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14.3: Die Biologie der mRNA-Sequenzierung - Biologie


Der erste Schritt bei der mRNA-Sequenzierung besteht darin, die interessierenden Zellen zu lysieren. Nach der Etablierung dieser sequenzierten Reads kann der rechnerische Teil von RNA-Seq in drei Teile unterteilt werden: Read-Mapping, Rekonstruktion und Quantifizierung.


14.3 Grundlagen der DNA-Replikation

Am Ende dieses Abschnitts können Sie Folgendes tun:

  • Erklären Sie, wie die Struktur der DNA den Replikationsprozess aufdeckt
  • Beschreiben Sie die Experimente von Meselson und Stahl

Die Aufklärung der Struktur der Doppelhelix lieferte einen Hinweis darauf, wie sich die DNA teilt und Kopien von sich selbst anfertigt. Watson und Crick schrieben in ihrer Arbeit von 1953 eine unglaubliche Untertreibung: "Unsere Aufmerksamkeit ist nicht entgangen, dass die spezifische Paarung, die wir postuliert haben, sofort einen möglichen Kopiermechanismus für das genetische Material nahelegt." Mit spezifischen Basenpaaren kann die Sequenz eines DNA-Strangs aus seinem Komplement vorhergesagt werden. Das Doppelhelix-Modell legt nahe, dass sich die beiden Stränge der Doppelhelix während der Replikation trennen und jeder Strang als Matrize dient, von dem der neue komplementäre Strang kopiert wird. Was nicht klar war, war, wie die Replikation ablief. Es wurden drei Modelle vorgeschlagen (Abbildung 14.12): konservativ, halbkonservativ und dispersiv.

Bei der konservativen Replikation bleibt die Eltern-DNA zusammen und die neu gebildeten Tochterstränge sind zusammen. Die semikonservative Methode legt nahe, dass jeder der beiden Eltern-DNA-Stränge als Matrize für die nach der Replikation zu synthetisierende neue DNA fungiert, jede doppelsträngige DNA umfasst einen Eltern- oder „alten“ Strang und einen „neuen“ Strang. Im dispersiven Modell weisen beide DNA-Kopien doppelsträngige Segmente der Eltern-DNA und neu synthetisierte DNA eingestreut auf.

Meselson und Stahl waren daran interessiert zu verstehen, wie sich DNA repliziert. Sie wuchsen E coli über mehrere Generationen in einem Medium mit einem „schweren“ Stickstoffisotop ( 15 N), das in stickstoffhaltige Basen und schließlich in die DNA eingebaut wird (Abbildung 14.13).

Die E coli Die Kultur wurde dann in ein Medium mit 14 N gegeben und mehrere Generationen lang wachsen gelassen. Nach jeder der ersten Generationen wurden die Zellen geerntet und die DNA isoliert, dann mit hoher Geschwindigkeit in einer Ultrazentrifuge zentrifugiert. Während der Zentrifugation wurde die DNA in ein Gradient (typischerweise eine Salzlösung wie Cäsiumchlorid oder Saccharose) und bei hohen Geschwindigkeiten von 50.000 bis 60.000 U/min gesponnen. Unter diesen Umständen bildet die DNA eine Bande entsprechend ihrer Auftriebsdichte: die Dichte innerhalb des Gradienten, bei der es schwimmt. DNA, die in 15 N gezüchtet wurde, bildet eine Bande an einer Position mit höherer Dichte (dh weiter unten im Zentrifugenröhrchen) als die in 14 N gezüchtete. Meselson und Stahl stellten fest, dass nach einer Wachstumsgeneration in 14 N, nachdem sie von 15 N, die beobachtete einzelne Bande befand sich in einer Zwischenposition zwischen DNA von Zellen, die ausschließlich in 15 N und 14 N gezüchtet wurden. Dies deutete entweder auf einen semikonservativen oder dispersiven Replikationsmodus hin. Die DNA, die aus Zellen geerntet wurde, die für zwei Generationen in 14 N gezüchtet wurden, bildete zwei Banden: Eine DNA-Bande befand sich in der Zwischenposition zwischen 15 N und 14 N, und die andere entsprach der Bande der 14 N-DNA. Diese Ergebnisse könnten nur erklärt werden, wenn sich die DNA semikonservativ repliziert. Aus diesem Grund wurden die beiden anderen Modelle daher ausgeschlossen.

Während der DNA-Replikation dient jeder der beiden Stränge, aus denen die Doppelhelix besteht, als Vorlage, von der neue Stränge kopiert werden. Die neuen Stränge werden zu den elterlichen oder „alten“ Strängen komplementär sein. Wenn zwei Tochter-DNA-Kopien gebildet werden, haben sie die gleiche Sequenz und werden zu gleichen Teilen auf die beiden Tochterzellen aufgeteilt.


Die aufkommende Biologie posttranskriptionaler RNA-Modifikationen

Es ist seit langem bekannt, dass RNA-Modifikationen für die richtige Funktion von tRNA und rRNA von zentraler Bedeutung sind. Während chemische Modifikationen in der mRNA vor Jahrzehnten entdeckt wurden, blieb ihre Funktion bis vor kurzem weitgehend mysteriös. Unter Verwendung von Anreicherungsstrategien, die mit der Sequenzierung der nächsten Generation gekoppelt sind, wurden nun mehrere Modifikationen auf einer transkriptomweiten Skala in einer Vielzahl von Kontexten kartiert. Heute wissen wir, dass RNA-Modifikationen die Zellbiologie durch viele verschiedene Mechanismen beeinflussen – durch Beeinflussung der RNA-Struktur, durch Abstimmung von Interaktionen innerhalb des Ribosoms und durch Rekrutierung spezifischer Bindungsproteine, die sich mit anderen Signalwegen kreuzen. Sie sind auch dynamisch und ändern sich in ihrer Verteilung oder ihrem Niveau als Reaktion auf Belastungen wie Hitzeschock und Nährstoffmangel. Hier geben wir einen Überblick über aktuelle Themen, die sich aus den erheblichen Fortschritten ergeben haben, die in unserem Verständnis chemischer Modifikationen in vielen wichtigen RNA-Klassen in Eukaryoten erzielt wurden.

Schlüsselwörter: Epitranskriptom-RNA-Modifikation der Genexpression nach der transkriptionellen Regulation der Proteintranslation.

Figuren

Chemische Strukturen von RNA-Modifikationen…

Chemische Strukturen von RNA-Modifikationen, die derzeit in mRNA charakterisiert werden, schematisiert mit ihren berichteten…


Inhalt

Die kurze Existenz eines mRNA-Moleküls beginnt mit der Transkription und endet schließlich im Abbau. Während seines Lebens kann ein mRNA-Molekül auch vor der Translation prozessiert, bearbeitet und transportiert werden. Eukaryotische mRNA-Moleküle erfordern häufig eine umfangreiche Verarbeitung und einen umfangreichen Transport, während prokaryontische mRNA-Moleküle dies nicht tun. Ein Molekül der eukaryotischen mRNA und die es umgebenden Proteine ​​werden zusammen als Boten-RNP bezeichnet.

Transkription

Transkription ist, wenn RNA von DNA kopiert wird. Während der Transkription erstellt die RNA-Polymerase bei Bedarf eine Kopie eines Gens von der DNA in die mRNA. Dieser Prozess unterscheidet sich geringfügig bei Eukaryoten und Prokaryoten. Ein bemerkenswerter Unterschied besteht darin, dass prokaryontische RNA-Polymerase während der Transkription mit DNA-verarbeitenden Enzymen assoziiert, so dass die Verarbeitung während der Transkription ablaufen kann. Dies führt dazu, dass der neue mRNA-Strang doppelsträngig wird, indem ein komplementärer Strang, der als tRNA-Strang bekannt ist, produziert wird, die, wenn sie kombiniert werden, keine Strukturen aus Basenpaarung bilden können. Darüber hinaus ist die Matrize für mRNA der komplementäre Strang der tRNA, der in der Sequenz identisch mit der Anticodon-Sequenz ist, an die die DNA bindet. Als kurzlebiges, unverarbeitetes oder teilweise verarbeitetes Produkt bezeichnet man Vorläufer-mRNA, oder Prä-mRNA einmal vollständig verarbeitet, heißt es reife mRNA.

Eukaryontische Prä-mRNA-Prozessierung

Die Verarbeitung von mRNA unterscheidet sich stark zwischen Eukaryoten, Bakterien und Archaeen. Nicht-eukaryotische mRNA ist im Wesentlichen bei der Transkription reif und erfordert keine Verarbeitung, außer in seltenen Fällen. [2] Die eukaryotische Prä-mRNA erfordert jedoch mehrere Verarbeitungsschritte, bevor sie in das Zytoplasma transportiert und durch das Ribosom transferiert wird.

Spleißen

Die umfangreiche Verarbeitung eukaryontischer Prä-mRNA, die zur reifen mRNA führt, ist das RNA-Spleißen, ein Mechanismus, bei dem Introns oder Outrons (nicht kodierende Regionen) entfernt und Exons (kodierende Regionen) miteinander verbunden werden.

5' Kappenzusatz

EIN 5' Kappe (auch als RNA-Cap, RNA-7-Methylguanosin-Cap oder RNA-m 7 G-Cap bezeichnet) ist ein modifiziertes Guaninnukleotid, das kurz nach Beginn von Transkription. Die 5'-Kappe besteht aus einem terminalen 7-Methylguanosin-Rest, der über eine 5'-5'-Triphosphat-Bindung an das erste transkribierte Nukleotid gebunden ist. Seine Anwesenheit ist entscheidend für die Erkennung durch das Ribosom und den Schutz vor RNasen.

Die Cap-Addition ist an die Transkription gekoppelt und erfolgt co-transkriptionell, so dass sich beide gegenseitig beeinflussen. Kurz nach Beginn der Transkription wird das 5'-Ende der zu synthetisierenden mRNA durch einen mit der RNA-Polymerase assoziierten Cap-Synthesekomplex gebunden. Dieser enzymatische Komplex katalysiert die chemischen Reaktionen, die für das mRNA-Capping erforderlich sind. Die Synthese verläuft als mehrstufige biochemische Reaktion.

Bearbeitung

In einigen Fällen wird eine mRNA bearbeitet, wodurch sich die Nukleotidzusammensetzung dieser mRNA ändert. Ein Beispiel beim Menschen ist die Apolipoprotein B-mRNA, die in einigen Geweben bearbeitet wird, in anderen jedoch nicht. Das Editieren erzeugt ein frühes Stoppcodon, das bei der Translation ein kürzeres Protein produziert.

Polyadenylierung

Polyadenylierung ist die kovalente Bindung einer Polyadenylyl-Einheit an ein Boten-RNA-Molekül. In eukaryotischen Organismen sind die meisten Boten-RNA (mRNA)-Moleküle am 3'-Ende polyadenyliert, aber neuere Studien haben gezeigt, dass auch kurze Uridinabschnitte (Oligouridylierung) üblich sind. [3] Der Poly(A)-Schwanz und das daran gebundene Protein tragen dazu bei, die mRNA vor dem Abbau durch Exonukleasen zu schützen. Die Polyadenylierung ist auch für die Transkriptionstermination, den Export der mRNA aus dem Kern und die Translation wichtig. mRNA kann auch in prokaryotischen Organismen polyadenyliert werden, wobei Poly(A)-Schwänze dazu dienen, den exonukleolytischen Abbau zu erleichtern, anstatt ihn zu behindern.

Polyadenylierung tritt während und/oder unmittelbar nach der Transkription von DNA in RNA auf. Nach Beendigung der Transkription wird die mRNA-Kette durch die Wirkung eines mit der RNA-Polymerase assoziierten Endonuklease-Komplexes gespalten. Nach der Spaltung der mRNA werden am freien 3'-Ende an der Schnittstelle ca. 250 Adenosinreste angefügt. Diese Reaktion wird durch Polyadenylat-Polymerase katalysiert. Genau wie beim alternativen Spleißen kann es mehr als eine Polyadenylierungsvariante einer mRNA geben.

Mutationen an der Polyadenylierungsstelle treten ebenfalls auf. Das primäre RNA-Transkript eines Gens wird an der Poly-A-Additionsstelle gespalten und 100–200 As werden an das 3’-Ende der RNA angefügt. Wenn diese Stelle verändert wird, wird ein abnormal langes und instabiles mRNA-Konstrukt gebildet.

Transport

Ein weiterer Unterschied zwischen Eukaryoten und Prokaryoten ist der mRNA-Transport. Da eukaryotische Transkription und Translation kompartimentär getrennt sind, müssen eukaryotische mRNAs vom Zellkern in das Zytoplasma exportiert werden – ein Prozess, der durch verschiedene Signalwege reguliert werden kann. [4] Reife mRNAs werden an ihren prozessierten Modifikationen erkannt und dann durch die Kernpore exportiert, indem sie an die Cap-bindenden Proteine ​​CBP20 und CBP80 [5] sowie an den Transkriptions/Export-Komplex (TREX) binden. [6] [7] In Eukaryoten wurden mehrere mRNA-Exportwege identifiziert. [8]

In räumlich komplexen Zellen werden einige mRNAs zu bestimmten subzellulären Zielen transportiert. In reifen Neuronen werden bestimmte mRNA vom Soma zu Dendriten transportiert. Eine Stelle der mRNA-Translation befindet sich an Polyribosomen, die selektiv unter Synapsen lokalisiert sind. [9] Die mRNA für Arc/Arg3.1 wird durch synaptische Aktivität induziert und lokalisiert selektiv in der Nähe aktiver Synapsen, basierend auf Signalen, die von NMDA-Rezeptoren erzeugt werden. [10] Andere mRNAs wandern auch als Reaktion auf externe Stimuli in Dendriten, wie z. B. β-Aktin-mRNA. [11] Beim Export aus dem Zellkern assoziiert Aktin-mRNA mit ZBP1 und der 40S-Untereinheit. Der Komplex wird von einem Motorprotein gebunden und entlang des Zytoskeletts zum Zielort (Neuritenverlängerung) transportiert. Schließlich wird ZBP1 von Src phosphoryliert, damit die Translation initiiert werden kann. [12] In sich entwickelnden Neuronen werden mRNAs auch in wachsende Axone und insbesondere Wachstumskegel transportiert. Viele mRNAs sind mit sogenannten „Postleitzahlen“ gekennzeichnet, die ihren Transport an einen bestimmten Ort zielen. [13]

Übersetzung

Da prokaryontische mRNA weder prozessiert noch transportiert werden muss, kann die Translation durch das Ribosom unmittelbar nach dem Ende der Transkription beginnen. Daher kann man sagen, dass die prokaryontische Übersetzung gekoppelt zur Transkription und tritt auf mittranskriptionell.


Verwendung von mRNA zur Entwicklung einer neuen Medikamentenkategorie.

Bei Moderna nutzen wir die grundlegende Rolle, die mRNA bei der Proteinsynthese spielt. Wir haben proprietäre Technologien und Methoden entwickelt, um mRNA-Sequenzen zu erzeugen, die Zellen erkennen, als ob sie vom Körper selbst hergestellt worden wären. Wir konzentrieren uns auf Krankheiten, bei denen es dem Körper ermöglicht wird, ein oder mehrere bestimmte Proteine ​​zu produzieren – oder „anzuschalten“ –, die es dem Körper ermöglichen, eine bestimmte Krankheit zu bekämpfen oder zu verhindern.

  • Wir beginnen mit unserer gewünschten Sequenz für ein Protein.
  • Wir entwerfen und synthetisieren die entsprechende mRNA-Sequenz – den Code, der dieses Protein erzeugt.
  • Vor der Synthese entwickeln wir diese mRNA-Sequenz auch, um die physikalischen Eigenschaften der mRNA sowie des kodierten Proteins zu optimieren.
  • Wir liefern die mRNA-Sequenz über eine von mehreren Modalitäten an die Zellen, die für die Herstellung dieses Proteins verantwortlich sind. Um unterschiedliche Zelltypen zu erreichen, sind unterschiedliche Abgabemethoden erforderlich.
  • Und sobald die mRNA – die Anleitung – in der Zelle ist … übernimmt die Humanbiologie. Ribosomen lesen den Code und bauen das Protein auf, und die Zellen exprimieren das Protein im Körper.

Die Verwendung von mRNA als Medikament eröffnet eine Vielzahl von Möglichkeiten zur Behandlung und Vorbeugung von Krankheiten. mRNA-Medikamente können in Zellen eindringen, um die Proteinproduktion zu steuern, was mit anderen Medikamentenansätzen nicht möglich ist. Wir haben das Potenzial, Krankheiten zu behandeln oder zu verhindern, die heute nicht behandelbar sind – was möglicherweise die menschliche Gesundheit verbessert und das Leben auf der ganzen Welt beeinflusst.

Erfahren Sie mehr über die intrinsischen Eigenschaften von mRNA, wie sie in Zellen im ganzen Körper verwendet wird und die Vielfalt der möglichen Anwendungen für die Verwendung von mRNA zur Entwicklung neuer Medikamente.


Schau das Video: Translation (Januar 2022).