Bericht mit PowerPoint (oder einer anderen Präsentationssoftware) zu einem zehnminütigen Vortrag, den Sie möglicherweise als mündliche Präsentation halten.


Flip-Flop um den Replikationsursprung und -terminus in prokaryotischen Genomen

Eine Antwort auf Hinweise auf symmetrische chromosomale Inversionen um den Replikationsursprung in Bakterien von JA Eisen, JF Heidelberg, O White, SL Salzberg. Genombiologie 2000, 1:Forschung0011.1-0011.9.

Das Problem der Umlagerungen in eng verwandten prokaryotischen Genomen wurde in letzter Zeit mehrfach diskutiert [1,2,3,4]. Ein charakteristisches Merkmal dieser Umlagerungen ist, dass viele Orthologe (Gene, die für die gleiche Funktion in verschiedenen Genomen kodieren) in der gleichen Entfernung vom Replikationsursprung oder -terminus bleiben, aber sie können auf einem der beiden Replichore positioniert werden (entgegengesetzt replizierte Hälften von das Genom [5], Abbildung 1). Ein spezifisches Bild erhält man, wenn man die Positionen von Genen in einem Genom gegen die Positionen ihrer Orthologe in einem eng verwandten Genom aufträgt (Abbildung 2a). Eine praktische Folgerung ist, dass orthologe Sequenzen, die in der gleichen Entfernung vom Ursprung oder Terminus der Replikation gefunden werden, wahrscheinlich für die gleiche Funktion kodieren. Es ist auch aus evolutionärer Sicht wichtig. Die Frage ist, warum können Gene zwischen Replikoren transloziert werden, aber ihr Abstand vom Ursprung oder Terminus der Replikation bleibt erhalten?

Die Topologie der bidirektionalen Replikation eines kreisförmigen prokaryotischen Chromosoms. Die durchgezogene Linie ist der DNA-Strang, der als führender Strang repliziert wird, die gestrichelte Linie ist der DNA-Strang, der als nachlaufender Strang repliziert wird Ori, der Replikationsursprung Ter, der Replikationsterminus. Ori und Ter teilen das Chromosom in zwei Replichore, die willkürlich links und rechts genannt werden.

Diagramme der relativen Positionen von Orthologen im Helicobacter pylori J99 und H. pylori 26695 Genome. Die Werte auf dem x und ja Achsen repräsentieren die Positionen von Genen auf Chromosomen, in Basenpaaren. (ein) Die nächsten Orthologe (beste Übereinstimmungen), die ihre Position nicht zwischen dem führenden und dem nacheilenden DNA-Strang vertauscht haben. (B) Alle Orthologe, die die Position zwischen den führenden und den nacheilenden DNA-Strängen vertauscht haben. Die Genomsequenzen und Orthologe, extrahiert aus der Datenbank von Clusters of Orthologous Groups ('COGs') [12], wurden vom National Center for Biotechnology Information [13] bezogen.

Tillier und Collins [4] haben argumentiert, dass ein wesentlicher Anteil der Neuanordnungen der Genordnung von Rekombinationsstellen herrührt, die durch die Positionen der Replikationsgabeln bestimmt werden. Ihre (plausible) Theorie ist, dass Replikationsgabeln Hot Spots für die Rekombination sind. Da die beiden Replikationsgabeln ungefähr den gleichen Abstand vom Ursprung haben (während der bidirektionalen Replikation), sind die Translokationen symmetrisch um die Ursprungs-Terminus-Achse. Daher sind nach Tillier und Collins [4] spezifische Beschränkungen der Rekombinationsmechanismen für die beobachtete Verzerrung in der Häufigkeit des Auffindens bestimmter Umlagerungsprodukte verantwortlich. Wir argumentieren, dass die Selektion hauptsächlich für den beobachteten Bias verantwortlich sein kann und die Wahrscheinlichkeit, dass ein Umlagerungsprodukt lebensfähig ist, von seiner Topologie abhängt.

Der erste Aspekt der Topologie, der zu verzerrten Genomumlagerungen führen könnte, ist der Abstand eines Gens vom Replikationsursprung, da dieser die relative Kopienzahl des Gens in jeder Zelle schnell wachsender Bakterienkulturen bestimmt. Wenn die Generationszeit kürzer als die Replikationsperiode ist, ist die Anzahl der Kopien von Genen, die nahe dem Ursprung liegen, höher als die Anzahl von Kopien von Genen, die nahe dem Terminus liegen. Somit führt Selektionsdruck zur optimalen Position von Genen in Bezug auf die Entfernung vom Replikationsursprung [6,7]. Infolgedessen beobachtet man neben einer Tendenz zu spezifischen Umlagerungen eine Asymmetrie in der Nukleotidzusammensetzung von Gensequenzen und eine verzerrte Aminosäurezusammensetzung von Proteinen, die von Genen entlang des Chromosoms kodiert werden [8].

Der zweite Faktor, der die Wahrscheinlichkeit bestimmter Genomumlagerungen beeinflussen kann, besteht darin, dass der replikationsbedingte Mutationsdruck für die führenden und die nacheilenden DNA-Stränge unterschiedlich ist. Unterschiedliche Akkumulationsraten von Nukleotid-Substitutionen an den führenden und nacheilenden Strängen legen nahe, dass es qualitative und quantitative Unterschiede in der Nukleotid-Zusammensetzung von Protein-kodierenden Sequenzen gibt, die auf verschiedenen DNA-Strängen liegen ([9] und Referenzen darin). Aus diesem Grund haben Sequenzen, deren Position kürzlich vom führenden zum nacheilenden Strang gewechselt wurde, oder und umgekehrt, sind anfälliger für die Anhäufung von Mutationen. Somit ändert jede Inversion eines Gens innerhalb des Replichores (Abbildung 3c) seinen Sense-Strang während der Replikation vom führenden zum nacheilenden Strang, oder und umgekehrt, und erhöht die Mutationsrate dieses Gens [10,11]. Wenn die Inversion den Replikationsursprung oder das Replikationsdatum umfasst, wird die Position des Gens (in Bezug auf die Replikationsrichtung) nicht verändert (Abbildung 3a,b). Tatsächlich wird der spezifische Bias in der Genomumlagerung nur für die „nächsten“ Orthologen (Top-Matches) beobachtet. Das charakteristische Diagramm in Abbildung 2a zeigt Orthologe, die ihre Position in Bezug auf das führende oder nacheilende Verhalten des DNA-Strangs nicht geändert haben. Eine Inversion innerhalb eines Relichors verändert jedoch die Position des Gens in dieser Hinsicht (Abbildung 3c). Sehr hohe Mutationsraten könnten ein Gen mit verändertem Strang eliminieren, es sei denn, die Inversion ist mit einer Duplikation verbunden. Bei einer Duplikation kann die zweite Kopie des Gens eine andere Rolle spielen, und sie könnte viel schneller divergieren, um beispielsweise einen Paralog zu generieren. In Abbildung 2b veranschaulichen wir die relativen Positionen von Genen, die ihre Position in Bezug auf die Replikationsrichtung geändert haben, die charakteristische diagonale Linie in Abbildung 2a, die die stark verzerrte Ausrichtung der Umlagerungen zeigt, ist verschwunden.

Folgen von Inversionen an verschiedenen Stellen eines prokaryotischen Chromosoms. Die grünen Pfeile zeigen Rekombinationsstellen an. Die schwarzen Pfeile repräsentieren einen Sense-Strang eines Gens. Beachten Sie, dass, wenn der Sense-Strang auf dem führenden DNA-Strang liegt, die Transkriptionsrichtung des Gens dieselbe ist wie die Richtung der Replikationsgabelbewegung. (ein) Eine symmetrische Inversion, die den Replikationsursprung umfasst. Nach der Inversion ändern sich die Abstände zum Ursprung und die Lage der Gene in Bezug auf die führenden und nacheilenden DNA-Stränge nicht. (B) Die invertierte Region umfasst den Ursprung, aber der Ursprung liegt nicht in der Mitte dieser Region. Als Ergebnis ändern sich die Längen der Replichore und die Abstände der nichtinvertierten Gene zum Ursprung, obwohl sich die Lage der Gene in Bezug auf die führenden und nacheilenden DNA-Stränge nicht ändert. (C) Eine Umkehrung innerhalb eines Relichores. Die Positionen der Gene innerhalb der invertierten Sequenz ändern sich in Bezug auf die führenden und nacheilenden DNA-Stränge. Darüber hinaus ändern Gene, die sich außerhalb des Zentrums der invertierten Region befinden, ihren Abstand zum Ursprung.

Die dritte Selektionskraft, die zu verzerrten Umlagerungen führen könnte, könnte der Trend sein, beide Replichore gleich groß zu halten (siehe auch [7]). Besteht ein Selektionsdruck, der dafür sorgt, dass die Länge der beiden Replichore in prokaryontischen Genomen nahezu gleich bleibt, sollten Inversionen symmetrisch zum Replikationsursprung oder -terminus bevorzugt werden. Abbildung 3b zeigt, wie ein Rekombinationsereignis, das den Replikationsursprung umfasst, aber mit dem Ursprung nicht im Zentrum des invertierten Fragments liegt, Replichore unterschiedlicher Länge erzeugt und die Abstände vom Ursprung zu Genen verändert, die außerhalb der invertierten Sequenz liegen.

Alle obigen Erklärungen schließen die Möglichkeit nicht aus, dass es Hot-Spots der Rekombination gibt, die mit den Replikationsgabeln verbunden sind, wie von Tillier und Collins [4] vorgeschlagen, aber wir möchten betonen, dass die Selektion wahrscheinlich eine sehr wichtige Rolle bei der Herstellung der seltsames X-Bild der Translokationstopologie in eng verwandten Genomen.

Jonathan A. Eisen antwortet:

Ich begrüße den Brief von Mackiewicz et al. in Bezug auf Ganzgenom-X-Alignments (die wir als X-Dateien bezeichnen). Ich stimme zu, dass die Selektion wahrscheinlich ein beitragender Faktor bei den Beobachtungen auf der Grundlage vergleichender Genomik ist, dass die Entfernung eines Gens vom Replikationsursprung über die Evolutionszeit hinweg erhalten bleibt [1,2,4]. Ihre Vorschläge für mögliche selektive Kräfte sind alle völlig vernünftig, und es wird sich lohnen, den Beitrag jedes einzelnen in zukünftigen Arbeiten zu verfolgen. Ich möchte jedoch auf einige zusätzliche Probleme im Zusammenhang mit den X-Akten hinweisen. Zunächst ist es wichtig anzumerken, dass einige sehr wichtige Arbeiten zu diesem Thema mit genetischen Ansätzen durchgeführt wurden [6,7,14,15,16,17,18,19,20]. Wie in einigen dieser Studien und von Mackiewicz et al., bedeutet das Vorliegen einer Selektion nicht unbedingt, dass Mutationsprozesse nicht auch ein wichtiger Faktor sind. Es ist wahrscheinlich, dass eine Art von Mutationsbias (z. B. Strangwechsel während der Replikation, wie von Tillier und Collins [4] vorgeschlagen) zu einer hohen Häufigkeit von Inversionen führt, die symmetrisch um den Replikationsursprung sind. Es ist wahrscheinlich, dass auch viele andere Inversionen auftreten. Somit ist eine negative Selektion (wie die Selektion gegen Veränderungen der Replichorgröße oder der Gendosis, wie von Mackiewicz . vorgeschlagen) et al.) führt dann wahrscheinlich dazu, dass die im Laufe der Evolution beobachteten Inversionen überwiegend symmetrisch um den Replikationsursprung sind. Was wir jetzt aus wissenschaftlicher Sicht brauchen, sind mehr Informationen über Häufigkeiten und Arten von Genominversionen, die ohne Selektion auftreten, sowie Informationen über die Fitnessunterschiede zwischen Stämmen mit unterschiedlichen Inversionen.

Darüber hinaus möchte ich die Vermutung kommentieren, dass die Beobachtung des X-Alignment-Musters helfen kann, funktionelle Vorhersagen für Gene zu treffen. Mackiewicz et al. vermuten, dass man, wenn man homologe Gene im gleichen Abstand vom Replikationsursprung findet, auf die gleiche Funktion schließen kann. Ich würde vorschlagen, dass dies kein gutes funktionelles Vorhersagekriterium ist. Wie bereits erwähnt [1], finden sich innerhalb einzelner Genome häufig Paare paraloger Gene auf beiden Seiten des Replikationsstartpunkts in gleichen Abständen (was zu einem X-Muster innerhalb des Genoms führt). Wir vermuteten, dass dies wahrscheinlich auf Inversionen zurückzuführen ist, die parallel duplizierte paraloge Gene aufspalten. Da eines oder beide dieser Gene in ihrer Funktion von der eines gemeinsamen Vorfahren abweichen können, hilft ihre Position vom Replikationsstartpunkt nicht bei der Vorhersage ihrer Funktion im Vergleich zu anderen Arten. Da orthologe Gene nicht immer die gleiche Funktion haben, auch ohne das Auftreten von Tandemduplikationen, ist die Genomlokalisierung wahrscheinlich kein zuverlässiger Prädiktor für die Genfunktion. Obwohl ich glaube, dass das X-Alignment-Muster viel über Mutations- und Selektionsdruck in Bezug auf Inversionen und Genomposition aussagt, bin ich nicht davon überzeugt, dass die Funktion eines Gens leicht vorhergesagt werden kann, indem homologe Gene identifiziert werden, die äquidistant vom Replikationsursprung entfernt sind.

Das Institut für Genomforschung, 9712 Medical Center Drive, Rockville, MD 20850, USA. E-Mail: [email protected]


Ein Stoffwechselweg zum Abbau von Lävulinsäure in Bakterien

Mikroorganismen können ein breites Spektrum organischer Verbindungen abbauen und haben daher das Potenzial, viele industriell relevante Biokonversionen durchzuführen. Ein Hindernis bei der Realisierung des Potenzials von Bioraffinationsstrategien liegt in unserem unvollständigen Wissen über Stoffwechselwege, einschließlich derjenigen, die zur Assimilation natürlich reichlich vorhandener oder leicht zu erzeugender Rohstoffe verwendet werden können. Lävulinsäure (LA) ist beispielsweise eine Kohlenstoffquelle, die leicht als Dehydratisierungsprodukt von lignocellulosehaltiger Biomasse erhältlich ist und für einige Bakterien als einzige Kohlenstoffquelle dienen kann. Die Genetik und Struktur des LA-Katabolismus sind jedoch unbekannt geblieben. Hier berichten wir über die Identifizierung und Charakterisierung eines Sieben-Gen-Operons, das den LA-Katabolismus in Pseudomonas putida KT2440 ermöglicht. Als der Weg mit gereinigten Proteinen rekonstituiert wurde, beobachteten wir die Bildung von vier Acyl-CoA-Zwischenprodukten, darunter ein einzigartiges 4-Phosphovaleryl-CoA und das zuvor beobachtete 3-Hydroxyvaleryl-CoA-Produkt. Durch adaptive Evolution erhielten wir eine Mutante von Escherichia coli LS5218 mit funktionellen Deletionen von fadE und atoC, die zu einem robusten Wachstum auf LA fähig war, wenn sie die fünf Enzyme des P. putida-Operons exprimierte. Diese Entdeckung wird eine effizientere Nutzung von Biomassehydrolysaten und Metabolic Engineering ermöglichen, um Biokonversionen unter Verwendung von LA als Ausgangsmaterial zu entwickeln.

Figuren

Abbildung 1. Genetische Charakterisierung und vorgeschlagene katabole…

Abbildung 1. Genetische Charakterisierung und vermutete katabole Aktivität des P. putida lva Operon

Abbildung 2. Enzymatische Aktivität und Charakterisierung des Stoffwechselwegs…

Abbildung 2. Enzymatische Aktivität und Charakterisierung des Stoffwechselwegs für lva Operon


Fluoreszierende D-Aminosäuren zeigen bizelluläre Zellwandmodifikationen, die für die Prädation von Bdellovibrio bacteriovorus wichtig sind

Die Modifikation essentieller bakterieller Peptidoglycan (PG)-haltiger Zellwände kann zu Antibiotikaresistenz führen, beispielsweise β-Lactam-Resistenz durch L,D-Transpeptidase-Aktivitäten. Raubtiere Bdellovibrio bacteriovorus sind von Natur aus antibakteriell und bekämpfen Infektionen, indem sie die Wände von Gram-negativen Beutebakterien durchqueren, modifizieren und schließlich zerstören, indem sie ihr eigenes PG modifizieren, während sie in der Beute wachsen. Historisch gesehen haben sich diese multienzymatischen Prozesse an zwei ähnlichen PG-Wänden als schwierig zu erklären erwiesen. Hier beleuchten wir mit einem PG-Markierungsansatz, der zeitgesteuerte Pulse von mehreren fluoreszierenden D-Aminosäuren verwendet, dynamische Veränderungen, die Räuber- und Beutewände während der verschiedenen Phasen der Bakterien-Bakterien-Invasion durchlaufen. Wir zeigen die Bildung eines verstärkten runden Bullauges in der Beutewand, L,D-TranspeptidaseBd-vermittelte D-Aminosäure-Modifikationen, die das Beute-PG während der Bdellovibrio-Invasion stärken, und eine zonale Form der Raubtierverlängerung. Diesem Prozess folgt eine unkonventionelle Mehrpunkt- und synchrone Septierung des intrazellulären Bdellovibrio, die die ungerade und geradzahlige Nachkommenbildung durch nicht-binäre Teilung ermöglicht.

Interessenkonflikt-Erklärung

Die Autoren erklären keine konkurrierenden finanziellen Interessen.

Figuren

Abb. 1. Hintergrund und Einführung in experimentelle…

Abb. 1. Hintergrund und Einführung in experimentelle Verfahren

Abb. 2. Dreidimensional strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebilder…

Abb. 2. Dreidimensional strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebilder der frühen Prädation durch B. Bakteriovoren (vorbeschriftet mit…

Abb. 3. Dreidimensional strukturierte Mikroskopiebilder mit strukturierter Beleuchtung…

Abb. 3. Dreidimensional strukturierte Beleuchtungsmikroskopiebilder von frühen Prädationen durch B. Bakteriovoren (vorbeschriftet mit…

Abb. 4. Quantitative und qualitative Effekte von…

Abb. 4. Quantitative und qualitative Effekte zweier L,D-Transpeptidasen auf Beutezellwandmodifikationen durch…

Abb. 5. Diagramme, die den Einbau von HADA in…

Abb. 5. Diagramme, die den Einbau von HADA in das PG von Beutetieren zeigen E coli Mutanten auf…

Abb. 6. Epifluoreszenz- und 3D-SIM-Bilder von…

Abb. 6. Epifluoreszenz- und 3D-SIM-Bilder der späteren Prädationsstadien zur Darstellung von PG…


MATERIALEN UND METHODEN

Materialien

Saccharomyces cerevisiae, Pinienpollen (Störpulver) und Kapokfasern wurden vom Markt gekauft. Lotusgefäße wurden aus den Lotuswurzeln extrahiert und menschliches Haar wurde von Autor X.Y. Rhodospirillum rubrum wurde bereitgestellt von P. Wu (Harbin University of Commerce) S. platensis, C. reinhardtii, T. subcordiformis, und Chlorella salina wurden von Y. Zhang (Qingdao Agricultural University) bereitgestellt und das Zellwachstumsmedium wurde von L. Bian (Chinese University of Hong Kong) bereitgestellt. Eisenchlorid (FeCl3), Eisen(II)-chlorid-Tetrahydrat (FeCl2·4H2O) und Dextrosemonohydrat wurden von Acros Organics (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) bezogen, Natriumhydroxid (NaOH, ~98%, Pellets) wurde von Aladdin (China) bezogen, Salzsäure (HCl, 5 M) wurde von BDH&sub2; Prolabo (VWR International SAS, Frankreich), absolutes Ethanol und IPA wurden von EMSURE (EMD Millipore Corporation, Deutschland) bezogen, Schweinehautgelatine (Typ A) wurde von Sigma-Aldrich (USA) bezogen und DPBS wurde von Gibco (Thermo Fisher Scientific®) bezogen Inc., USA). Pufferlösungen von pH 4,0, pH 6,86 und pH 9,18 wurden unter Verwendung von Kalibrierpufferpulver eines CHEETAH pH-Meters (PHS-3C) hergestellt. Die Fibroblastenzelllinie 3T3, die Krebszelllinie SiHa und die Leberzelllinie Hepatozelluläres Karzinom Hep G2 wurden von ATCC (USA) bezogen. Alle chemischen Reagenzien wurden ohne weitere Reinigung verwendet.

Synthese von Fe3Ö4 NP-Aufhängungen

Fe3Ö4 NP-Suspensionen wurden nach der Copräzipitationsmethode hergestellt (41, 45, 46), mit einem typischen Prozess, der in einem KUSON-Ultraschallbad durchgeführt wird (Degas-Modal, 20 kHz, 0,35 W/cm 2 ). Zuerst wurden 10 ml NaOH-Lösung (0,5 M) tropfenweise zu einer wässrigen FeCl&sub2;3 (0,008 M)–FeCl2 (0,016 M) Mischung bei 50°C, was zu einer schwarzen Suspension führte. Zweitens wurde nach 60 min Beschallung die schwarze Suspension wiederholt zentrifugiert (10.000 UpM, 15 min) und dreimal in DI-Wasser (über Beschallung) redispergiert. Zuletzt wurden 100 &mgr;l HCl-Lösung (5 M) zu der endgültigen redispergierten Suspension zugegeben, gefolgt von einer weiteren Beschallung für 60 Minuten. Dann ist positiv geladenes Fe3Ö4 NP-Suspensionen (ca. pH 2,1) wurden erhalten.

Tauchbeschichtungsverfahren

Das Tauchbeschichtungsverfahren von biologischen Matrices wurde bei Umgebungstemperatur und -druck in einer Lösung (ca. pH 3,0) des obigen Fe . durchgeführt3Ö4 NP-Suspension dispergiert in 50 ml DI-Wasser, enthaltend etwa 9,28 mg Magnetit-NPs (Trockengewicht). Alle biologischen Proben wurden dreimal mit DI-Wasser gewaschen, bevor sie der Lösung zugesetzt wurden. Um ihre Körperlänge zu verkürzen, haben wir sie zusätzlich beschallt S. platensis Probe für 15 min (20 kHz, 0,35 W/cm 2 ). Das Tauchbeschichtungsverfahren wurde ohne kontinuierliches hartes Schütteln durchgeführt. Es wurde nur intermittierend sanft geschüttelt, um die Agglomeration biologischer Proben zu vermeiden. Nach dem Tauchbeschichtungsverfahren wurden die Endprodukte durch Zentrifugation getrennt und dann in DI-Wasser gelagert.

Strukturelle Charakterisierung

Optische Bilder wurden von einem OLYMPUS-Lichtmikroskop aufgenommen, das mit einem PC mit einer ladungsgekoppelten Gerätekamera verbunden war. FESEM-Bilder wurden unter Verwendung eines FEI Quanta 400F-Mikroskops mit einer Beschleunigungsspannung von 10 kV aufgenommen. Um ihre Leitfähigkeit zu verbessern, wurden alle Proben, sofern nicht anders angegeben, einer Goldzerstäubung bei 10 mA für 45 s unter Verwendung einer SC 502 Ion Sputter Coating Machine (POLARON) unterzogen. Transmissionselektronenmikroskopiebilder wurden unter Verwendung eines FEI Tecnai Spirit-Elektronenmikroskops mit einer Beschleunigungsspannung von 200 kV aufgenommen. Die Elementanalyse wurde mit einem EDX-Analysator (montiert am FEI Quanta 400F) mit einer Beschleunigungsspannung von 20 kV durchgeführt. Ein Röntgenbeugungstest wurde auf einem Smartlab (Rigaku) ​​Diffraktometer unter Verwendung eines Cu-Targets (40 kV, 40 mA) durchgeführt. Transmissions-Fourier-Transformations-Infrarot (FTIR)-Test wurde in einem Thermo Scientific Nicolet iS10 FTIR-Spektrometer unter Verwendung der typischen KBr-Pressscheibentechnik (2 mg Probe und 200 mg KBr) durchgeführt. Alle FESEM-Proben, entweder magnetisiert oder nicht, wurden in einem ilShinBioBase-Gefriertrockner (TFD8503) gefriergetrocknet, sofern nicht anders angegeben.

Charakterisierung von Magnet-, Antriebs- und Fluoreszenzeigenschaften

Magnetische Eigenschaften der magnetischen Mikroroboter wurden unter Verwendung eines Vibrationsprobenmagnetometers (VSM PPMS Modell 6000 Quantum Design) bei Raumtemperatur gemessen. Die Antriebstests wurden entweder mit homogenen rotierenden oder periodisch variierenden Magnetfeldern durchgeführt, die von einem speziell angefertigten triaxialen Helmholtz-Spulensystem erzeugt wurden. Die Hellfeld- und Fluoreszenzbilder wurden in DI-Wasser unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Leica SP8 aufgenommen. Die Fluoreszenzspektren wurden unter Verwendung eines Hitachi F-7000 Fluoreszenzspektrophotometers, ausgestattet mit einer L2175 Xenonlampe (HAMAMATSU), aufgezeichnet. Die Testauflösung betrug 1,0 nm und die Testparameter wurden wie folgt eingestellt: Abtastrate bei 1200 nm/min Anregung und Emissionsspaltbreite bei 5,0 nm. Hochpass-Emissionsfilter von 420, 500 und 580 nm wurden für die 405-, 488- bzw. 552-nm-Anregung verwendet.

Fluoreszenzbasierte In-vivo-Bildgebung

In-vivo-Bildgebungsexperimente basierend auf MPSDie Autofluoreszenz von Balb/c wurde im subkutanen Gewebe und in der intraperitonealen Höhle von athymischen Balb/c-Mäusen durchgeführt, die im Laboratory Animal Services Center der Chinese University of Hong Kong gezüchtet und gehalten wurden. Das 6-, 24- und 72-Stunden-Eintauchen S. platensis wurden in 1 ml DI-Wasser dispergiert, um Lösungen mit Konzentrationen von 0, 50, 100, 200, 400 und 800 µg/ml zu erhalten. Die so hergestellten Lösungen wurden dann zur Sterilisation vor der Injektion 1 Stunde mit ultraviolettem Licht bestrahlt. Experimente zur In-vivo-Bildgebung wurden wie folgt durchgeführt: (i) Die Mäuse wurden mit Ketamin (75 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) anästhesiert und flach auf eine starre Unterlage gelegt, und (ii) alle Mäuse wurden mit subkutane Injektion (100 μl) oder intraperitoneale Injektion (300 μl). Die subkutane Gruppe wurde sofort mit einem DsRed-Anregungsfilter und einem 660-nm-Emissionsfilter unter Verwendung eines IVIS 200-Bildgebungssystems (Xenogen Imaging Technologies, Alameda, CA) abgebildet, und die intraperitoneale Gruppe wurde alle 5 Minuten abgebildet. Für Experimente zur Fluoreszenzintensität gegenüber der Verweilzeit wurden 12 Mäuse subkutan in eine biologische Sicherheitswerkbank (1300 Serie A2, Thermo Fisher Scientific Inc., USA) injiziert und dann zum Fortsetzen in das Laboratory Animal Services Center der Chinese University of Hong Kong zurückgebracht Zucht. Die Fluoreszenzsignale wurden nach 15, 24, 48 bzw. 72 Stunden aufgezeichnet.

T2-gewichtete in vitro MR-Bildgebung

Alle MR-Bilder wurden in einem Wasserbad (20 cm × 12 cm × 8 cm) aufgenommen, das sich in einer Sende-Empfangs-Kopfspule unter Verwendung eines klinischen 3,0-T-Ganzkörper-MR-Geräts (Achieva TX Philips Medical Systems, Best, Niederlande) befand. T2-gewichtete MR-Bildgebung wurde mit einer standardmäßigen Carr-Purcell-Meiboom-Gill-Pulssequenz gemessen, mit TR (Wiederholungszeit) = 2000 ms, TE (Zeit des Echos) = 30 bis 960 ms, 32 Echos, Sichtfeld = 134 × 67 mm, Matrix = 128 × 64, Schichtdicke = 5 mm. Um sicherzustellen, dass die Verteilung von MSP während der MR-Bildgebung homogen ist, wurden alle getesteten Proben mit Schweinehautgelatine (Typ A) in 1,5-ml-Zentrifugenröhrchen (Thermo Fisher Scientific Inc., USA) fixiert.

T2-gewichtete in vivo MR-Bildgebung

Für Tierversuche wurden weibliche SD-Ratten (250 bis 280 g) verwendet, die im Laboratory Animal Services Center der Chinese University of Hong Kong gezüchtet und gehalten wurden. Die Versuchsprotokolle wurden von der Ethikkommission für Tierversuche der Chinesischen Universität Hongkong genehmigt und vom Gesundheitsministerium der Sonderverwaltungszone Hongkong lizenziert. Für die MR-Bildgebung im subkutanen Gewebe wurden zwei SD-Ratten mit Ketamin (80 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert und flach auf eine starre Unterlage gelegt. Sie erhielten eine subkutane Injektion mit jeweils 100 µl von 4 und 8 mg/ml . MSP72h-PO-Lösungen und dann nacheinander in einen klinischen 3,0-T-MR-Scanner für die MR-Bildgebung (Achieva TX Philips Medical Systems, Best, Niederlande) platziert. Der Hochfrequenzsender und -empfänger war eine menschliche Handgelenkspule. Für die MR-Bildgebung des Magens wurden drei weitere Ratten durch intragastrische Verabreichung von 1 ml PO, 1 ml 4 mg/ml . gefüttert MSP72h-PO-Lösung und 1 ml 8 mg/ml MSP72h-PO-Lösung. Nach 5 min wurde jede Ratte mit Ketamin (80 mg/kg)/Xylazin (10 mg/kg) durch intraperitoneale Injektion anästhesiert und im selben Scanner für die MR-Bildgebung fixiert. Drei weitere Ratten wurden mit 8 mg gefüttert MSP-72h pro 1 ml PO, mit Ketamin anästhesiert und dann mit verschiedenen Magnetfeldern behandelt. Die ersten beiden wurden 5 bzw. 12 min mit einer Drehzahl behandelt und die dritte Ratte wurde 12 min mit dem gleichen Permanentmagneten aber ohne Rotation behandelt. Die wichtigsten MR-Bildgebungsparameter sind: Turbo-Spinecho-Sequenz, TR = 4200 ms, TE = 80 ms, Flipwinkel = 90°, Schichtdicke = 3 mm, Anzahl der Anregungen = 4, Echozuglänge = 16, Pixelgröße = 0,2 mm × 0,2 mm.

Abbauversuche

Tests zur biologischen Abbaubarkeit wurden für 0-/6-/24-/72-Stunden-Tauchen durchgeführt S. platensis. Jede Probe (gefriergetrocknet, 2 mg) wurde in ein konisches 50-ml-Zentrifugenröhrchen von Thermo Scientific Nunc, das 20 ml DPBS enthielt, gegeben und dann in einem 5 % CO&sub2;2–95 % luftbefeuchtete Atmosphäre bei 37 °C. Zu jedem vorgesehenen Zeitpunkt wurden 500-, 100- und 50-μl-Proben nacheinander aus dem Röhrchen entnommen und jeweils mit Fluoreszenzspektrophotometrie, FESEM und optischer Mikroskopie charakterisiert. Die extrahierten FESEM-Proben wurden durch Zentrifugation dreimal mit DI-Wasser gewaschen.

Zellkultur und Subkultur

Die Fibroblasten-Zelllinie 3T3 wurde mit minimal essentiellem Medium bei 37 °C in einer 5% CO .-Kultur kultiviert2–95 % luftbefeuchtete Atmosphäre. Als die Zellkonfluenz etwa 75 bis 80 % erreichte, wurden die Zellen mit sterilem PBS gewaschen. Als nächstes wurde das Trypsin mit Vollmedium neutralisiert (Invitrogen, CA, USA) und mit PBS gewaschen. Dann wurden die Zellen durch Zentrifugation (1000g 5 Minuten lang). Anschließend wurde das Zellpellet mit frischem Vollmedium resuspendiert und auf vier Plastik-Gewebekulturschalen (100 mm) passagiert. Zuletzt wurden sie bei 37 °C in einem 5 % CO . inkubiert2–95 % luftbefeuchtete Atmosphäre zur Proliferation. Die Zervixkarzinomzelllinie SiHa wurde nach dem gleichen Protokoll kultiviert.

MTT-Assay

Der MTT-Assay wurde für MSP Proben mit drei Zelllinien, einschließlich der Fibroblasten-Zelllinie 3T3, der Zervixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Leber-Hepatozellulären Karzinom-Zelllinie Hep G2. Alle Experimente wurden zur Verifizierung dreimal wiederholt.3T3-, SiHa- und Hep-G2-Zellen wurden separat in drei 96-Well (4000 Zellen pro Well) Kulturplatten (Invitrogen) ausgesät und bei 37 °C in einem 5% CO2–95 % luftbefeuchtete Atmosphäre. Nach 24 Stunden Inkubation, damit die Zellen anhaften, wurde das Kulturmedium durch ein frisches Medium ersetzt, das MSP Proben mit Konzentrationen von 0, 25, 50, 100, 200, 400 und 800 µg/ml (sechs replizierte Wells für jede Konzentration mit einem Endvolumen von 100 µl pro Well). Nach weiteren 24 bzw. 48 Stunden Inkubation wurde das Kulturmedium vorsichtig entfernt und die Zellen zweimal mit PBS gewaschen. Anschließend wurden 150 µl MTT (0,5 mg/ml) zugegeben. Nach 4 Stunden Inkubation wurde das Kulturmedium erneut vorsichtig entfernt und 150 µl DMSO pro Well zugegeben, gefolgt von 10 min Schütteln auf einem Horizontalschüttler. Die Absorption wurde unter Verwendung eines Enzymmarkierungs-Analysegeräts (Biotek Synergy 2, BioTek, USA) bei 570 nm abgelesen. Die durchschnittliche Extinktion ergibt das Ergebnis der Zelllebensfähigkeit.

Immunfluoreszenzfärbung

3T3- und SiHa-Zellen wurden auf Gläsern ausgesät, die in Platten mit sechs Vertiefungen (10.000 Zellen pro Vertiefung) platziert wurden. Jede Vertiefung wurde mit 2,5 ml modifiziertem Eagle-Medium von Dulbecco gefüllt, einschließlich 10 % fötalem Rinderserum und 1 % Penicillin-Streptomycin. Nach 24 Stunden Inkubation MSP-24h (0, 100 und 400 μg/ml) Proben wurden zugegeben und mit den 3T3- und SiHa-Zellen für 24 und 48 Stunden cokultiviert. Zu bestimmten Zeitpunkten (d. h. 24 und 48 Stunden) wurden mit Zellen bedeckte Gläser aus den Plattenvertiefungen entnommen, gefolgt von drei wiederholten Spülungen mit PBS (Gibco). Die gespülten Zellen auf Gläsern wurden anschließend mit einer 30-minütigen Fixierung in 4% Paraformaldehyd (Sigma-Aldrich) behandelt. Nach dreimaligem Waschen mit PBS wurden die fixierten Zellen bald 30 min in 0,3% Triton X-100 (Sigma-Aldrich) getaucht. Als nächstes wurden permeabilisierte Zellen für 30 min mit 2% Rinderserumalbumin (Sigma-Aldrich) blockiert. Dann waren diese vorbehandelten Zellen bereit, gefärbt zu werden. Die Zytoskelett-Färbung wurde mit 90-minütiger Inkubation der vorbehandelten Zellen in PBS-verdünntem Fluorescein-Phalloidin (200:1, Volumenverhältnis) durchgeführt, und die Kerngegenfärbung wurde mit 30-minütiger Inkubation in PBS-verdünntem 6-Diamidino-2-phenylindol durchgeführt (1:1000, Volumenverhältnis) nach dreimaligem Waschen mit 0,1 Gew.-% Tween 20 (PBS). Um ein Photobleichen zu vermeiden, wurden alle Färbeprozesse in einer dunklen Umgebung durchgeführt. Alle Schritte für die Immunfluoreszenzfärbung wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Fluoreszenzbilder wurden dann unter Verwendung eines konfokalen Laser-Scanning-Mikroskops Zeiss LSM 700 aufgenommen.


Praktische Arbeit zum Lernen

Hinweise basierend auf Informationen in 'Grundlagen der praktischen Mikrobiologie' © Gesellschaft für Allgemeine Mikrobiologie.

Beziehen Sie sich auf das Standardverfahren Aseptische Techniken, bevor Sie mit dieser oder anderen mikrobiologischen praktischen Arbeiten beginnen.

Ausgebreitete oder „Rasen“-Platten sollten zu einem starken, oft konfluenten Wachstum der Kultur führen, die gleichmäßig über die Oberfläche des Wachstumsmediums verteilt ist. Damit lässt sich die Empfindlichkeit von Bakterien gegenüber vielen antimikrobiellen Substanzen testen, zum Beispiel Mundspülungen, Knoblauch, Desinfektionsmittel und Antibiotika.

In einigen Situationen ist eine Gießplatte besser für die Arbeit mit antimikrobiellen Mitteln geeignet, da es wichtig ist, dass eine Streuplatte vollständig getrocknet ist, bevor andere Materialien hinzugefügt werden, wie z. B. mit antimikrobiellen Mitteln getränkte Papierscheiben.

Die Streuplatte kann für quantitatives Arbeiten verwendet werden (Kolonie zählt – aber siehe Anmerkung 1). Wenn die Verdünnung und das Volumen des Inokulums bekannt sind (das Volumen beträgt normalerweise 0,1 cm 3 ), können Sie die Keimzahl der Probe bestimmen. Die lebensfähige Anzahl ist die Anzahl der Bakterien oder Bakterienklumpen pro cm 3 . Sie können die Keimzahl bestimmen, wenn Ihre gewählte Verdünnung zwischen 30 und 100 separate zählbare Kolonien produziert.

Gesundheits- und Sicherheitshinweise und technische Hinweise

1 Sterile Streuer werden verwendet, um das Inokulum auf der Oberfläche von vorbereiteten Agarplatten zu verteilen. Sie können einen verpackten Glasstreuer in einem Heißluftofen sterilisieren oder durch Beflammen mit Alkohol sterilisieren.

2 Um einen Streuer mit Alkohol abzuflammen:
ein Tauchen Sie das untere Ende des Streuers in eine kleine Menge Alkohol (70% IDA), die sich in einem Gefäß mit Deckel (entweder Schraubverschluss oder Aluminiumfolie) oder in einer Petrischale aus Glas (kein Plastik) mit Deckel befindet. Halten Sie den Alkoholbehälter abgedeckt und 1 Meter von der Flamme des Bunsenbrenners entfernt.

B Schnell durch eine Bunsenbrennerflamme gehen, um den Alkohol zu entzünden. Achten Sie beim und nach dem Anzünden des Alkohols darauf, dass der Streuer nach unten zeigt, damit Sie sich nicht verbrennen.

C Entfernen Sie den Streuer von der Flamme und lassen Sie den Alkohol abbrennen. Der brennende Alkohol sterilisiert das Glas.

D Stellen Sie den Streuer nicht auf die Bank.

3 Anstelle von Glasstreuern können Wattestäbchen verwendet werden. Sie können bevorzugt sein, da sie die Verwendung von Alkohol als Sterilisationsmittel vermeiden. Bereiten Sie sie vor, indem Sie kleine Stücke saugfähiger Watte um ein Ende eines Cocktailstäbchens rollen. Einzeln in Alufolie einwickeln oder in eine Universalflasche geben, um sie in einem Autoklaven oder Schnellkochtopf zu sterilisieren. Diese sterilen Tupfer können dann in die zu übertragende Lösung oder Kultur getaucht, auf die Oberfläche der Agarplatte gerieben und sofort in Desinfektionsmittel entsorgt werden. (Hinweis: Wattestäbchen vom Apotheker sind nicht steril und können mit einem antimikrobiellen Wirkstoff imprägniert sein.)

4 Verwenden Sie Agarplatten mit einer gut getrockneten Oberfläche, damit das Inokulum schnell trocknet. Trocknen Sie die Oberfläche der Agarplatten durch mehrstündiges Inkubieren (evtl. über Nacht) oder legen Sie sie 30-60 Minuten lang in einen Heißluftofen (bei 55-60 °C) mit den beiden Hälften getrennt und den Innenflächen nach unten gerichtet.

5 Abschnitt 15.2.12 des CLEAPSS-Laborhandbuchs schlägt einige alternative Methoden zur Herstellung einer Streu- oder Rasenplatte vor und betrachtet deren Vor- und Nachteile.

6 Die kalibrierte Tropfenmethode (Miles & Misra) für Koloniezählungen von Reinkulturen von Bakterien und Hefe ist eine wirtschaftlichere Methode als Gieß- oder Ausstreichplatten. Die Methode von Miles & Misra ist jedoch normalerweise nicht für Mischkulturen geeignet, die aus natürlichen Proben wie Boden gewonnen werden. Das Verfahren ist wie beim Streuteller, es werden jedoch weniger Teller benötigt, weil:

  • das Inokulum wird als Tropfen aus einer Tropfpipette abgegeben, die (nach dem Außendurchmesser der Spitze) kalibriert ist, um Tropfen des gemessenen Volumens (z. B. 0,02 cm 3 ) abzugeben.
  • viele Tropfen (sechs oder mehr) können auf einen Teller gegeben werden.

Verfahren

Vorbereitung

ein Lösen Sie den Verschluss der Flasche/des Reagenzglases mit der Kulturbrühe.

B Nehmen Sie eine sterile Pasteurpipette aus ihrem Behälter und befestigen Sie mit der rechten Hand einen Sauger.

C Halten Sie die sterile Pipette in der rechten Hand und die Flasche/das Reagenzglas mit der Kulturbrühe in der linken Hand.

D Verschlusskappe/ Wattebausch der Flasche/ des Reagenzglases mit dem kleinen Finger der rechten Hand entfernen und den Hals abflammen.

e Drücken Sie die Zitze der Pipette zusammen und ziehen Sie eine kleine Menge Brühe auf.

F Flamme den Hals der Flasche/des Reagenzglases ab und setze die Kappe/den Stopfen wieder auf.

g Heben Sie mit der linken Hand den Deckel einer Petrischale mit dem festen Nährmedium teilweise an.

h Geben Sie einige Tropfen Kultur auf die Oberfläche – ca. 0,1 cm 3 / ca. 5 Tropfen/
genug, um ein 5-Pence-Stück zu bedecken.

ich Setzen Sie den Deckel der Petrischale wieder auf.

J Legen Sie die Pipette in einen Abfallbehälter mit Desinfektionsmittel.

k Einen Glasstreuer in Alkohol (70% IDA) tauchen, abflammen und den Alkohol abbrennen lassen (Anmerkung 2).

l Heben Sie den Deckel der Petrischale an, damit der Streuer eintreten kann.

m Platzieren Sie den Streuer auf der Oberfläche des beimpften Agars. Bewegen Sie den Streuer von oben nach unten oder von einer Seite zur anderen, um das Inokulum über die Oberfläche des Agars zu verteilen. Stellen Sie sicher, dass die gesamte Agaroberfläche bedeckt ist.

n Setzen Sie den Deckel der Petrischale wieder auf.

Ö Den Streuer mit Alkohol abflammen (Anmerkung 2).

P Lassen Sie das Inokulum trocknen (Hinweis 4). Dies wird einige Zeit dauern.

Q Wenn die Platte nicht zur Beurteilung der Population in einer seriellen Verdünnung hergestellt wurde, kann sie nun vor dem Tapen und Inkubieren weiterbehandelt werden, z. B. zum Testen von Antibiotika.

R Kleben Sie die Platte mit Klebeband zu und inkubieren Sie sie in umgekehrter Position.

Web-Links

Ressourcen für Lehrkräfte für Mikrobiologie
Gesellschaft für Allgemeine Mikrobiologie – Quelle für Grundlagen der praktischen Mikrobiologie, ein ausgezeichnetes Handbuch der Labortechniken und der praktischen Mikrobiologie für die Sekundarstufe, eine Auswahl bewährter Praktika mit Mikroorganismen.

Mikrobiologie online
MiSAC (Microbiology in Schools Advisory Committee) wird von der Society for General Microbiology (siehe oben) unterstützt und ihre Websites enthalten weitere Sicherheitsinformationen und einen Link, um per E-Mail um Rat zu fragen.

(Aufgerufene Webseiten im Oktober 2011)

© 2019, Royal Society of Biology, 1 Naoroji Street, London WC1X 0GB Registered Charity No. 277981, Incorporated by Royal Charter


Laborsicherheitspraktiken und -verfahren

  1. Denken Sie daran, dass alle Bakterien potenzielle Krankheitserreger sind, die unter unerwarteten oder ungewöhnlichen Umständen Schaden anrichten können. Wenn Sie als Student ein geschwächtes Immunsystem haben oder kürzlich eine längere Krankheit haben, sollten Sie diese persönlichen Umstände mit Ihrem Laborlehrer teilen.
  2. Informieren Sie sich, wo sich im Labor spezielle Sicherheitsausrüstung befindet, z. B. der Feuerlöscher und die Augenspülstation.
  3. Erkennen Sie das internationale Symbol für Biogefährdung und wissen Sie, wo und wie alle Abfallmaterialien, insbesondere Biogefährdungsabfälle, zu entsorgen sind. Beachten Sie, dass alle biologisch gefährlichen Abfälle im Autoklaven sterilisiert werden müssen, bevor sie dem Abfallstrom zugeführt werden können.
  4. Bewahren Sie alles außer den Kulturen und Werkzeugen, die Sie benötigen, vom Labortisch auf.
  5. Alle Geräte und Materialien, die in Experimenten mit Bakterienkulturen verwendet werden, sollten sterilisiert werden. Dazu gehören die von Ihnen verwendeten Medien und auch die Werkzeuge, die zum Transferieren von Medien oder Bakterien verwendet werden, wie die Inokulationsinstrumente (Schlaufen und Nadeln) und Pipetten für den Flüssigkeitstransfer.
  6. Der Transfer von Flüssigkulturen mit einer Pipette sollte NIEMALS durch den Mund abgesaugt werden.
  7. Desinfizieren Sie Ihren Arbeitsbereich VOR und NACH der Arbeit mit Bakterienkulturen.
  8. Im Falle eines versehentlichen Verschüttens einer Bakterienkultur den Verschüttungsbereich vollständig mit Desinfektionsmittel tränken, dann mit Papiertüchern abdecken und die verschüttete Flüssigkeit 10 Minuten ruhen lassen. Anschließend die getränkten Papiertücher vorsichtig entfernen, im Biomüll entsorgen und den Bereich erneut mit Desinfektionsmittel reinigen.
  9. Tragen Sie Handschuhe, wenn Sie mit Kulturen arbeiten, und entsorgen Sie die Handschuhe nach Abschluss Ihrer Arbeit im Biomüll. Eine Schutzbrille oder Schutzbrille wird ebenfalls empfohlen.
  10. Langes Haar sollte zurückgezogen werden, um es von Bakterienkulturen und offenem Feuer fernzuhalten.
  11. Stellen Sie sicher, dass die Labortische vollständig geräumt sind (alles entweder weggeworfen oder in den Lagerbereich zurückgebracht), bevor Sie das Labor verlassen.

Bakterien stellen sowohl in einer kontrollierten Laborumgebung als auch in ihrer natürlichen Umgebung ein unterschiedliches Risiko dar. Daher variiert auch die erforderliche Eindämmungsstufe für das sichere Arbeiten mit Bakterienkulturen gemäß einem System, das Mikroben in eine von vier Biosicherheitsstufen (BSL) einstuft, die Mindeststandards für den sicheren Umgang mit Mikroben auf jeder Stufe vorgeben. BSLs werden von den Centers for Disease Control and Prevention (CDC) für Labors in den Vereinigten Staaten definiert und Eindämmungspraktiken detailliert beschrieben. Das vollständige Dokument „Biosicherheit in Mikrobiologische und Biomedizin Labore,“ kann vollständig unter http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm eingesehen werden.

Navigieren Sie vor dem ersten Treffen des Labors zu der folgenden Webseite, um die BSL-Richtlinien gemäß der CDC zu überprüfen, die ein interaktives Quiz umfasst:

Die meisten Bakterienkulturen, mit denen wir arbeiten werden, sind als BSL-1 klassifiziert. Listen Sie unten drei Praktiken auf, die während der Arbeit mit BSL-1-Bakterien angewendet werden sollten:

In einigen Labors werden wir mit Bakterien arbeiten, die als BSL-2 klassifiziert sind. Welche zusätzlichen Sicherheitsmaßnahmen sollten Sie anwenden, wenn Sie mit diesen Bakterien arbeiten?

Nachdem Ihr Ausbilder alle zusätzlichen Sicherheitsverfahren für Ihr Labor besprochen hat, füllen Sie die Bewertung des Biosicherheitskonzepts auf der folgenden Seite (oder einer von Ihrem Ausbilder bereitgestellten) aus und unterschreiben Sie die Bestätigung. Senden Sie das ausgefüllte Dokument an Ihren Lehrer zurück.


Die aktuelle Definition von Hygiene

Das Wort Hygiene stammt von Hygieia, der griechischen Göttin der Gesundheit, ab. Das Oxford English Dictionary (OED) definiert es als: „Jeder Fachbereich des Wissens oder der Praxis, der sich auf die Aufrechterhaltung der Gesundheit bezieht, ein System von Prinzipien oder Regeln zur Erhaltung oder Förderung der Gesundheitswissenschaft“ [1]. Die OED gibt uns auch einen Kontext zur Verwendung des Wortes im Englischen und stellt fest, dass seine Ursprünge im ersten Teil der Definition liegen (frühe Verwendung des Wortes bezieht sich ausschließlich auf die Praxis der Medizin), während sich der modernere Gebrauch tendenziell bezieht insbesondere auf die Praxis der Sauberkeit, wenn es um die Erhaltung einer guten Gesundheit geht. In der Praxis wird Hygiene jedoch selten explizit definiert. Der Begriff bezieht sich am häufigsten auf Hand Hygiene, den die Weltgesundheitsorganisation als „allgemeinen Begriff für jede Handreinigung“ definiert [2]. Hygiene kann sich auch beziehen auf Umwelthygiene, was entweder die Reinigung von Oberflächen in der Umgebung einer Person (meistens eines Patienten) bedeuten kann [3] oder allgemeiner infrastrukturelle Veränderungen, die die Umgebung in einer Weise verändern, die als gesundheitsfördernd empfunden wird (wie die Installation von Wasser und Kläranlagen) [4]. In diesem Review konzentrieren wir uns hauptsächlich auf die Händehygiene, da dieser Aspekt der Hygiene in der modernen wissenschaftlichen Literatur am häufigsten verwendet wird.

Trotz der frühzeitigen Erkenntnis der Bedeutung der Händehygiene zur Bekämpfung der Krankheitsausbreitung (Tabelle 1) [5,6,7] wurde den Einzelheiten für den größten Teil des 20. Jahrhunderts wenig Beachtung geschenkt. Obwohl die CDC die Vorschriften zur Händehygiene nach und nach verstärkte [8,9,10], insbesondere im Gesundheitswesen, wurde erst 2009 ein internationaler Standard für die Händehygiene von der Weltgesundheitsorganisation (WHO) in der umfassenden Richtlinien zur Händehygiene [2].

Die WHO definiert Händehygiene ausdrücklich als „jede Aktion der Händereinigung“ und beschreibt dann viele spezifische „Handhygienepraktiken“, die alles umfassen, von der Händewaschung mit Seife und Wasser bis hin zur chirurgischen Handantiseptik. Bemerkenswert ist, dass sich die meisten Vorschriften und Empfehlungen zur Händehygiene auf den Aspekt der Hygiene als Reinigungsvorgang konzentrieren und sich eher auf die Reduzierung der mikrobiellen Massenbelastung als auf die Reduzierung der Infektionsübertragung konzentrieren.

Aktuelle Forschung zur Händehygiene

Der Fokus auf die Massenreduktion der mikrobiellen Belastung ist in den meisten Hygienestudien offensichtlich – auch in solchen, die von klinischen Mikrobiologen durchgeführt wurden [11,12,13,14]. Die Konzepte Hygiene und Sterilisation werden oft verschmolzen, was angesichts der Geschichte der Krankenhaushygiene, die darauf abzielt, alle Mikroben aus der Umwelt zu entfernen, vielleicht nicht überraschend ist [8]. Es besteht ein logischer Zusammenhang zwischen der Massenreduktion der mikrobiellen Belastung und der Verringerung der Ausbreitung von Krankheitserregern, jedoch gehen relativ wenige Studien über die Reinigung hinaus und verknüpfen die Hygiene direkt mit den gesundheitlichen Ergebnissen, und viele davon befassen sich speziell mit nosokomialen Infektionen [12].

Die Forschung zur Händehygiene hat sich hauptsächlich auf Krankenhausumgebungen und die Ausbreitung nosokomialer Infektionen konzentriert (überprüft in [2, 12]), zum Teil aufgrund der Geschichte dieses Gebiets, aber auch aufgrund der Erkenntnis des erhöhten Infektionsrisikos an Orten, an denen potenziell ansteckend ist und immungeschwächte Menschen werden gesammelt. Wenn die Händehygiene außerhalb von Krankenhäusern durchgeführt wurde, konzentrierte sie sich auf andere Bereiche mit hohem Risiko einer Krankheitsübertragung, wie Kinderbetreuungseinrichtungen [15,16,17] oder Situationen im Umgang mit Lebensmitteln [18], oder wurde in Kombination mit Bemühungen zur Verbesserung der Umwelthygiene in der Gemeinde, wie z. B. einer verbesserten sanitären Infrastruktur in Entwicklungsländern (überprüft in [19]).

Aiello und Larson fanden unter Tausenden von Studien, die ihren Suchkriterien entsprachen, nur 53 Studien, die zwischen 1980 und 2001 veröffentlicht wurden und die Hygiene explizit mit Gesundheitsergebnissen außerhalb des Gesundheitswesens in Verbindung brachten [19]. Studien, die Hygienemaßnahmen mit der Gesundheit in Verbindung bringen, belegen die Wirksamkeit des Händewaschens bei der Verringerung des Risikos von Durchfallerkrankungen [20, 21] und Infektionen der oberen Atemwege [21, 22]. Als ein Faktor, der zu einer kürzlichen Shigella Ausbruch in Flint, Michigan [23].

Das Fehlen einer klaren und einheitlichen Definition von Hygiene hat zu Verwirrung in der wissenschaftlichen Literatur geführt. Ein Beispiel für diese Verwirrung ist in der Hygieneliteratur zu Händetrocknen. Obwohl die Händetrocknung bisher ignoriert wurde [24], ist sie ein entscheidender Aspekt der Händehygiene, da Restfeuchtigkeit bei der Übertragung von Mikroben zwischen Oberflächen eine bedeutende Rolle spielt [25,26,27,28]. Die verschiedenen Methoden der Händetrocknung haben unterschiedliche hygienische Vorteile und Bedenken. Das Trocknen mit Papierhandtüchern ist beispielsweise die Methode, die sowohl von den Centers for Disease Control and Prevention [29] als auch von der WHO [2] für medizinisches Personal empfohlen wird, hauptsächlich aufgrund von Daten zur Massenkeimzahl, die darauf hindeuten, dass Papierhandtücher beim Entfernen wirksam sind vorübergehende Oberflächenbakterien [24, 30, 31, 32, 33, 34, 35]. Nichtsdestotrotz ist es möglich, dass Altpapierhandtücher als Bakterienreservoir dienen können, das die Ausbreitung von Krankheiten begünstigen kann [36, 37]. Neuere Alternativen zu Papierhandtüchern wie Jet-Lufttrockner (z. B. der Dyson Airblade™) werden als mit einem hocheffizienten Partikelluftfilter (HEPA) ausgestattet, der in das Luftstromsystem integriert ist, vermarktet, der das Risiko einer Umverteilung von Mikroben in der Luft auf die Hände [13]. Es besteht jedoch Besorgnis über die Neigung einer so schnellen Luftbewegung, Mikroben aus den Händen der Benutzer oder der Umgebung zu vernebeln [14, 34, 37, 38, 39].

Viele der vorliegenden Arbeiten zum Händetrocknen haben die hygienische Wirksamkeit verschiedener Methoden untersucht. Was in einer bestimmten Studie unter „Hygiene“ zu verstehen ist, wird jedoch oft unausgesprochen und ist im Allgemeinen zwischen Studien aus verschiedenen Forschungsgruppen inkonsistent [40], wird jedoch normalerweise anhand der Änderung der mikrobiellen Belastung [13, 34], der Ausbreitung von Mikroben aus die Hände oder ein Stellvertreter davon [38, 39] und/oder die Wirksamkeit des Trocknens [13, 36, 37]. Die Verwendung einer Definition von Hygiene, die sich ausdrücklich auf die Verringerung der Krankheitsausbreitung stützt und die Dynamik der mikrobiellen Gemeinschaft berücksichtigt, würde es zukünftigen Experimenten ermöglichen, die möglichen hygienischen Bedenken von Bakterienreservoirs aus Papierhandtüchern oder Mikroben, die durch Trockner vernebelt werden, angemessen zu berücksichtigen.


Einführung

Wiederkäuer sind eine der erfolgreichsten Gruppen pflanzenfressender Säugetiere auf dem Planeten, mit rund 200 Arten, die von etwa 75 Millionen wildlebenden und 3,5 Milliarden domestizierten Individuen weltweit vertreten werden 1 . Wiederkäuer werden durch ihre Pflanzenverdauung definiert und haben einen Vormagen, den Pansen, entwickelt, der eine teilweise mikrobielle Verdauung des Futters ermöglicht, bevor es in den wahren Magen gelangt.Wiederkäuer selbst produzieren nicht die Enzyme, die zum Abbau der komplexesten Pflanzenpolysaccharide erforderlich sind, und der Pansen bietet eine Umgebung für ein reiches und dichtes Konsortium anaerober Mikroben, die diese metabolische Rolle erfüllen. Diese Pansenmikroben fermentieren Futter, um flüchtige Fettsäuren zu bilden, die wichtige Nährstoffquellen für das Wirtstier sind und erheblich zur Produktivität der Wiederkäuer beitragen. Der Wirt verwendet auch mikrobielle Biomasse und einige unfermentierte Futterkomponenten, sobald diese den Pansen in den Rest des Verdauungstraktes verlassen. Wiederkäuer haben verschiedene Pansenanatomien und Verhaltensweisen entwickelt, um auf einer Reihe von Pflanzenarten zu gedeihen, und diese Flexibilität hat es ihnen ermöglicht, viele verschiedene Lebensräume in einem breiten Klimaspektrum zu besetzen 2 . Dies waren auch wichtige Faktoren bei ihrer Domestikation, die die Umwandlung von für den Menschen unverdaulichem Pflanzenmaterial in leicht zugängliche tierische Produkte, insbesondere Milchprodukte, Fleisch und Nutzfasern, ermöglichten. Wiederkäuer haben daher eine wichtige Rolle bei der Erhaltung und Entwicklung vieler menschlicher Kulturen gespielt, sie wurden auch als Zugtiere eingesetzt und haben religiöse und Statuswerte.

Pansenmikroben können verschiedenen funktionellen Gruppen zugeordnet werden, wie Zellulolytika, Amylolytika, Proteolytika usw., die die unterschiedlichsten Futterbestandteile abbauen oder einen Teil der von anderen Mikroben gebildeten Produkte weiter verstoffwechseln 3 . Methanogene, die methanbildenden Archaeen, gehören beispielsweise zu denen, die von einigen fermentativen Mikroben gebildeten Wasserstoff zu Methan verstoffwechseln. Das bei dieser Fermentation erzeugte Methan trägt zu den globalen anthropogenen Treibhausgasemissionen bei 4 und bedeutet einen Verlust von 2–12% an Futterenergie für das Tier 5 . Unterschiede in den mikrobiellen Lebensgemeinschaften im Pansen beruhen auf Schwankungen bei der Methanbildung 6 und der Umwandlung von Futtermitteln in tierische Produkte 7,8 . Daher ist das Verständnis dieser Gemeinschaften der Schlüssel zum Verständnis der Umwandlung von Pflanzenmaterial im Pansen in sowohl unerwünschte als auch nützliche Wiederkäuerprodukte.

Ziel dieser Studie war es, die Zusammensetzung der Mikrobiota in Pansen- und Vordarmproben von 742 einzelnen Tieren aus der ganzen Welt zu bestimmen. Der resultierende Datensatz ermöglichte es uns, festzustellen, dass Ernährungsfaktoren bei der Bestimmung der Zusammensetzung der mikrobiellen Gemeinschaft gegenüber Wirtsarten dominieren, die dominanten Mikroben und ihre potenziellen Assoziationen zu identifizieren und den Ähnlichkeitsgrad der mikrobiellen Gemeinschaften im Pansen weltweit zu beschreiben.


Inhalt

Die Bioinformatik ist zu einem wichtigen Bestandteil vieler Bereiche der Biologie geworden. In der experimentellen Molekularbiologie ermöglichen bioinformatische Techniken wie die Bild- und Signalverarbeitung die Gewinnung nützlicher Ergebnisse aus großen Mengen an Rohdaten. Auf dem Gebiet der Genetik hilft es bei der Sequenzierung und Annotation von Genomen und deren beobachteten Mutationen. Es spielt eine Rolle beim Text-Mining biologischer Literatur und der Entwicklung biologischer und genetischer Ontologien, um biologische Daten zu organisieren und abzufragen. Es spielt auch eine Rolle bei der Analyse der Gen- und Proteinexpression und -regulation. Bioinformatik-Tools helfen beim Vergleichen, Analysieren und Interpretieren von genetischen und genomischen Daten und allgemein beim Verständnis evolutionärer Aspekte der Molekularbiologie. Auf einer integrativeren Ebene hilft es, die biologischen Pfade und Netzwerke zu analysieren und zu katalogisieren, die ein wichtiger Bestandteil der Systembiologie sind. In der Strukturbiologie hilft es bei der Simulation und Modellierung von DNA, [2] RNA, [2] [3] Proteinen [4] sowie biomolekularen Wechselwirkungen. [5] [6] [7] [8]

Verlauf Bearbeiten

Historisch gesehen ist der Begriff Bioinformatik bedeutete nicht, was es heute bedeutet. Paulien Hogeweg und Ben Hesper prägten es 1970, um sich auf die Untersuchung von Informationsprozessen in biotischen Systemen zu beziehen. [9] [10] [11] Diese Definition stellt die Bioinformatik als ein paralleles Feld zur Biochemie (dem Studium chemischer Prozesse in biologischen Systemen) dar. [9]

Sequenzen bearbeiten

Computer wurden in der Molekularbiologie unverzichtbar, als Proteinsequenzen verfügbar wurden, nachdem Frederick Sanger Anfang der 1950er Jahre die Sequenz von Insulin bestimmt hatte. Der manuelle Vergleich mehrerer Sequenzen erwies sich als unpraktisch. Eine Pionierin auf diesem Gebiet war Margaret Oakley Dayhoff. [12] Sie erstellte eine der ersten Datenbanken für Proteinsequenzen, die ursprünglich als Bücher veröffentlicht wurde [13] und leistete Pionierarbeit bei Methoden des Sequenz-Alignments und der molekularen Evolution. [14] Ein weiterer früher Beitrag zur Bioinformatik war Elvin A. Kabat, der 1970 mit seinen umfassenden Bänden von Antikörpersequenzen, die zwischen 1980 und 1991 mit Tai Te Wu veröffentlicht wurden, Pionierarbeit bei der biologischen Sequenzanalyse leistete. [15] In den 1970er Jahren wurden neue Techniken zur Sequenzierung von DNA . entwickelt wurden auf die Bakteriophagen MS2 und øX174 angewendet, und die verlängerten Nukleotidsequenzen wurden dann mit informativen und statistischen Algorithmen analysiert. Diese Studien zeigten, dass bekannte Merkmale wie die Kodierungssegmente und der Triplett-Code in einfachen statistischen Analysen aufgedeckt werden und waren somit ein Beweis für das Konzept, dass Bioinformatik aufschlussreich sein würde. [16] [17]

Ziele Bearbeiten

Um zu untersuchen, wie normale zelluläre Aktivitäten in verschiedenen Krankheitszuständen verändert werden, müssen die biologischen Daten kombiniert werden, um ein umfassendes Bild dieser Aktivitäten zu erhalten. Daher hat sich das Gebiet der Bioinformatik so entwickelt, dass die vordringlichste Aufgabe nun die Analyse und Interpretation verschiedener Datentypen ist. Dazu gehören auch Nukleotid- und Aminosäuresequenzen, Proteindomänen und Proteinstrukturen. [18] Der eigentliche Prozess der Datenanalyse und -interpretation wird als Computational Biology bezeichnet. Wichtige Teildisziplinen der Bioinformatik und der Computerbiologie sind:

  • Entwicklung und Implementierung von Computerprogrammen, die einen effizienten Zugang zu, Verwaltung und Nutzung von verschiedenen Arten von Informationen ermöglichen.
  • Entwicklung neuer Algorithmen (mathematische Formeln) und statistischer Maße, die Beziehungen zwischen Mitgliedern großer Datensätze bewerten. Zum Beispiel gibt es Verfahren zum Lokalisieren eines Gens innerhalb einer Sequenz, zum Vorhersagen von Proteinstruktur und/oder -funktion und zum Clustern von Proteinsequenzen in Familien verwandter Sequenzen.

Das primäre Ziel der Bioinformatik ist es, das Verständnis biologischer Prozesse zu verbessern. Was ihn jedoch von anderen Ansätzen unterscheidet, ist sein Fokus auf die Entwicklung und Anwendung rechenintensiver Techniken, um dieses Ziel zu erreichen. Beispiele sind: Mustererkennung, Data Mining, maschinelle Lernalgorithmen und Visualisierung. Zu den wichtigsten Forschungsanstrengungen auf diesem Gebiet gehören Sequenz-Alignment, Genfindung, Genom-Assemblierung, Wirkstoffdesign, Wirkstoffforschung, Proteinstruktur-Alignment, Proteinstruktur-Vorhersage, Vorhersage der Genexpression und Protein-Protein-Interaktionen, genomweite Assoziationsstudien, Modellierung der Evolution und Zellteilung/Mitose.

Bioinformatik umfasst heute die Erstellung und Weiterentwicklung von Datenbanken, Algorithmen, Berechnungs- und Statistiktechniken sowie Theorien zur Lösung formaler und praktischer Probleme, die sich aus der Verwaltung und Analyse biologischer Daten ergeben.

In den letzten Jahrzehnten haben die rasanten Entwicklungen bei Genom- und anderen molekularen Forschungstechnologien und Entwicklungen bei den Informationstechnologien eine enorme Menge an Informationen in Bezug auf die Molekularbiologie hervorgebracht. Bioinformatik ist die Bezeichnung für diese mathematischen und computergestützten Ansätze, die zum Verständnis biologischer Prozesse verwendet werden.

Zu den üblichen Aktivitäten in der Bioinformatik gehören das Kartieren und Analysieren von DNA- und Proteinsequenzen, das Abgleichen von DNA- und Proteinsequenzen, um sie zu vergleichen, sowie das Erstellen und Betrachten von 3D-Modellen von Proteinstrukturen.

Beziehung zu anderen Feldern Bearbeiten

Bioinformatik ist ein Wissenschaftsgebiet, das dem biologischen Rechnen ähnlich ist, sich jedoch von diesem unterscheidet, während es oft als Synonym für Computerbiologie angesehen wird. Biologisches Rechnen verwendet Bioengineering und Biologie, um biologische Computer zu bauen, während Bioinformatik Computer verwendet, um die Biologie besser zu verstehen. Bioinformatik und Computerbiologie umfassen die Analyse biologischer Daten, insbesondere DNA-, RNA- und Proteinsequenzen. Der Bereich der Bioinformatik erlebte ab Mitte der 1990er Jahre ein explosionsartiges Wachstum, das vor allem durch das Human Genome Project und schnelle Fortschritte in der DNA-Sequenzierungstechnologie angetrieben wurde.

Die Analyse biologischer Daten zur Gewinnung aussagekräftiger Informationen umfasst das Schreiben und Ausführen von Softwareprogrammen, die Algorithmen aus der Graphentheorie, künstlichen Intelligenz, Soft Computing, Data Mining, Bildverarbeitung und Computersimulation verwenden. Die Algorithmen wiederum hängen von theoretischen Grundlagen wie diskreter Mathematik, Regelungstheorie, Systemtheorie, Informationstheorie und Statistik ab.

Seit der Phage Φ-X174 im Jahr 1977 sequenziert wurde [19] wurden die DNA-Sequenzen von Tausenden von Organismen entschlüsselt und in Datenbanken gespeichert. Diese Sequenzinformationen werden analysiert, um Gene zu bestimmen, die Proteine, RNA-Gene, regulatorische Sequenzen, strukturelle Motive und repetitive Sequenzen kodieren. Ein Vergleich von Genen innerhalb einer Art oder zwischen verschiedenen Arten kann Ähnlichkeiten zwischen Proteinfunktionen oder Beziehungen zwischen Arten aufzeigen (die Verwendung molekularer Systematik zur Konstruktion phylogenetischer Bäume). Mit der wachsenden Datenmenge wurde es längst unpraktisch, DNA-Sequenzen manuell zu analysieren. Computerprogramme wie BLAST werden routinemäßig verwendet, um nach Sequenzen zu suchen – ab 2008 von mehr als 260.000 Organismen, die über 190 Milliarden Nukleotide enthalten. [20]

DNA-Sequenzierung Bearbeiten

Bevor Sequenzen analysiert werden können, müssen sie aus der Datenbank zB der Genbank entnommen werden. Die DNA-Sequenzierung ist immer noch ein nicht triviales Problem, da die Rohdaten verrauscht oder durch schwache Signale beeinträchtigt sein können. Für die verschiedenen experimentellen Ansätze zur DNA-Sequenzierung wurden Algorithmen für Base-Calling entwickelt.

Sequenzmontage Bearbeiten

Die meisten DNA-Sequenzierungstechniken produzieren kurze Sequenzfragmente, die zusammengesetzt werden müssen, um vollständige Gen- oder Genomsequenzen zu erhalten. Die sogenannte Shotgun-Sequenzierungstechnik (die beispielsweise vom Institut für Genomforschung (TIGR) zur Sequenzierung des ersten Bakteriengenoms verwendet wurde, Haemophilus influenzae) [21] generiert die Sequenzen von vielen Tausend kleinen DNA-Fragmenten (je nach Sequenzierungstechnologie zwischen 35 und 900 Nukleotiden lang). Die Enden dieser Fragmente überlappen und können bei richtiger Ausrichtung durch ein Genom-Assembly-Programm verwendet werden, um das komplette Genom zu rekonstruieren. Die Shotgun-Sequenzierung liefert schnell Sequenzdaten, aber die Aufgabe, die Fragmente zusammenzusetzen, kann bei größeren Genomen ziemlich kompliziert sein. Bei einem Genom, das so groß ist wie das menschliche Genom, kann es auf Computern mit großem Speicher und mehreren Prozessoren viele Tage CPU-Zeit dauern, um die Fragmente zusammenzusetzen, und die resultierende Anordnung enthält normalerweise zahlreiche Lücken, die später ausgefüllt werden müssen. Die Shotgun-Sequenzierung ist die Methode der Wahl für praktisch alle heute sequenzierten Genome [ wenn? ] und Genom-Assembly-Algorithmen sind ein kritischer Bereich der Bioinformatik-Forschung.

Genom-Annotation Bearbeiten

Im Kontext der Genomik ist Annotation der Prozess der Markierung der Gene und anderer biologischer Merkmale in einer DNA-Sequenz. Dieser Prozess muss automatisiert werden, da die meisten Genome zu groß sind, um sie von Hand zu annotieren, ganz zu schweigen von dem Wunsch, so viele Genome wie möglich zu annotieren, da die Sequenzierungsrate keinen Flaschenhals mehr darstellt. Die Annotation wird durch die Tatsache ermöglicht, dass Gene erkennbare Start- und Stoppregionen haben, obwohl die genaue Sequenz in diesen Regionen zwischen den Genen variieren kann.

Die erste Beschreibung eines umfassenden Genom-Annotationssystems wurde 1995 [21] von dem Team des Instituts für Genomforschung veröffentlicht, das die erste vollständige Sequenzierung und Analyse des Genoms eines frei lebenden Organismus, des Bakteriums, durchführte Haemophilus influenzae. [21] Owen White entwarf und baute ein Softwaresystem, um die Gene, die alle Proteine, Transfer-RNAs, ribosomale RNAs (und andere Stellen) kodieren, zu identifizieren und erste funktionelle Zuordnungen vorzunehmen. Die meisten aktuellen Genom-Annotationssysteme funktionieren ähnlich, aber die für die Analyse genomischer DNA verfügbaren Programme, wie das GeneMark-Programm, das trainiert und verwendet wird, um proteinkodierende Gene in Haemophilus influenzae, verändern und verbessern sich ständig.

Den Zielen folgend, die das Human Genome Project nach seiner Schließung im Jahr 2003 noch erreichen wollte, erschien ein neues Projekt, das vom National Human Genome Research Institute in den USA entwickelt wurde. Das sogenannte ENCODE-Projekt ist eine kollaborative Datensammlung der funktionellen Elemente des menschlichen Genoms, die DNA-Sequenzierungstechnologien der nächsten Generation und genomische Tiling-Arrays verwendet, Technologien, die in der Lage sind, automatisch große Datenmengen zu drastisch reduzierten Grundkosten zu generieren aber mit der gleichen Genauigkeit (Base-Call-Fehler) und Genauigkeit (Assembly-Fehler).

Computergestützte Evolutionsbiologie Bearbeiten

Evolutionsbiologie ist das Studium der Entstehung und Abstammung von Arten sowie ihrer Veränderung im Laufe der Zeit. Die Informatik hat Evolutionsbiologen unterstützt, indem sie Forschern ermöglicht hat:

  • die Evolution einer großen Zahl von Organismen zu verfolgen, indem man Veränderungen in ihrer DNA misst, anstatt allein durch physikalische Taxonomie oder physiologische Beobachtungen,
  • ganze Genome vergleichen, was die Untersuchung komplexer evolutionärer Ereignisse wie Genduplikation, horizontaler Gentransfer und die Vorhersage von Faktoren ermöglicht, die bei der bakteriellen Speziation wichtig sind,
  • komplexe computergestützte Populationsgenetikmodelle erstellen, um das Ergebnis des Systems im Laufe der Zeit vorherzusagen [22]
  • Verfolgen und teilen Sie Informationen über eine immer größere Anzahl von Arten und Organismen

Zukünftige Arbeiten versuchen, den nun komplexeren Lebensbaum zu rekonstruieren. [ nach wem? ]

Der Forschungsbereich der Informatik, der genetische Algorithmen verwendet, wird manchmal mit der computergestützten Evolutionsbiologie verwechselt, aber die beiden Bereiche sind nicht unbedingt verwandt.

Vergleichende Genomik Bearbeiten

Kernstück der vergleichenden Genomanalyse ist die Feststellung der Übereinstimmung zwischen Genen (Orthologieanalyse) oder anderen genomischen Merkmalen in verschiedenen Organismen. Es sind diese intergenomischen Karten, die es ermöglichen, die evolutionären Prozesse zu verfolgen, die für die Divergenz zweier Genome verantwortlich sind. Eine Vielzahl von evolutionären Ereignissen, die auf verschiedenen Organisationsebenen wirken, prägen die Genom-Evolution. Auf der untersten Ebene betreffen Punktmutationen einzelne Nukleotide. Auf einer höheren Ebene werden große chromosomale Segmente dupliziert, lateral transferiert, invertiert, transponiert, deletiert und eingefügt. [23] Letztlich sind ganze Genome an Prozessen der Hybridisierung, Polyploidisierung und Endosymbiose beteiligt, was oft zu einer schnellen Artbildung führt. Die Komplexität der Genom-Evolution stellt Entwickler mathematischer Modelle und Algorithmen vor viele spannende Herausforderungen, die auf ein Spektrum algorithmischer, statistischer und mathematischer Techniken zurückgreifen, das von exakten Heuristiken, Festparameter- und Approximationsalgorithmen für Probleme basierend auf Sparsamkeitsmodellen bis hin zu Markov . reicht Chain-Monte-Carlo-Algorithmen für die Bayessche Analyse von Problemen basierend auf probabilistischen Modellen.

Viele dieser Studien basieren auf dem Nachweis von Sequenzhomologien, um Sequenzen Proteinfamilien zuzuordnen. [24]

Pan Genomics Bearbeiten

Pan Genomics ist ein Konzept, das 2005 von Tettelin und Medini eingeführt wurde und schließlich in der Bioinformatik Fuß fasste. Das Pangenom ist das vollständige Genrepertoire einer bestimmten taxonomischen Gruppe: Obwohl es ursprünglich auf eng verwandte Stämme einer Art angewendet wurde, kann es auf einen größeren Kontext wie Gattung, Stamm usw. angewendet werden. Es ist in zwei Teile unterteilt - Das Kerngenom: Set von Genen, die allen untersuchten Genomen gemeinsam sind (dies sind oft überlebenswichtige Haushaltsgene) und Das entbehrliche/flexible Genom: Satz von Genen, die nicht in allen untersuchten Genomen vorhanden sind, außer in einem oder einigen untersuchten Genomen. Ein Bioinformatik-Tool BPGA kann verwendet werden, um das Pan-Genom von Bakterienarten zu charakterisieren. [25]

Genetik der Krankheit Bearbeiten

Mit dem Aufkommen der Next-Generation-Sequenzierung erhalten wir genügend Sequenzdaten, um die Gene komplexer Krankheiten wie Unfruchtbarkeit, [26] Brustkrebs [27] oder Alzheimer-Krankheit zu kartieren. [28] Genomweite Assoziationsstudien sind ein nützlicher Ansatz, um die Mutationen zu lokalisieren, die für solche komplexen Krankheiten verantwortlich sind. [29] Durch diese Studien wurden Tausende von DNA-Varianten identifiziert, die mit ähnlichen Krankheiten und Merkmalen in Verbindung gebracht werden. [30] Darüber hinaus ist die Möglichkeit, Gene bei der Prognose, Diagnose oder Behandlung zu verwenden, eine der wichtigsten Anwendungen. In vielen Studien werden sowohl die vielversprechenden Möglichkeiten zur Auswahl der zu verwendenden Gene als auch die Probleme und Fallstricke bei der Verwendung von Genen zur Vorhersage des Auftretens oder der Prognose von Krankheiten diskutiert. [31]

Analyse von Mutationen bei Krebs Bearbeiten

Bei Krebs werden die Genome betroffener Zellen auf komplexe oder sogar unvorhersehbare Weise neu angeordnet. Massive Sequenzierungsanstrengungen werden verwendet, um bisher unbekannte Punktmutationen in einer Vielzahl von Genen bei Krebs zu identifizieren. Bioinformatiker produzieren weiterhin spezialisierte automatisierte Systeme, um die schiere Menge an produzierten Sequenzdaten zu verwalten, und sie entwickeln neue Algorithmen und Software, um die Sequenzierungsergebnisse mit der wachsenden Sammlung menschlicher Genomsequenzen und Keimbahnpolymorphismen zu vergleichen. Neue physikalische Nachweistechnologien werden eingesetzt, wie Oligonukleotid-Mikroarrays zur Identifizierung von Chromosomengewinnen und -verlusten (sogenannte vergleichende genomische Hybridisierung) und Einzelnukleotid-Polymorphismus-Arrays zum Nachweis bekannter Punktmutationen. Diese Nachweismethoden messen gleichzeitig mehrere Hunderttausend Stellen im gesamten Genom und generieren bei Hochdurchsatzmessungen Tausende von Proben Terabyte an Daten pro Experiment. Auch hier eröffnen die riesigen Mengen und neue Arten von Daten neue Möglichkeiten für Bioinformatiker. Es wird oft festgestellt, dass die Daten eine beträchtliche Variabilität oder Rauschen enthalten, und daher werden Hidden-Markov-Modell- und Änderungspunktanalyseverfahren entwickelt, um reale Kopienzahländerungen abzuleiten.

Zwei wichtige Prinzipien können bei der bioinformatischen Analyse von Krebsgenomen verwendet werden, die die Identifizierung von Mutationen im Exom betreffen. Erstens ist Krebs eine Krankheit mit angehäuften somatischen Mutationen in Genen. Zweiter Krebs enthält Mutationen des Fahrers, die von Passagieren unterschieden werden müssen. [32]

Mit den Durchbrüchen, die diese Sequenzierungstechnologie der nächsten Generation auf dem Gebiet der Bioinformatik bietet, könnte sich die Krebsgenomik drastisch verändern. Diese neuen Methoden und Software ermöglichen es Bioinformatikern, viele Krebsgenome schnell und kostengünstig zu sequenzieren. Dies könnte einen flexibleren Prozess zur Klassifizierung von Krebsarten durch die Analyse von krebsbedingten Mutationen im Genom schaffen. Darüber hinaus könnte in Zukunft mit der Sequenz von Krebsproben eine Verfolgung von Patienten während des Krankheitsverlaufs möglich sein. [33]

Eine andere Art von Daten, die eine neuartige Informatikentwicklung erfordert, ist die Analyse von Läsionen, die bei vielen Tumoren wiederkehrend gefunden wurden.

Analyse der Genexpression Bearbeiten

Die Expression vieler Gene kann durch Messung der mRNA-Spiegel mit mehreren Techniken bestimmt werden, darunter Mikroarrays, Sequenzierung exprimierter cDNA-Sequenz-Tags (EST), serielle Analyse der Genexpressions-(SAGE)-Tag-Sequenzierung, massiv parallele Signatursequenzierung (MPSS), RNA-Seq, auch bekannt als "Whole Transcriptome Shotgun Sequencing" (WTSS) oder verschiedene Anwendungen der gemultiplexten in-situ-Hybridisierung. Alle diese Techniken sind extrem rauschanfällig und/oder unterliegen einem Bias bei der biologischen Messung, und ein wichtiger Forschungsbereich in der Computerbiologie umfasst die Entwicklung statistischer Werkzeuge zur Trennung von Signalen und Rauschen in Hochdurchsatz-Genexpressionsstudien. [34] Solche Studien werden häufig verwendet, um die Gene zu bestimmen, die an einer Erkrankung beteiligt sind: Man könnte Mikroarray-Daten von Krebsepithelzellen mit Daten von nicht-krebsartigen Zellen vergleichen, um die Transkripte zu bestimmen, die in einer bestimmten Population hoch- und herunterreguliert werden von Krebszellen.

Analyse der Proteinexpression Bearbeiten

Protein-Mikroarrays und Hochdurchsatz(HT)-Massenspektrometrie (MS) können eine Momentaufnahme der in einer biologischen Probe vorhandenen Proteine ​​liefern. Die Bioinformatik ist sehr daran beteiligt, Protein-Mikroarray- und HT-MS-Daten zu verstehen, wobei der erstere Ansatz mit ähnlichen Problemen konfrontiert ist wie bei auf mRNA ausgerichteten Mikroarrays, der letztere das Problem des Abgleichs großer Mengen von Massendaten mit vorhergesagten Massen aus Proteinsequenzdatenbanken mit sich bringt, und die komplizierte statistische Analyse von Proben, bei der mehrere, aber unvollständige Peptide von jedem Protein nachgewiesen werden. Die Lokalisierung von zellulären Proteinen in einem Gewebekontext kann durch Affinitätsproteomik erreicht werden, die als räumliche Daten basierend auf Immunhistochemie und Gewebemikroarrays angezeigt wird. [35]

Analyse der Regulierung Bearbeiten

Genregulation ist die komplexe Orchestrierung von Ereignissen, durch die ein Signal, möglicherweise ein extrazelluläres Signal wie ein Hormon, schließlich zu einer Zunahme oder Abnahme der Aktivität eines oder mehrerer Proteine ​​führt. Bioinformatische Techniken wurden angewendet, um verschiedene Schritte in diesem Prozess zu untersuchen.

Beispielsweise kann die Genexpression durch benachbarte Elemente im Genom reguliert werden. Die Promotoranalyse beinhaltet die Identifizierung und Untersuchung von Sequenzmotiven in der DNA, die die kodierende Region eines Gens umgibt. Diese Motive beeinflussen das Ausmaß, in dem diese Region in mRNA transkribiert wird. Enhancer-Elemente, die weit vom Promotor entfernt sind, können auch die Genexpression durch dreidimensionale Schleifeninteraktionen regulieren. Diese Wechselwirkungen können durch bioinformatische Analyse von Chromosomen-Konformations-Erfassungsexperimenten bestimmt werden.

Expressionsdaten können verwendet werden, um eine Genregulation abzuleiten: Man könnte Microarray-Daten aus einer Vielzahl von Zuständen eines Organismus vergleichen, um Hypothesen über die an jedem Zustand beteiligten Gene zu bilden. In einem einzelligen Organismus könnte man die Stadien des Zellzyklus zusammen mit verschiedenen Stresszuständen (Hitzeschock, Hunger usw.) vergleichen. Man kann dann Clustering-Algorithmen auf diese Expressionsdaten anwenden, um zu bestimmen, welche Gene co-exprimiert werden. Beispielsweise können die Upstream-Regionen (Promotoren) von co-exprimierten Genen nach überrepräsentierten regulatorischen Elementen durchsucht werden. Beispiele für Clustering-Algorithmen, die beim Gen-Clustering angewendet werden, sind k-Means-Clustering, Self-Organizing Maps (SOMs), hierarchisches Clustering und Konsensus-Clustering-Methoden.

Es wurden mehrere Ansätze entwickelt, um die Position von Organellen, Genen, Proteinen und anderen Komponenten innerhalb von Zellen zu analysieren. Dies ist relevant, da die Lage dieser Komponenten die Ereignisse innerhalb einer Zelle beeinflusst und uns so hilft, das Verhalten biologischer Systeme vorherzusagen. Eine Kategorie der Genontologie, zelluläre Komponente, wurde entwickelt, um die subzelluläre Lokalisation in vielen biologischen Datenbanken zu erfassen.

Mikroskopie und Bildanalyse Bearbeiten

Mikroskopische Bilder ermöglichen es uns, sowohl Organellen als auch Moleküle zu lokalisieren. Es kann uns auch helfen, zwischen normalen und abnormalen Zellen zu unterscheiden, z.B. bei Krebs.

Proteinlokalisierung Bearbeiten

Die Lokalisierung von Proteinen hilft uns, die Rolle eines Proteins zu beurteilen. Wenn beispielsweise ein Protein im Zellkern gefunden wird, kann es an der Genregulation oder am Spleißen beteiligt sein. Wenn dagegen ein Protein in Mitochondrien gefunden wird, kann es an der Atmung oder anderen Stoffwechselprozessen beteiligt sein. Die Proteinlokalisierung ist daher ein wichtiger Bestandteil der Vorhersage der Proteinfunktion. Es stehen gut entwickelte Ressourcen für die Vorhersage der subzellulären Proteinlokalisation zur Verfügung, einschließlich Datenbanken für die subzelluläre Position von Proteinen und Vorhersagewerkzeugen. [36] [37]

Kernorganisation von Chromatin Bearbeiten

Daten aus Hochdurchsatz-Chromosom-Konformations-Capture-Experimenten wie Hi-C (Experiment) und ChIA-PET können Informationen über die räumliche Nähe von DNA-Loci liefern. Die Analyse dieser Experimente kann die dreidimensionale Struktur und die Kernorganisation des Chromatins bestimmen. Bioinformatische Herausforderungen in diesem Bereich umfassen die Aufteilung des Genoms in Domänen, wie z. B. topologisch assoziierende Domänen (TADs), die im dreidimensionalen Raum zusammen organisiert sind. [38]

Die Vorhersage der Proteinstruktur ist eine weitere wichtige Anwendung der Bioinformatik. Die Aminosäuresequenz eines Proteins, die sogenannte Primärstruktur, lässt sich leicht aus der Sequenz des dafür kodierenden Gens bestimmen. In den allermeisten Fällen bestimmt diese Primärstruktur eindeutig eine Struktur in ihrer natürlichen Umgebung. (Natürlich gibt es Ausnahmen, wie das Prion der bovinen spongiformen Enzephalopathie (Rinderwahnsinn).) Die Kenntnis dieser Struktur ist für das Verständnis der Funktion des Proteins von entscheidender Bedeutung. Strukturelle Informationen werden normalerweise als eine der folgenden klassifiziert: sekundär, Tertiär- und Quartär Struktur. Eine brauchbare allgemeine Lösung für solche Vorhersagen bleibt ein offenes Problem. Die meisten Bemühungen wurden bisher auf Heuristiken gerichtet, die die meiste Zeit funktionieren. [ Zitat benötigt ]

Eine der Schlüsselideen der Bioinformatik ist der Begriff der Homologie. Im genomischen Zweig der Bioinformatik wird Homologie verwendet, um die Funktion eines Gens vorherzusagen: wenn die Sequenz von Genen EIN, dessen Funktion bekannt ist, ist homolog zur Sequenz von Gen B, dessen Funktion unbekannt ist, könnte man folgern, dass B die Funktion von A teilen kann. Im Strukturzweig der Bioinformatik wird Homologie verwendet, um zu bestimmen, welche Teile eines Proteins für die Strukturbildung und Interaktion mit anderen Proteinen wichtig sind. Bei einer als Homologiemodellierung bezeichneten Technik werden diese Informationen verwendet, um die Struktur eines Proteins vorherzusagen, sobald die Struktur eines homologen Proteins bekannt ist. Dies ist derzeit die einzige Möglichkeit, Proteinstrukturen zuverlässig vorherzusagen.

Ein Beispiel dafür ist das Hämoglobin beim Menschen und das Hämoglobin in Hülsenfrüchten (Leghämoglobin), die entfernte Verwandte derselben Protein-Superfamilie sind. Beide dienen dem gleichen Zweck des Sauerstofftransports im Organismus. Obwohl diese beiden Proteine ​​völlig unterschiedliche Aminosäuresequenzen aufweisen, sind ihre Proteinstrukturen praktisch identisch, was ihre nahezu identischen Zwecke und gemeinsamen Vorfahren widerspiegelt. [39]

Andere Techniken zur Vorhersage der Proteinstruktur umfassen Protein-Threading und de novo (von Grund auf) physikbasierte Modellierung.

Ein weiterer Aspekt der strukturellen Bioinformatik umfasst die Verwendung von Proteinstrukturen für virtuelle Screening-Modelle wie Quantitative Structure-Activity-Relationship-Modelle und proteochemometrische Modelle (PCM). Darüber hinaus kann die Kristallstruktur eines Proteins zur Simulation von beispielsweise Ligandenbindungsstudien verwendet werden und in silico Mutagenesestudien.

Netzwerkanalyse versucht, die Beziehungen innerhalb biologischer Netzwerke wie Stoffwechselnetzwerke oder Protein-Protein-Interaktionsnetzwerke zu verstehen. Obwohl biologische Netzwerke aus einem einzigen Typ von Molekül oder Einheit (wie Genen) aufgebaut werden können, versucht die Netzwerkbiologie oft, viele verschiedene Datentypen wie Proteine, kleine Moleküle, Genexpressionsdaten und andere zu integrieren, die alle physisch miteinander verbunden sind , funktional oder beides.

Systembiologie beinhaltet die Verwendung von Computersimulationen von zellulären Subsystemen (wie den Netzwerken von Metaboliten und Enzymen, die den Stoffwechsel umfassen, Signalübertragungswege und Genregulationsnetzwerke), um die komplexen Zusammenhänge dieser zellulären Prozesse zu analysieren und zu visualisieren. Künstliches Leben oder virtuelle Evolution versucht, evolutionäre Prozesse über die Computersimulation einfacher (künstlicher) Lebensformen zu verstehen.

Molekulare Interaktionsnetzwerke Bearbeiten

Zehntausende dreidimensionaler Proteinstrukturen wurden durch Röntgenkristallographie und Protein-Kernresonanzspektroskopie (Protein-NMR) bestimmt, und eine zentrale Frage der strukturellen Bioinformatik ist, ob es sinnvoll ist, mögliche Protein-Protein-Wechselwirkungen nur auf dieser Grundlage vorherzusagen 3D-Formen, ohne Experimente zur Protein-Protein-Interaktion durchzuführen. Es wurden verschiedene Methoden entwickelt, um das Protein-Protein-Docking-Problem anzugehen, obwohl es auf diesem Gebiet noch viel zu tun scheint.

Andere Wechselwirkungen, denen man auf diesem Gebiet begegnet, sind Protein-Ligand (einschließlich Wirkstoff) und Protein-Peptid. Die molekulardynamische Simulation der Bewegung von Atomen um drehbare Bindungen ist das grundlegende Prinzip von Computeralgorithmen, die als Docking-Algorithmen bezeichnet werden, um molekulare Wechselwirkungen zu untersuchen.

Literaturanalyse Bearbeiten

Die wachsende Zahl veröffentlichter Literatur macht es praktisch unmöglich, jede Arbeit zu lesen, was zu unzusammenhängenden Teilbereichen der Forschung führt. Die Literaturanalyse zielt darauf ab, computergestützte und statistische Linguistik zu verwenden, um diese wachsende Bibliothek von Textressourcen zu durchsuchen. Zum Beispiel:

  • Abkürzungserkennung – erkennen Sie die Langform und Abkürzung von biologischen Begriffen
  • Named Entity Recognition – Erkennen von biologischen Begriffen wie Gennamen
  • Protein-Protein-Interaktion – identifizieren, welche Proteine ​​mit welchen Proteinen aus Text interagieren

Der Forschungsbereich stützt sich auf Statistik und Computerlinguistik.

Hochdurchsatz-Bildanalyse Bearbeiten

Computertechnologien werden verwendet, um die Verarbeitung, Quantifizierung und Analyse großer Mengen biomedizinischer Bilder mit hohem Informationsgehalt zu beschleunigen oder vollständig zu automatisieren. Moderne Bildanalysesysteme verbessern die Fähigkeit eines Beobachters, Messungen an einem großen oder komplexen Satz von Bildern vorzunehmen, indem sie die Genauigkeit, Objektivität oder Geschwindigkeit verbessern. Ein ausgereiftes Analysesystem kann den Beobachter vollständig ersetzen. Obwohl diese Systeme nicht nur in der biomedizinischen Bildgebung vorkommen, wird die biomedizinische Bildgebung sowohl für die Diagnostik als auch für die Forschung immer wichtiger. Einige Beispiele sind:

  • High-Throughput- und High-Fidelity-Quantifizierung und subzelluläre Lokalisierung (High-Content-Screening, Zytohistopathologie, Bioimage-Informatik)
  • klinische Bildanalyse und Visualisierung
  • Bestimmung der Echtzeit-Luftströmungsmuster in der Atemlunge lebender Tiere
  • Quantifizierung der Okklusionsgröße in Echtzeitbildern aus der Entwicklung und Erholung während einer arteriellen Verletzung
  • Verhaltensbeobachtungen aus ausgedehnten Videoaufnahmen von Versuchstieren machen
  • Infrarotmessungen zur Bestimmung der Stoffwechselaktivität
  • daraus abgeleitete Klonüberlappungen bei der DNA-Kartierung, z.B. der Sulston-Score

Einzelzelldatenanalyse mit hohem Durchsatz Bearbeiten

Computertechniken werden verwendet, um Einzelzelldaten mit hohem Durchsatz und geringer Messung zu analysieren, wie sie beispielsweise aus der Durchflusszytometrie gewonnen werden. Diese Verfahren beinhalten typischerweise das Auffinden von Zellpopulationen, die für einen bestimmten Krankheitszustand oder experimentellen Zustand relevant sind.

Biodiversitätsinformatik Bearbeiten

Die Biodiversitätsinformatik beschäftigt sich mit der Sammlung und Analyse von Biodiversitätsdaten, wie zum Beispiel taxonomischen Datenbanken oder Mikrobiomdaten. Beispiele für solche Analysen sind Phylogenetik, Nischenmodellierung, Kartierung des Artenreichtums, DNA-Barcoding oder Tools zur Artenidentifizierung.

Ontologien und Datenintegration Bearbeiten

Biologische Ontologien sind gerichtete azyklische Graphen kontrollierter Vokabulare. Sie sollen biologische Konzepte und Beschreibungen so erfassen, dass sie leicht kategorisiert und mit Computern analysiert werden können. Bei dieser Kategorisierung ist es möglich, einen Mehrwert aus einer ganzheitlichen und integrierten Analyse zu ziehen.

Die OBO Foundry war ein Bemühen, bestimmte Ontologien zu standardisieren. Eine der am weitesten verbreiteten ist die Geneontologie, die die Genfunktion beschreibt. Es gibt auch Ontologien, die Phänotypen beschreiben.

Datenbanken sind für bioinformatische Forschung und Anwendungen unverzichtbar. Es gibt viele Datenbanken, die verschiedene Arten von Informationen abdecken: zum Beispiel DNA- und Proteinsequenzen, molekulare Strukturen, Phänotypen und Biodiversität. Datenbanken können empirische Daten (direkt aus Experimenten gewonnen), vorhergesagte Daten (aus Analysen gewonnen) oder am häufigsten beides enthalten. Sie können für einen bestimmten Organismus, Stoffwechselweg oder Molekül von Interesse spezifisch sein. Alternativ können sie Daten einbeziehen, die aus mehreren anderen Datenbanken zusammengestellt wurden. Diese Datenbanken unterscheiden sich in ihrem Format, Zugriffsmechanismus und ob sie öffentlich sind oder nicht.

Einige der am häufigsten verwendeten Datenbanken sind unten aufgeführt. Eine umfassendere Liste finden Sie unter dem Link am Anfang des Unterabschnitts.

  • Verwendet in der biologischen Sequenzanalyse: Genbank, UniProt
  • Verwendet in der Strukturanalyse: Protein Data Bank (PDB)
  • Wird bei der Suche nach Proteinfamilien und der Motivfindung verwendet: InterPro, Pfam
  • Wird für die Sequenzierung der nächsten Generation verwendet: Sequence Read Archive
  • Verwendet in der Netzwerkanalyse: Metabolic Pathway Databases (KEGG, BioCyc), Interaktionsanalysedatenbanken, Functional Networks
  • Wird beim Design synthetischer genetischer Schaltkreise verwendet: GenoCAD

Softwaretools für die Bioinformatik reichen von einfachen Befehlszeilentools bis hin zu komplexeren grafischen Programmen und eigenständigen Webdiensten, die von verschiedenen Bioinformatikunternehmen oder öffentlichen Einrichtungen erhältlich sind.

Open-Source-Bioinformatik-Software Bearbeiten

Viele kostenlose und Open-Source-Softwaretools gibt es und sind seit den 1980er Jahren weiter gewachsen. [40] Die Kombination aus einem anhaltenden Bedarf an neuen Algorithmen zur Analyse neuer Arten biologischer Messwerte, dem Potenzial für innovative in silico Experimente und frei verfügbare Open-Code-Basen haben dazu beigetragen, dass alle Forschungsgruppen Gelegenheiten haben, sowohl zur Bioinformatik als auch zur Palette der verfügbaren Open-Source-Software beizutragen, unabhängig von ihren Finanzierungsvereinbarungen. Die Open-Source-Tools fungieren oft als Inkubatoren für Ideen oder von der Community unterstützte Plug-Ins in kommerziellen Anwendungen. Sie können auch bereitstellen de facto Standards und gemeinsame Objektmodelle zur Unterstützung bei der Herausforderung der Bioinformationsintegration.

Das Angebot an Open-Source-Softwarepaketen umfasst Titel wie Bioconductor, BioPerl, Biopython, BioJava, BioJS, BioRuby, Bioclipse, EMBOSS, .NET Bio, Orange mit seinem Bioinformatik-Add-On, Apache Taverna, UGENE und GenoCAD. Um diese Tradition zu pflegen und weitere Möglichkeiten zu schaffen, unterstützt die gemeinnützige Open Bioinformatics Foundation [40] seit 2000 die jährliche Bioinformatics Open Source Conference (BOSC). [41]

Eine alternative Methode zum Erstellen öffentlicher Bioinformatik-Datenbanken ist die Verwendung der MediaWiki-Engine mit dem WikiOpener Verlängerung. Dieses System ermöglicht den Zugriff und die Aktualisierung der Datenbank durch alle Experten auf diesem Gebiet. [42]

Webdienste in der Bioinformatik Bearbeiten

SOAP- und REST-basierte Schnittstellen wurden für eine Vielzahl von Bioinformatikanwendungen entwickelt, die es einer Anwendung, die auf einem Computer in einem Teil der Welt läuft, ermöglichen, Algorithmen, Daten und Rechenressourcen auf Servern in anderen Teilen der Welt zu verwenden. Die Hauptvorteile ergeben sich aus der Tatsache, dass Endbenutzer sich nicht mit dem Verwaltungsaufwand für Software und Datenbanken befassen müssen.

Die grundlegenden bioinformatischen Dienste werden vom EBI in drei Kategorien eingeteilt: SSS (Sequence Search Services), MSA (Multiple Sequence Alignment) und BSA (Biological Sequence Analysis). [43] Die Verfügbarkeit dieser serviceorientierten Bioinformatik-Ressourcen zeigt die Anwendbarkeit webbasierter Bioinformatik-Lösungen und reicht von einer Sammlung eigenständiger Tools mit einem gemeinsamen Datenformat unter einer einzigen, eigenständigen oder webbasierten Schnittstelle bis hin zu integrativen, verteilten und erweiterbare Bioinformatik-Workflow-Management-Systeme.

Bioinformatik-Workflow-Management-Systeme Bearbeiten

Ein Bioinformatik-Workflow-Management-System ist eine spezielle Form eines Workflow-Management-Systems, das speziell entwickelt wurde, um eine Reihe von Rechen- oder Datenmanipulationsschritten oder einen Workflow in einer Bioinformatik-Anwendung zusammenzustellen und auszuführen. Solche Systeme sind darauf ausgelegt,

  • Bereitstellung einer einfach zu bedienenden Umgebung für einzelne Anwendungswissenschaftler, um ihre eigenen Workflows zu erstellen,
  • Bereitstellung interaktiver Tools für die Wissenschaftler, die es ihnen ermöglichen, ihre Arbeitsabläufe auszuführen und ihre Ergebnisse in Echtzeit anzuzeigen,
  • vereinfachen den Prozess der gemeinsamen Nutzung und Wiederverwendung von Arbeitsabläufen zwischen den Wissenschaftlern und
  • ermöglichen es Wissenschaftlern, die Herkunft der Ergebnisse der Workflow-Ausführung und der Workflow-Erstellungsschritte zu verfolgen.

BioCompute und BioCompute-Objekte bearbeiten

Im Jahr 2014 sponserte die US-amerikanische Food and Drug Administration eine Konferenz auf dem Bethesda-Campus der National Institutes of Health, um die Reproduzierbarkeit in der Bioinformatik zu diskutieren. [44] In den nächsten drei Jahren traf sich ein Konsortium von Interessengruppen regelmäßig, um zu diskutieren, was das BioCompute-Paradigma werden würde. [45] Zu diesen Interessengruppen gehörten Vertreter von Regierung, Industrie und akademischen Einrichtungen. Die Sitzungsleiter repräsentierten zahlreiche Zweigstellen der Institute und Zentren der FDA und NIH, gemeinnützige Einrichtungen wie das Human Variome Project und die European Federation for Medical Informatics sowie Forschungseinrichtungen wie Stanford, das New York Genome Center und die George Washington University.

Es wurde beschlossen, dass das BioCompute-Paradigma in Form von digitalen „Labornotizbüchern“ vorliegen sollte, die die Reproduzierbarkeit, Replikation, Überprüfung und Wiederverwendung von Bioinformatik-Protokollen ermöglichen. Dies wurde vorgeschlagen, um eine größere Kontinuität innerhalb einer Forschungsgruppe über den normalen Personalfluss hinweg zu ermöglichen und gleichzeitig den Gedankenaustausch zwischen den Gruppen zu fördern. Die US-amerikanische FDA finanzierte diese Arbeit, damit Informationen über Pipelines transparenter und für das Aufsichtspersonal zugänglich sind. [46]

Im Jahr 2016 traf sich die Gruppe erneut am NIH in Bethesda und diskutierte das Potenzial für ein BioCompute-Objekt, eine Instanz des BioCompute-Paradigmas. Diese Arbeit wurde sowohl als "Standard Trial Use"-Dokument als auch als Preprint-Papier kopiert, das auf bioRxiv hochgeladen wurde. Das BioCompute-Objekt ermöglicht die gemeinsame Nutzung des JSON-basierten Datensatzes zwischen Mitarbeitern, Mitarbeitern und Aufsichtsbehörden. [47] [48]

Zu den Softwareplattformen, die entwickelt wurden, um bioinformatische Konzepte und Methoden zu vermitteln, gehören Rosalind und Online-Kurse, die über das Schulungsportal des Schweizerischen Instituts für Bioinformatik angeboten werden. Die Canadian Bioinformatics Workshops stellen auf ihrer Website unter einer Creative Commons-Lizenz Videos und Folien von Schulungsworkshops zur Verfügung. Das 4273π-Projekt oder 4273pi-Projekt [49] bietet ebenfalls kostenloses Open-Source-Lernmaterial. Der Kurs läuft auf kostengünstigen Raspberry Pi-Computern und wurde verwendet, um Erwachsene und Schüler zu unterrichten.[50] [51] 4273π wird aktiv von einem Konsortium aus Akademikern und Forschern entwickelt, die Bioinformatik auf Forschungsebene mit Raspberry Pi-Computern und dem Betriebssystem 4273π betrieben haben. [52] [53]

MOOC-Plattformen bieten auch Online-Zertifizierungen in Bioinformatik und verwandten Disziplinen, darunter Courseras Bioinformatics Specialization (UC San Diego) und Genomic Data Science Specialization (Johns Hopkins) sowie EdXs Data Analysis for Life Sciences XSeries (Harvard). Die University of Southern California bietet einen Master in Translational Bioinformatics mit Schwerpunkt auf biomedizinischen Anwendungen an.

Es gibt mehrere große Konferenzen, die sich mit Bioinformatik befassen. Einige der bemerkenswertesten Beispiele sind Intelligent Systems for Molecular Biology (ISMB), European Conference on Computational Biology (ECCB) und Research in Computational Molecular Biology (RECOMB).


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